專利名稱：甲型h1n1流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于甲型Hmi流感病毒核酸快速檢測方法 及檢測產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
流行性感冒簡稱流感，是由甲型、乙型、丙型三種流感病毒引起的急性呼吸道傳染 病。其中，甲型流感病毒的宿主最廣、危害最大，人、禽、畜都是甲型流感病毒的宿主。根據(jù) 其表面結(jié)構(gòu)(血凝素H和神經(jīng)氨酸酶N)及其基因特性的不同，甲型流感病毒又可分成許 多亞型，至今甲型流感病毒已發(fā)現(xiàn)的血凝素有16個(gè)亞型(H1-H16)，神經(jīng)氨酸酶有9個(gè)亞型 (N1-N9)。2009年從墨西哥爆發(fā)并蔓延到全球多個(gè)國家的人感染甲型Hmi流感疫情，是由 于一種新變異的甲型Hmi流感病毒引發(fā)的，被世界衛(wèi)生組織稱為“國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi) 生事件”，已達(dá)到了最高的6級警告標(biāo)準(zhǔn)。今年流行的甲型Hmi流感是甲型流感病毒中的一個(gè)亞型，已經(jīng)蔓延到世界許多 國家，不足一個(gè)月，全球確診的甲型Hmi流感病例已突破萬例，我國也出現(xiàn)了多例輸入性 流感病例。給人類生命安全造成了一定危害，包括我國政府在內(nèi)的世界各國都采取了積極 有效的防控措施，以防止疾病的迅速蔓延。面對突然爆發(fā)的流行性疾病，開展對疾病預(yù)防、 診斷、致病機(jī)理以及治療研究是相關(guān)領(lǐng)域關(guān)注和研究的重點(diǎn)。甲型流感病毒是RNA病毒，傳統(tǒng)的基因檢測技術(shù)有Northern雜交、Southern雜交、 Western blotting、PCR等，這些檢測方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且特異性差。在過去的十幾年 中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR已經(jīng)發(fā)展成為一種重要的基因檢測技術(shù)，具有高靈敏度和特異性，但 是需要昂貴的儀器及專業(yè)人員的操作。環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增(loop-mediated isothermal amplication of nucleic acid,簡稱LAMP)技術(shù)利用Bst脫氧核苷酸聚合酶和根據(jù)不同靶序列設(shè)計(jì)的兩對特殊的內(nèi)、 外引物，特異性識別靶序列上的六個(gè)獨(dú)立區(qū)域，啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)。該技術(shù)是在PCR基礎(chǔ) 上創(chuàng)建的一種理想的手段。環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)其特點(diǎn)是①只需一恒定溫度就能擴(kuò) 增反應(yīng)。不需要特殊試劑，不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變性；②高特異性應(yīng)用六個(gè)區(qū)段，四 條引物，并且這六個(gè)區(qū)段的順序也有規(guī)定。原理上LAMP法擴(kuò)增的特異性很高，可以根據(jù)是 否擴(kuò)增判斷目標(biāo)基因的存在與否，即能夠進(jìn)行細(xì)菌或病毒的定性檢測；③快速、高效擴(kuò)增 擴(kuò)增在不到Ih即可完成，且產(chǎn)率高。若在引物上再進(jìn)一步改進(jìn)，可大大提高其擴(kuò)增效率，擴(kuò) 增時(shí)間在原來的基礎(chǔ)上減少；④靈敏度高擴(kuò)增模板可達(dá)10拷貝亦或更少，檢測線性范圍 5個(gè)數(shù)量級；而且，研究人員或檢測人員實(shí)際操作非常簡便。LAMP法是一種簡便、快速、高 度特異性的基因擴(kuò)增法。而且不需要特殊的試劑和儀器設(shè)備，因此可以建立起總成本低廉 的檢測體系。該方法適用于現(xiàn)場檢測和大量樣品高通量檢測，在臨床疾病診斷，基因芯片開 發(fā)及食品衛(wèi)生質(zhì)量檢驗(yàn)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。通過將恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)與PCR技術(shù) (包括熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù))進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測范圍等方法學(xué)指標(biāo)上相當(dāng)于或優(yōu)于PCR技術(shù)，且不依賴任何專門的儀器設(shè)備實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速 檢測，且檢測成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR技術(shù)。近年來興起的DNA納米技術(shù)是以DNA堿基嚴(yán)格互補(bǔ)配對的特性為原理，主要應(yīng)用 于分子的組裝，產(chǎn)生有功能的組裝聚集物。DNA納米技術(shù)包括基因芯片之外，還有一種是 將DNA結(jié)合到納米顆粒上構(gòu)成納米顆?；蛱结?，通過與靶DNA之間的互補(bǔ)實(shí)現(xiàn)納米顆粒 的組裝，這已成為一種新型的DNA檢測系統(tǒng)。Mirkin等運(yùn)用金納米顆?；蛱结樑c合成 靶雜交，形成透射電鏡下明顯的聚集體，可判斷合成靶存在與否(Chad A. Mirkin, R. L. L.， Robert C. Mucic &James J. Storhoff Nature 1996，382，607-609)。Wang 等制備金納米顆 粒乙型肝炎病毒(HBV) DNA基因探針，在玻片上目視化檢測HBV DNA的多聚酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物 (Wang YF, Pang Dff, Zhang ZL, et al. Visual gene diagnosis of HBV andHCV based on nanoparticle ρ robe amp lification and silver staining enhancement. J Med Virol, 2003,70 :2052211)。習(xí)東等應(yīng)用!^304 (核)/Au (殼)納米顆粒HBVDNA基因探針，通過尼龍 膜上斑點(diǎn)雜交或液相中雜交研究其在檢測HBV DNA中的應(yīng)用(Dong Xia,X. L. ,Qin Ninga, Qianghua Lud, Kailun Yao, Zuli LiudJournal of Nanjing Medical University 2007, 21,207-212)。但上述檢測技術(shù)都存在各自的缺點(diǎn)，如Mirkin的技術(shù)需要復(fù)雜昂貴的透射 電鏡，Wang需要昂貴的進(jìn)口玻片，且需要長時(shí)間的預(yù)雜交、雜交洗滌過程，習(xí)東的檢測時(shí)需 要長時(shí)間的復(fù)雜的預(yù)雜交、雜交、洗膜銀染過程，沒有技術(shù)優(yōu)點(diǎn)耗時(shí)費(fèi)力，且都處于試驗(yàn)研 究階段，沒有產(chǎn)品化。所以仍然需要尋找快速、靈敏、低成本、操作簡易的核酸檢測工具。為配合這一研 究，研究了能迅速準(zhǔn)確檢測甲型Hmi流感病毒的核酸納米金生物傳感器的檢測方法及開 發(fā)了其試劑盒，對于早期大規(guī)模篩查及有效地控制疾病的迅速傳播具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有甲型Hmi流感病毒檢測技術(shù)及產(chǎn)品存在的問題和不 足，提供一種用于快速檢測甲型Hmi流感病毒(2009年流行的新變種)的方法以及試劑
品.O本發(fā)明所述的一種采用環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)對甲型Hmi流感病毒進(jìn)行檢測 的方法，包括以下步驟1)病毒RNA的提取a)從已滅活的病毒培養(yǎng)液中取200-400 μ 1病毒樣本加入0. 5ml Trizol，反復(fù)震 蕩，抽吸以利于病毒裂解，20-37°C下孵化5分鐘；b)在病毒裂解液中加入0. Iml的氯仿并震蕩至乳糜化，20-37°C下孵化10分鐘， 40C 12000rpm下離心15分鐘，取上清液；c)在上清液中加入0. Iml的異丙醇，20-37°C下孵化10分鐘，4°C 12000rpm下離心
15分鐘，去掉上清液，使沉淀干燥；d)加入0. 5ml的75%乙醇洗滌沉淀，4°C 7500rpm下離心5分鐘，除盡上清液，使 沉淀干燥，該沉淀為病毒樣本的RNA ；e)用焦碳酸二乙酯水20 μ 1溶解RNA沉淀，RNA溶液于_80°C下保存；2)逆轉(zhuǎn)錄及LAMP擴(kuò)增
采用的逆轉(zhuǎn)錄及環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增的反應(yīng)體系，包括10倍環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸緩 沖液、dNTP溶液、RNA酶抑制劑、鎂離子、Bst酶、反轉(zhuǎn)錄酶、上游外引物和下游外引物、上游 內(nèi)引物和下游內(nèi)引物，以及病毒樣品RNA ；其中，環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)的上游外引物含 有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)的上游內(nèi)引物含有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)的下游外引物含有如SEQ ID NO. 3所 示的核苷酸序列，環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)的下游內(nèi)引物含有如SEQ ID NO. 4所示的核苷 酸序列；環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增的反應(yīng)程序63°C水浴60分鐘；3)單鏈化所得的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物a)向2)所得的反應(yīng)產(chǎn)物中加入1 μ 1濃度為8U/μ 1的限制性內(nèi)切酶TspR I，并 在63°C條件下水浴2小時(shí)；b)將a)所得產(chǎn)物在98°C條件下水浴5分鐘后，迅速置于冰上10分鐘；4)采用核酸納米金生物傳感器對經(jīng)單鏈化處理的環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增的反應(yīng)產(chǎn) 物的檢測及結(jié)果分析所述的核酸納米金生物傳感器，包括從左到右依次固定于膠板上的樣品墊、玻璃 纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙；所述玻璃纖維上涂有納米金標(biāo)記寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是由巰基修飾并 與膠體金偶聯(lián)形成的，該寡核苷酸探針包含如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列；所述硝酸纖維素膜上固定有兩種寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是用生物素標(biāo)記 并與鏈霉親和素偶聯(lián)形成的；固定于靠近吸水紙一端的寡核苷酸探針形成質(zhì)控線，該寡核 苷酸探針包含如SEQ ID N0. 6所示的核苷酸序列；固定于靠近玻璃纖維一端的寡核苷酸探 針形成檢測線，該寡核苷酸探針包含如SEQ IDN0. 7所示的核苷酸序列；將步驟3所得的經(jīng)單鏈化處理的環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增的反應(yīng)產(chǎn)物分別滴加入所 述的甲型Hmi核酸納米金生物傳感器的加樣孔中，觀察檢測線和質(zhì)控線的情況進(jìn)行結(jié)果 分析檢測線和質(zhì)控線同時(shí)出現(xiàn)紅色，表明被檢樣品為陽性；質(zhì)控線出現(xiàn)紅色，而檢測線未 出現(xiàn)紅色，表明被檢樣品為陰性。根據(jù)本發(fā)明所述的檢測方法，所述的核酸納米金生物傳感器中，質(zhì)控線與檢測線 相距3-10mm ；所述固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙的相鄰部分 彼此重疊l_5mm ；所述膠體金的粒徑為8-lOOnm。本發(fā)明所述的一種用于檢測甲型Him流感病毒的試劑盒，其包括環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑，其包含10倍LAMP緩沖液、鎂離子、酶混合液、RNA 酶抑制劑、上游外引物、上游內(nèi)引物、下游外引物、下游內(nèi)引物；其中，上游外引物含有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，上游內(nèi)引物含有如SEQ ID N0. 2所示的核苷酸序列，下游外引 物含有如SEQ ID N0. 3所示的核苷酸序列，下游內(nèi)引物含有如SEQ ID N0. 4所示的核苷酸 序列；所述酶混合液是由Bst酶8U/μ 1和逆轉(zhuǎn)錄酶5U/μ 1以體積比1 1混合組成；以及 核酸納米金生物傳感器。所述的核酸納米金生物傳感器，包括從左到右依次固定于膠板上 的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙；所述玻璃纖維上涂有納米金標(biāo)記寡核苷酸探 針，該寡核苷酸探針是由巰基修飾并與膠體金偶聯(lián)形成的，該寡核苷酸探針包含如SEQ ID Ν0. 5所示的核苷酸序列；所述硝酸纖維素膜上固定有兩種寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是用生物素標(biāo)記并與鏈霉親和素偶聯(lián)形成的；固定于靠近吸水紙一端的寡核苷酸探針形成 質(zhì)控線，該寡核苷酸探針包含如SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列；固定于靠近玻璃纖維一端 的寡核苷酸探針形成檢測線，該寡核苷酸探針包含如SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明所述的試劑盒，所述用于環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)的外引物與內(nèi)引物 之間的濃度比為1 1 1 10，優(yōu)選為1 4。在該濃度比下，由外引物引導(dǎo)的起步擴(kuò)增 過程能夠有效的促進(jìn)由內(nèi)引物引導(dǎo)的具有重復(fù)擴(kuò)增區(qū)段結(jié)構(gòu)的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的生成；同時(shí) 在該濃度比條件下，引物二聚體的產(chǎn)生能夠得到有效抑制，從而使LAMP擴(kuò)增反應(yīng)效率達(dá)到 最大。根據(jù)本發(fā)明所述的試劑盒，所述用于環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)的上游內(nèi)引物和下 游內(nèi)引物的序列中都含有一段9nt限制性內(nèi)切酶TspR I酶切位點(diǎn)序列，其中，上游內(nèi)引物 中的酶切位點(diǎn)序列是5-GACACTGGA-3，下游內(nèi)引物中的酶切位點(diǎn)序列是5-GACACTGTC-3。在 LAMP的擴(kuò)增過程中，酶切位點(diǎn)序列被引入到擴(kuò)增產(chǎn)物中。LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切消化后，其 重復(fù)結(jié)構(gòu)的長鏈將被切割成長度為140bp左右的產(chǎn)物。單鏈化處理該產(chǎn)物所得的寡聚核苷 酸鏈能夠有效地與生物傳感器中的探針發(fā)生配對反應(yīng)，從而達(dá)到檢測的目標(biāo)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明將表面合成化學(xué)、生物化學(xué)及物理化學(xué)有機(jī)結(jié)合起來， 解決目視化基因檢測技術(shù)設(shè)計(jì)與制造中的關(guān)鍵技術(shù)，利用一對經(jīng)特殊設(shè)計(jì)的LAMP內(nèi)引物 通過LAMP擴(kuò)增過程將一段酶切位點(diǎn)序列引入到擴(kuò)增產(chǎn)物中，然后使用限制性內(nèi)切酶TspR I消化擴(kuò)增產(chǎn)物并通過物理驟冷的辦法獲得大量長度為140bp左右的單鏈DNA產(chǎn)物，由于采 用了環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增(LAMP)技術(shù)并結(jié)合核酸納米金生物傳感器，使得所述的檢測方 法和試劑盒特異性高、檢測迅速。病毒RNA只需要在恒溫條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和LAMP擴(kuò)增后， 即可獲得大量的目標(biāo)DNA，整個(gè)擴(kuò)增過程僅需1小時(shí)。將上述產(chǎn)物經(jīng)單鏈化處理后滴于納米 金生物傳感器的加樣孔中，約10分鐘后即可通過觀察檢測線及質(zhì)控線來判斷結(jié)果，不需要 專業(yè)的技術(shù)人員及昂貴的儀器設(shè)備，配合使用商用RNA提取試劑盒，本發(fā)明可以滿足基層 及時(shí)、戶外、迅速的甲型流感病毒(2009流行)檢測要求。


圖1顯示納米金生物傳感器檢測樣品的結(jié)果，自左至右分別為A/ws/33 (HlNl)樣 品、A/hongkong/8/68(H3N2)樣品、A/P2/8/34 (HlNl)樣品、B 型、甲型 HlNl 流感病毒樣品。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一針對甲型Hmi流感病毒的LAMP引物及探針的設(shè)計(jì)在NCBI http://www. ncbi. nlm. nih. gov/genomes/FLU/Database/request, cgi中 查找出所有甲型流感病毒的PA基因片段序列，通過多重比對找出甲型流感病毒的保守區(qū) 段。采用I^rimerExplorer在其保守片段上設(shè)計(jì)引物和探針。通過對甲型Hmi (2009流行)的PA基因片段序列，采用ft·imerExpIorer設(shè)計(jì)引 物和探針。將所設(shè)計(jì)的引物與探針與所有病毒序列進(jìn)行比對，找出變異性最強(qiáng)的引物和探 針。上述甲型Hmi (2009年流行)的全長PA基因序列來源于NCBI (> gi | 238914637 gbIGQ244322. 11 Influenza A virus(A/Guangdong/05/2009(HlNl)) segment 3 polymerasePA(PA) gene, completecds)設(shè)計(jì)結(jié)果為甲型Hmi流感病毒的引物和特異性探針上游外引物TACAGCAGAAGTGTCCCASEQ ID NO. 1下游外引物CCTTCCTTTTATAATGAACCCASEQ ID NO. 3上游內(nèi)引物SEQID NO. 2CACAGGATGCATTGAGCAAGGGACACTGGAGCTACTGAA TACATAATGAAGGGA下游內(nèi)引物SEQID NO. 4GGATGACTTTCAGCTGATCCCAGACACTGTCTACAGGTTT GTTTTCCGTCTT探針1 :5-ThioMC6-D-TGGTCCTACATTTGCTTATCAT SEQ ID NO. 5探針2 Biοtin-5-AAAAAAAAAAATGATAAGCAAATGTAGGACCA SEQ ID N0. 6探針3 :TTTTTTTTTTTCATCAATCAATCTTTTTCACTTT-3-Biotin SEQ ID NO. 7引物、探針及模板DNA三者之間的關(guān)系為探針1位于上下游引物之間與所測樣品 中模板DNA特異性互補(bǔ)，探針3覆蓋上下游引物之間的部分序列，探針1與探針2特異性互 補(bǔ)。實(shí)施例二本發(fā)明所述的用于檢測甲型流感病毒的核酸納米金生物傳感器的制備1.納米金(膠體金)的制備在500ML的圓底燒瓶中加入100ml 0. 01 %的HAuCL4溶液，邊攪拌邊加熱至沸騰； 向上述溶液中加入anl 檸檬酸鈉，溶液20s內(nèi)變?yōu)樗{(lán)色，60s后變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)煮沸 lOmin，停止加熱繼續(xù)攪拌15min ；膠體金溶液4°C避光保存，納米金通過520nm最大吸光度
值鑒定。2.金標(biāo)寡核苷酸探針的制備用100 μ 1去離子水溶解10D DNA-探針1，加入到5 倍體積濃縮的膠體金溶液中，4°C 24小時(shí)；10%的牛血清白蛋白封閉30分鐘后，加入NaCl 和1 %的SDS，分別至終濃度0. IM和0. 01 %，4°C過夜，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，棄上清， 沉淀用100μ 1含20mM Na3PO4, 5% BSA, 0. 25% TweenJP 10%蔗糖重新懸浮，制成懸浮液。3.金標(biāo)墊的制備將本發(fā)明制備的金標(biāo)寡核苷酸探針涂于玻璃纖維上，37°C干燥2個(gè)小時(shí)，制成金 標(biāo)墊，備用。4.生物素標(biāo)記探針與鏈霉親和素的偶聯(lián)及偶聯(lián)物的固定鏈霉親和素可以與生物素通過親水鍵和范德華力相結(jié)合并形成穩(wěn)定且難斷裂的 鍵，因此本發(fā)明采用生物素標(biāo)記的DNA探針與鏈霉親和素混合反應(yīng)，采用劃膜噴金儀涂于 硝酸纖維素膜上。例如，用10 μ 1去離子水溶解10D生物素標(biāo)記的DNA-探針2，加入5 μ 1 (2mg/ml) 鏈和親霉素，室溫下反應(yīng)1小時(shí)后，采用劃膜噴金儀涂于硝酸纖維素膜檢測線上，37°C干燥 兩個(gè)小時(shí)。DNA-探針3采用同樣方法固定于質(zhì)控線上。5.樣品墊的處理玻璃纖維浸泡在雜交液(0.16% TritonX-100,0. 2M Tris,0. 2M 氯化鈉，pH 8. 0) 中4個(gè)小時(shí)后，37 °C烘干備用。
6.核酸納米金生物傳感器的組裝將固定有寡核苷酸探針的硝酸纖維素膜、吸水紙、涂有納米微粒標(biāo)記寡核苷酸探 針的玻璃纖維、樣品墊依次固定于膠板上，相鄰部分彼此重疊2mm，經(jīng)切割成寬4mm后即得 到本發(fā)明所述的核酸納米金生物傳感器。實(shí)施例三本發(fā)明所述的用于檢測甲型Hmi流感病毒核酸納米金生物傳感器的 試劑盒的制備及檢測方法甲型Hmi流感病毒核酸納米金生物傳感器的試劑盒包括如下成分LAMP反應(yīng)試劑，甲型Hmi流感病毒核酸納米金生物傳感器；其中所述的LAMP反應(yīng)試劑包括10倍RT-PCR緩沖液150 μ l、dNTP溶液150 μ 1、鎂 離子150 μ 1、酶混合液60 μ 1、RNA酶抑制劑30 μ 1、上游外引物30 μ 1、下游外引物30 μ 1、 上游內(nèi)引物30μ1、下游內(nèi)引物30μ1 ；其中，上游外引物含有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸 序列，下游外引物含有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列，上游內(nèi)引物含有如SEQ ID NO. 2 所示的核苷酸序列，下游內(nèi)引物含有如SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列；所述酶混合液是由Bst酶8U/ μ 1和逆轉(zhuǎn)錄酶5U/ μ 1以體積比1 1混合組成。檢測甲型Hmi流感病毒LAMP反應(yīng)液的配制試劑使用量μ IOX 緩沖液5dNTP 混合液(IOmM) 2MgC12(50mM)2RNA酶抑制劑1酶混合液2上游外引物(10 μ Μ)1下游外引物(10 μ Μ)1上游內(nèi)引物(10 μ Μ)4下游內(nèi)引物(10 μ Μ)4RNA 提取液4DEPC 7jC6總體積50 μ 1確立如下的反應(yīng)條件63°C水浴60分鐘。反應(yīng)結(jié)束后將上述檢測甲型Hmi流感病毒的LAMP產(chǎn)物中加入1 μ 1濃度為8U/ μ 1的限制性內(nèi)切酶TspR I，置于63°C水浴2小時(shí)；水浴結(jié)束后將酶切反應(yīng)產(chǎn)物98°C水浴 5分鐘后迅速置于冰上10分鐘。最后將經(jīng)過如上單鏈化處理所得的產(chǎn)物滴于甲型Hmi流 感病毒核酸納米金生物傳感器的加樣孔中，約10分鐘即可進(jìn)行結(jié)果判斷。實(shí)施例四本發(fā)明所述的檢測甲型流感病毒的方法的實(shí)驗(yàn)1、毒株及其來源A/ws/33 (HlNl), A/hongkong/8/68 (H3N2)由中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院提 供；A/PR/8/34(HlNl)，B型為臨床分離毒株由廣州呼吸疾病研究所提供；甲型Hmi由美國 疾病控制及預(yù)防中心(⑶C)提供。以上毒株信息可通過http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/ genomes/FLU/Database/select, cgi ？ go = 1 查找。
2、病毒RNA提取a) 200-400 μ 1樣本加入0.5ml Trizol (咽拭子來源或病毒培養(yǎng)液)，反復(fù)震蕩，抽 吸以利于細(xì)胞裂解，室溫下孵化5分鐘。b)加入0. Iml的氯仿并震蕩至乳糜化，室溫下孵化10分鐘，4°C 12000rpm下離心 15分鐘，取上清液，轉(zhuǎn)移至另一 1.5ml EP管。c)加入0. Iml的異丙醇，室溫下孵化10分鐘，4°C 12000rpm下離心15分鐘，去掉
上清液，將管倒置在吸水紙上，稍微風(fēng)干。d)加入0. 5ml的75%乙醇(DEPC處理的水配制)洗滌RNA，4°C 7500rpm下離心5 分鐘，倒置于吸水紙上，除去上清液后室溫下靜置5分鐘。e)用DEPC (焦碳酸二乙酯)水2Oul溶解RNA。f)測定 RNA 濃度及 A^O/A^O。3、逆轉(zhuǎn)錄及LAMP擴(kuò)增1)取出試劑盒(見實(shí)施例三)，于4°C解凍，各試劑于用前1000轉(zhuǎn)/分鐘低速離心 1分鐘待用。2)按下列組份配制LAMP反應(yīng)液(反應(yīng)液配制應(yīng)在冰上進(jìn)行)。檢測甲型流感病
毒LAMP反應(yīng)液的配制試劑使用量μ 1IOX 緩沖液5dNTP 混合液(IOmM)2MgC12(50mM)2RNA酶抑制劑1酶混合液2上游外引物(10 μ Μ)1下游外引物(10 μ Μ)1上游內(nèi)引物(10 μ Μ)4下游內(nèi)引物(10 μ Μ)4RNA 提取液4DEPC 水6總體積50 μ 13) LAMP反應(yīng)水浴程序設(shè)置63 °C 水浴 60 分鐘。4.檢測及結(jié)果判定將上述LAMP產(chǎn)物中加入1μ 1濃度為8U/μ 1的限制性內(nèi)切酶T1SpR I，置于63°C 水浴2小時(shí)；水浴結(jié)束后將酶切反應(yīng)產(chǎn)物98°C水浴5分鐘后迅速置于冰上10分鐘。最后將 經(jīng)過如上單鏈化處理所得的產(chǎn)物滴于納米金生物傳感器的樣品墊上，約10分鐘通過觀察T 線和C線的出現(xiàn)情況即可判斷結(jié)果。質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)1)C線(質(zhì)控線)出現(xiàn)紅色的線證明納米金生物傳感器有效。2)T線(檢測線)出現(xiàn)紅色的線與否，是陽性陰性判別的標(biāo)準(zhǔn)。
結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)1)C線出現(xiàn)紅色的線，同時(shí)T線出現(xiàn)紅色的線，說明被檢樣品為陽性；2)C線出現(xiàn)紅色的線，同時(shí)T線沒有出現(xiàn)紅色的線，說明被檢樣品為陰性3)C線沒有出現(xiàn)紅色的線，說明納米生物傳感器失效。A/ws/33 (HlNl)，A/hongkong/8/68 (H3N2)、A/PR/8/34 (HlNl)、B 型流感病毒，經(jīng)核 酸納米金生物傳感器檢測只有c線出現(xiàn)紅色的線而τ線沒有出現(xiàn)紅色的線；甲型Hmi流感 病毒經(jīng)甲型Hmi核酸納米金生物傳感器檢測τ線、c線均出現(xiàn)紅色的線(圖1)。試驗(yàn)結(jié)果 均符合預(yù)期期望。根據(jù)上述檢測方法，可以設(shè)計(jì)出相應(yīng)的檢測試劑盒。該用于檢測甲型Hmi流感病毒的試劑盒包括環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑，其 包含10倍LAMP緩沖液、鎂離子、酶混合液、RNA酶抑制劑、上游外引物、上游內(nèi)引物、下游外 引物、下游內(nèi)引物；其中，上游外引物含有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，上游內(nèi)引物含 有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，下游外引物含有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列， 下游內(nèi)引物含有如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列；所述酶混合液是由Bst酶8U/μ 1和逆 轉(zhuǎn)錄酶5υ/μ 1以體積比1 1混合組成；以及核酸納米金生物傳感器。該試劑盒中，用于環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)的外引物與內(nèi)引物之間的濃度比為 1 1 1 10，優(yōu)選為1 4。優(yōu)選地，所述用于環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)的上游內(nèi)引物和下游內(nèi)引物的序列中 都含有一段9nt限制性內(nèi)切酶TspR I酶切位點(diǎn)序列，其中，上游內(nèi)引物中的酶切位點(diǎn)序列 是5-GACACTGGA-3，下游內(nèi)引物中的酶切位點(diǎn)序列是5-GACACTGTC-3。序列表(SEQUENCELISTING)<110>中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院<120>甲型Hmi流感病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法及試劑盒<130><160>7<170>PatentIn version 3.4<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1tacagcagaa gtgtccca18<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2ccttcctttt ataatgaacc ca 22<210>3
<211>54<212>DNA<213>人工序列<400>3cacaggatgc attgagcaag ggacactgga gctactgaat acataatgaa ggga 54<210>4<211>52<212>DNA<213>人工序列<400>4ggatgacttt cagctgatcc cagacactgt ctacaggttt gttttccgtc tt52<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>5tggtcctaca tttgcttatc at22<210>6<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>6gaggggggag gtgataagca aatgtaggac ca32<210>7<211>34<212>DNA<213>人工序列<400>7tttttttttt tcatcaatca atctttttca cttt 3權(quán)利要求
1. 一種采用環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)對甲型Hmi流感病毒進(jìn)行檢測的方法，其特征 在于，包括以下步驟1)病毒RNA的提取a)從已滅活的病毒培養(yǎng)液中取200-400μ 1病毒樣本加入0. 5ml Trizol，反復(fù)震蕩，抽 吸以利于病毒裂解，20-37°C下孵化5分鐘；b)在病毒裂解液中加入0.Iml的氯仿并震蕩至乳糜化，20-37 °C下孵化10分鐘， 40C 12000rpm下離心15分鐘，取上清液；c)在上清液中加入0.Iml的異丙醇，20-37°C下孵化10分鐘，4°C 12000rpm下離心15 分鐘，去掉上清液，使沉淀干燥；d)加入0.5ml的75%乙醇洗滌沉淀，4°C 7500rpm下離心5分鐘，除盡上清液，使沉淀 干燥，該沉淀為病毒樣本的RNA ；e)用焦碳酸二乙酯水20μ 1溶解RNA沉淀，RNA溶液于_80°C下保存；2)逆轉(zhuǎn)錄及環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增采用的逆轉(zhuǎn)錄及環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增的反應(yīng)體系，包括10倍環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸緩沖 液、dNTP溶液、RNA酶抑制劑、鎂離子、Bst酶、反轉(zhuǎn)錄酶、上游外引物和下游外引物、上游內(nèi) 引物和下游內(nèi)引物，以及病毒樣品RNA ；其中，環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)的上游外引物含有 如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)的上游內(nèi)引物含有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)的下游外引物含有如SEQ ID NO. 3所示 的核苷酸序列，環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)的下游內(nèi)引物含有如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸 序列；環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增的反應(yīng)程序63°C水浴60分鐘；3)單鏈化所得的環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸反應(yīng)產(chǎn)物a)向2)所得的反應(yīng)產(chǎn)物中加入1μ 1濃度為SU/μΙ的限制性內(nèi)切酶TspR I，并在63°C 條件下水浴2小時(shí)；b)將a)所得產(chǎn)物在98°C條件下水浴5分鐘后，迅速置于冰上10分鐘；4)采用核酸納米金生物傳感器對經(jīng)單鏈化處理的環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增的反應(yīng)產(chǎn)物的 檢測及結(jié)果分析所述的核酸納米金生物傳感器，包括從左到右依次固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、 硝酸纖維素膜和吸水紙；所述玻璃纖維上涂有納米金標(biāo)記寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是由巰基修飾并與膠 體金偶聯(lián)形成的，該寡核苷酸探針包含如SEQ ID N0. 5所示的核苷酸序列；所述硝酸纖維素膜上固定有兩種寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是用生物素標(biāo)記并與 鏈霉親和素偶聯(lián)形成的；固定于靠近吸水紙一端的寡核苷酸探針形成質(zhì)控線，該寡核苷酸 探針包含如SEQ ID N0. 6所示的核苷酸序列；固定于靠近玻璃纖維一端的寡核苷酸探針形 成檢測線，該寡核苷酸探針包含如SEQ IDN0. 7所示的核苷酸序列；將步驟3所得的經(jīng)單鏈化處理的環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增的反應(yīng)產(chǎn)物分別滴加入所述的 甲型Hmi核酸納米金生物傳感器的加樣孔中，觀察檢測線和質(zhì)控線的情況進(jìn)行結(jié)果分析 檢測線和質(zhì)控線同時(shí)出現(xiàn)紅色，表明被檢樣品為陽性；質(zhì)控線出現(xiàn)紅色，而檢測線未出現(xiàn)紅 色，表明被檢樣品為陰性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述的核酸納米金生物傳感器中，質(zhì) 控線與檢測線相距3-10mm ；所述固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水 紙的相鄰部分彼此重疊l_5mm ；所述膠體金的粒徑為8-lOOnm。
3.一種用于檢測甲型Hmi流感病毒的試劑盒，其特征在于，包括環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑，其包含10倍環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸緩沖液、鎂離子、酶混合液、限制性內(nèi)切酶TspRI、RNA酶抑制劑、 上游外引物、上游內(nèi)引物、下游外引物、下游內(nèi)引物；其中，上游外引物含有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，上游內(nèi)引物含有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，下游外引物含有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列，下游內(nèi)引物 含有如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列；所述酶混合液是由Bst酶8U/ μ 1和逆轉(zhuǎn)錄酶5U/ μ 以體積比1 1混合組成；以及核酸納米金生物傳感器；所述的核酸納米金生物傳感器，包括從左到右依次固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、 硝酸纖維素膜和吸水紙；所述玻璃纖維上涂有納米金標(biāo)記寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是由巰基修飾并與膠 體金偶聯(lián)形成的，該寡核苷酸探針包含如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列；所述硝酸纖維素膜上固定有兩種寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是用生物素標(biāo)記并與 鏈霉親和素偶聯(lián)形成的；固定于靠近吸水紙一端的寡核苷酸探針形成質(zhì)控線，該寡核苷酸 探針包含如SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列；固定于靠近玻璃纖維一端的寡核苷酸探針形 成檢測線，該寡核苷酸探針包含如SEQ IDN0. 7所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述用于環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)的 外引物與內(nèi)引物之間的濃度比為1 1 1 10。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述用于環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)的 外引物與內(nèi)引物之間的濃度比為1 4。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述用于環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)的 上游內(nèi)引物和下游內(nèi)引物的序列中都含有一段9nt限制性內(nèi)切酶TspR I酶切位點(diǎn)序列， 其中，上游內(nèi)引物中的酶切位點(diǎn)序列是5-GACACTGGA-3，下游內(nèi)引物中的酶切位點(diǎn)序列是 5-GACACTGTC-3。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種采用環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增(LAMP)技術(shù)對甲型H1N1流感病毒進(jìn)行檢測的方法。該檢測方法包括病毒RNA提??；逆轉(zhuǎn)錄及LAMP擴(kuò)增；LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈化；采用核酸納米金生物傳感器對LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測。本發(fā)明還提供了用于檢測甲型H1N1流感病毒的試劑盒。本發(fā)明利用經(jīng)特殊設(shè)計(jì)的LAMP內(nèi)引物通過LAMP擴(kuò)增過程將一段酶切位點(diǎn)序列引入到擴(kuò)增產(chǎn)物中，然后使用限制性內(nèi)切酶TspR I消化擴(kuò)增產(chǎn)物并通過物理驟冷的辦法獲得大量長度為140bp左右的單鏈DNA產(chǎn)物，由于采用了特定引物的環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)并結(jié)合含有特定探針的核酸納米金生物傳感器，使得所述的檢測方法和試劑盒特異性高、檢測迅速。
文檔編號C12R1/93GK102108418SQ20091021416
公開日2011年6月29日 申請日期2009年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月25日
發(fā)明者劉杰, 曾令文, 趙昌路, 頓博影 申請人:中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院