專利名稱：Dna序列在乳品業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一條DNA序列在乳品業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乳品行業(yè)中需要用到乳糖酶(又稱β _半乳糖苷酶)來將乳糖水解為易吸收和甜味品質(zhì)好的半乳糖和葡萄糖，并且在水解糖過程中還可以發(fā)生轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)，生成具有多種 生理功能的低聚半乳糖?，F(xiàn)在用于乳品行業(yè)的乳糖酶雖然有多種，但是這些酶均為中溫或高溫β -半乳糖 苷酶，反應(yīng)溫度高，低溫下酶活低，不利于保留牛奶中的營養(yǎng)物質(zhì)和風(fēng)味物質(zhì)，難以滿足生 產(chǎn)綠色有機(jī)乳制品的要求，因此尋找在低溫下還能保持較高乳糖水解酶活性的新酶是當(dāng)今 乳品業(yè)發(fā)展的迫切需要。尋找在低溫下還能保持較高乳糖水解酶活性的新酶，具有如下優(yōu)點低溫下進(jìn)行 反應(yīng)，可節(jié)省大量能源，最大限度地保留乳品中的營養(yǎng)和風(fēng)味物質(zhì)，而且也減少了染菌的可 能，此外，低溫下能夠保持較高乳糖分解酶活性的酶很容易通過加熱失活，有助于乳品的某 些后處理工序。一種適于食品工業(yè)乳品處理的理想的低溫乳糖分解酶應(yīng)具有以下優(yōu)點在低溫情 況下酶活高，最適PH接近天然牛奶的ρΗ值(ρΗ 6. 7 6. 8)，酶活不被牛奶中的鈉離子、鈣 離子等抑制，以乳糖為底物時的酶活高。目前雖然已有許多不同來源的低溫半乳糖苷 酶基因被克隆，但這些低溫β “半乳糖苷酶大多數(shù)僅在25 50°C、堿性條件下表現(xiàn)出最大 酶活，而在低溫和中性PH條件下酶活很低。目前市面上應(yīng)用最廣的商品化的半乳糖苷酶(來自克魯維乳酸酵母)，其最適 溫度為50°C，在20°C時的酶活非常低，酶學(xué)特性也不理想。僅有幾種β-半乳糖苷酶在低 溫和中性條件下酶活較好，然而這些酶卻由于表達(dá)量不佳或重組酶蛋白的可溶性不好等原 因，也難以規(guī)?；a(chǎn)。因此迄今國內(nèi)外尚未有很理想的在低溫下可保持較高乳糖分解酶 活性的低溫半乳糖苷酶進(jìn)入規(guī)?；a(chǎn)。宏基因組學(xué)是指直接提取環(huán)境中所有微生物的基因組DNA，克隆到合適的載體，構(gòu) 建宏基因組文庫，將環(huán)境中全部微生物的核酸信息收集在一起，并運(yùn)用序列篩選或功能篩 選方式從文庫中獲得有用的酶、抗生素、活性物質(zhì)等。宏基因組學(xué)完全不依賴于環(huán)境中微生 物的分離和培養(yǎng)，為從不同自然生境中的未培養(yǎng)微生物中尋找新的基因資源和活性物質(zhì)提 供了有力的技術(shù)手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一條DNA序列在乳品業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng) 用，該DNA序列表達(dá)的重組蛋白能在30°C以下保持較高的、穩(wěn)定的乳糖分解活性，且該蛋白 具有高可溶性特性表達(dá)。本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實現(xiàn)的
本發(fā)明人采用宏基因組技術(shù)，從土壤宏基因組文庫中分離得到多條新的DNA序列，通過對這些序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的研究，發(fā)現(xiàn)其中一條DNA序列表達(dá)的重組蛋白 具有低溫下依然保持較高乳糖分解活性以及高可溶性表達(dá)等特點，可用于乳品業(yè)中，滿足 低溫下進(jìn)行乳糖分解作用的需求。上述DNA序列已經(jīng)登錄于GenBank，其GenBank登錄號為GQ274002，其核苷酸序列 如SEQ ID NO :1所示，該核苷酸序列編碼的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO :3所示，本發(fā) 明人將SEQ ID NO :1所示DNA序列克隆到原核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過 誘導(dǎo)表達(dá)得到重組蛋白，然后對該重組蛋白進(jìn)行特性研究，研究結(jié)果如下所示該重組蛋白高度可溶，無包涵體形成。該重組蛋白的分子量為76kD，等電點為3. 9。該重組蛋白通過酶活試驗，發(fā)現(xiàn)具有乳糖分解的作用，且乳糖分解時的最適反應(yīng) PH為7. 0，在pH 6. 0 8. 0的范圍內(nèi)能保持穩(wěn)定的乳糖分解活性，且該區(qū)域的乳糖分解活 性為最大活性的80%以上。該重組蛋白不但能夠分解乳糖，而且可以在較低的溫度下實現(xiàn)乳糖分解，其最 適溫度為42°C，35°C時可達(dá)最大乳糖分解活性的90%，20°C時可達(dá)最大乳糖分解活性的 54%，甚至在0°C時仍可達(dá)到最大乳糖分解活性最大酶活的11%，由此可以看出該重組蛋 白在30°C以下仍能保持穩(wěn)定的乳糖分解活性。該重組蛋白對乳糖和鄰硝基-β -D-半乳糖苷(ONPG)的最大酶活分別高達(dá)25. 4U/ mg 禾口 243U/mg。當(dāng)體系中存在低濃度(1 IOmM)的Mg2+、Zn2+、Mn2+和Fe2+時，這些低濃度的金屬 離子并不會對該重組蛋白的乳糖分解活性有明顯影響；ImMCu2+對該重組蛋白的乳糖分解 活性有強(qiáng)烈的抑制作用；而IOmM的Na+、K+或Ca2+可導(dǎo)致該重組蛋白的乳糖分解活性有輕 微增加。通過上述重組蛋白的特性研究結(jié)果可以看出，SEQ ID NO 1所示DNA序列所編碼 的多肽在低溫情況下可以保持較高的穩(wěn)定的乳糖分解活性，而且其最適合PH接近天然牛 奶的PH值(pH 6. 7 6. 8)，其乳糖分解活性也不被牛奶中的鈉離子、鈣離子等抑制，以乳糖 為底物時酶活高，因此非常適用于食品工業(yè)中對乳品的處理，尤其可滿足乳品業(yè)對低溫乳 糖分解酶的需求。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明人首先通過宏基因組學(xué)技術(shù)得到新的尚未有功能研究的DNA序列，然后通 過基因克隆技術(shù)，對這些DNA序列分別進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的分析研究，最終獲得一條DNA序 列，該DNA序列在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的重組蛋白可在低溫情況下保持較高的、穩(wěn)定的乳 糖分解活性，而且該蛋白還具有高可溶性表達(dá)的特性，可應(yīng)用于乳品業(yè)中，有效解決乳品業(yè) 當(dāng)前存在的低溫乳糖分解酶匱乏的問題。


圖1為實施例3中的SDS-PAGE電泳圖；其中，M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量標(biāo)記，1為粗的重組蛋白，2為純化后的重組蛋白。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步地描述，但具體實施例并不對本發(fā)明做任 何限定。實施例1 土壤樣品中宏基因組DNA的提取土壤樣品采集自廣東省肇慶鼎湖山(23° 10' N，112° 31' E)。土壤樣品中宏基因組DNA的提取稱取5g土壤樣品，加入離心管中，與13. 5mL DNA 提取液(lOOmM Tris-HClUOOmM EDTA、lOOmM 磷酸鈉、1. 5M NaCl,l% CTAB, pH 8.0)混合 后，再加入100 u L蛋白酶K(10mg/mL)，于37°C、225rpm的搖床上搖動溫育30min，接著加 入1. 5mL 20% SDS，65°C水浴2h，每隔15 20min輕輕顛倒離心管幾下，室溫6000g離心 lOmin，收集上清，轉(zhuǎn)移到一新的離心管中，然后土壤沉淀中再加入4. 5mL DNA提取液(配方 同前述)和0. 5mL 20%的SDS，渦旋10s，65°C水浴lOmin，室溫6000g離心lOmin，收集上 清，并與上次上清合并。重復(fù)上述操作，收集上清與前兩次上清合并。上清與等體積的氯 仿-異戊醇(24 1體積比)混合，離心，吸取水相轉(zhuǎn)移至另一離心管中，以0.6倍體積的 異丙醇室溫沉淀lh，室溫16000g離心20min，收集核酸沉淀，用冷的70%乙醇洗滌沉淀，重 懸于滅菌的去離子水中，最終體積為500 yL。實施例2 土壤宏基因組文庫的構(gòu)建和DNA序列的獲得用Sau3AI部分酶切實施例1所提取的土壤宏基因組DNA，并電泳回收2 8kb的 酶切片段?；厥盏降腄NA片段與經(jīng)BamHI酶切和CIAP酶去磷酸化處理的pZEr0_2載體 (Invitrogen)連接，電擊轉(zhuǎn)化E. coli ToplO感受態(tài)細(xì)胞，并涂布含有50 u g/mL卡那霉素、 0. 01% X-Gal和0. 75mM IPTG的LB固體平板，由此構(gòu)建了一個庫容量達(dá)12000個轉(zhuǎn)化子、 多樣性好的宏基因組文庫。通過篩庫獲得了三個具有藍(lán)色的克隆，其中藍(lán)色最深的一個克隆被選出進(jìn)行測序 和進(jìn)一步的研究。測序結(jié)果顯示該DNA序列由2019個堿基組成，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，該DNA序列編碼的多肽，含有672個氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO :3所示， 預(yù)測的分子量為75. 95kDa，該DNA序列已提交GenBank數(shù)據(jù)庫，其登錄號為GQ274002。實施例3 DNA序列編碼多肽在大腸桿菌中的表達(dá)和純化將實施例2篩選到的含有SEQ ID NO :1所述核苷酸序列的重組菌接種于50mL LB 培養(yǎng)基(含有氨芐青霉素100ii g/ml)，37°C，250rpm搖床培養(yǎng)12 16小時，提取重組質(zhì)粒。設(shè)計引物F1和F2，引物兩端引入能插入pET32a(+)質(zhì)粒的BamHI和Hindlll酶切 位點。兩條引物的序列如下上游引物F1，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示；下游引物F2，其核苷酸序列如SEQ ID N0 5所示。以重組質(zhì)粒為模板，采用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系總體積為50 ill，含滅菌蒸餾水32 ill，5 X PCR Buffer (Mg2+已加)10 ii 1，dNTP Mixture 4 u 1(每種堿基各 2. 5mM)，兩種引物各 lu l(10uM),模板 DNA 1u 1(lng)，TaKaRa PrimeSTAR HS DNA Polymerase 1u 1(2. 5U)。PCR擴(kuò)增條件98°C 10秒鐘，68°C 2分鐘，反應(yīng)30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物約為2kb左右， 經(jīng)BamHI/Hindlll于37°C酶切6小時，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后回收目的片段，酶切后連 接入pET32a(+) (Invitrogen)質(zhì)粒中，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌E. coli BL21(DE3)，轉(zhuǎn)化液涂布含lOOy g/mL氨芐青霉素的LB平板，37°C過夜培養(yǎng)。提取陽性菌落質(zhì)粒，雙酶切 驗證后，送交測序。對測序正確的重組菌進(jìn)行乳糖酶的誘導(dǎo)表達(dá)研究，其步驟如下將重組菌種接種 到一個250ml的三角瓶中，瓶中含有50mL LB液體培養(yǎng)基(含50 y g/mL氨芐青霉素)， 37 °C培養(yǎng)直至0D6(1(1達(dá)到0. 6，然后加入IPTG至終濃度為0. 75mM, 37 °C, 225rpm繼續(xù)培養(yǎng) 5小時(0D6C1C1= 1.83)以誘導(dǎo)靶蛋白表達(dá)。4°C下6000g離心20min收獲細(xì)胞。將細(xì)胞沉 淀用lOOmM Tris-HCl緩沖液(pH 6.8)洗兩次，然后細(xì)胞被懸浮于10ml 1 XHis-binding buffer (500mMNaCl,20mM Tris-HCl，5mM咪唑，pH 7. 0)，在冰水浴中進(jìn)行超聲波破碎。將細(xì) 胞破碎液于15000g離心20min以除去細(xì)胞碎片，所得上清即為粗重組蛋白，將該粗重組蛋 白用Ni-NTA Agarose (QIAGEN)親合柱層析除去不帶6個His標(biāo)記的雜蛋白，從而得到純化 后的重組蛋白，親合柱層析的具體操作步驟按QIAGEN公司產(chǎn)品的說明書進(jìn)行即可。對獲得的粗的重組蛋白和純化后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳(如圖1所 示)。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，SEQ ID NO :1所述核苷酸序列所編碼的多肽在大腸桿菌 BL2KDE3)中的表達(dá)量非常高，每升培養(yǎng)液可獲得279mg純的蛋白，而且所有重組蛋白都是 可溶的，無包涵體形成，這種高可溶性表達(dá)特性有利于將本發(fā)明的多肽應(yīng)用于原核系統(tǒng)中 的工業(yè)化生產(chǎn)。利用 Quantity One software (BioRad Laboratories Inc. , Hercules, CA)軟件分 析蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示本發(fā)明的多肽在大腸桿菌BL21(DE3)的總可溶性蛋白中的含量高 達(dá) 47. 5%0 實施例4 DNA序列在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的重組蛋白的特性研究本實施例對實施例2所得DNA序列(其核苷酸序列如SEQ ID N0 1所述)在原核 表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行了各種特性的研究。1、分子量采用常規(guī)的SDS-PAGE電泳和Native gradient PAGE (非解離梯度聚丙烯酰胺凝 膠電泳)對蛋白進(jìn)行分子量研究。Native gradient PAGE結(jié)果顯示該蛋白的分子量約為76KDa(與實施例2中預(yù)測 的分子量75. 95kDa相符)，SDA-PAGE電泳結(jié)果顯示該蛋白的單亞基分子量也約為76KDa， 表明實施例2制備所得DNA序列的重組蛋白為一個單亞基蛋白。2、pH值和溫度對蛋白分解乳糖活性的影響以0NPG為底物，分別測定pH值和溫度對蛋白活性的影響。最適pH研究用不同pH(pH 5. 0 10. 0)的緩沖液配制蛋白分解乳糖的反應(yīng)體 系，結(jié)果表明，實施例2所得DNA序列在原核表達(dá)系統(tǒng)中的重組蛋白，其最適pH為7. 0，接近 天然牛奶的pH值(6. 7 6. 8)。因此該蛋白適于降解牛奶中的乳糖。另外pH穩(wěn)定性的研 究結(jié)果表明，該蛋白在pH 6. 0 8. 0范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，其活性為最大分解乳糖活性的80% 以上。最適溫度研究蛋白分解乳糖的反應(yīng)體系采用一系列的溫度條件，0 50°C，結(jié) 果表明，實施例2所得DNA序列在原核表達(dá)系統(tǒng)中的重組蛋白的最適反應(yīng)溫度為42°C，在 35°C和20°C分別展現(xiàn)了 90%、54%的最大分解乳糖活性，即使溫度降到0°C，仍有11%的最 大分解乳糖活性，這表明該蛋白可在低溫下分解乳糖。溫度穩(wěn)定性研究的結(jié)果表明上述蛋
6白在30°C以下很穩(wěn)定，分解乳糖活性高達(dá)最大活性的90%以上。但是35°C以上活性降低較 快，溫度達(dá)到50°C時，活性幾乎完全失去。通過上述溫度試驗可以看出，實施例2所得DNA序列在原核表達(dá)系統(tǒng)中的重組蛋 白可以在低溫下保持很好的乳糖分解活性，而且該蛋白在溫度升高的時候就會失去活性， 很容易通過加熱失活，有助于乳品的某些后處理工序。本實施例的酶活測定方法為在酶對鄰硝基-D-半乳糖苷(0NPG)活性的測定 中，10iiL 純酶溶液(0. 13iig)與 990iiL 的 lOOmM Tris-HCl 緩沖液溶液(pH 7. 0，含有 22mM 0NPG)混合，于42V反應(yīng)10分鐘，加lml 1M Na2C03終止反應(yīng)，測定OD420值。一個酶活單位 定義為每分鐘釋放1 P mol的o-硝基苯所需酶量。3、部分金屬離子和化合物對蛋白分解乳糖活性的影響。以0NPG為底物，在蛋白分解乳糖活性的測定反應(yīng)體系中分別加入終濃度為10mM 的 MgCl2、MnCl2、KC1、NaCl 和 CaCl2,終濃度為 ImM 的 FeCl2、CuS04 和 ZnS04 以及終濃度 為lOOmM EDTA，測定相對活性。結(jié)果顯示，加入lOOmM EDTA對蛋白活性沒有影響，而加入 MgCl2、ZnS04、MnCl2和FeCl2對蛋白活性也沒有明顯的影響?？墒牵尤隝mM CuS04對蛋白 活性產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用。另外，加入低濃度的Na+、K+或Ca2+對蛋白活性有輕微的提高作 用。4、蛋白的底物專一性研究。將實施例2所得DNA序列在原核表達(dá)系統(tǒng)中的重組蛋白加入100mMTriS-HCl緩沖 液(pH 7. 0)中，緩沖液中分別含有終濃度為5mM的12種不同底物，在42°C溫育5分鐘，測 定活性。結(jié)果表明，該蛋白能水解所有的12種底物，對0NPG的活性最高(100% )， 對 P -nitrophenyl-3 -D-glactopyranoside^ p -nitrophenyl-3 _D_arabinosi_de、 P -nitrophenyl-^ -D-glucuronide、 p -nitrophenyl-^ -D-mannoside 的活性分別為 44. 8%.52. 8%.49. 5%.61. 3%。而對其余的七種底物的活性較低，活性不到對0NPG活性 的1%。另外，該蛋白對天然底物乳糖的活性為25. 4U/mg，低于它對合成底物0NPG的活性 (243U/mg)。上述 12 禾中不同的底物分另lj 為0NPG， P -nitrophenyl-^ -D-galactopyran oside， p -nitrophenyl-3 -D—fucopyra—noside， p -nitrophenyl-3 -D-mannoside, o-nitrophenyl-旦 _D_glucoside， p -nitrophenyl-旦 _D_xyloside， P -nitrophenyl-^-D~ce11obioside, p -nitrophenyl-^-D-arabinoside, P-nitrophenyl-^—D—lactoside， p-nitrophenyl-^—D—galacturonide， P -nitrophenyl-^ -D-glucuronide, p -nitrophenyl-a -D—galactoside。上述酶活的測定方法如下所述酶對鄰硝基-D-半乳糖苷(0NPG)及其它底物活性的測定如上面實施例5(2) 中所述。在酶對乳糖活性的測定中使用同樣的緩沖液，但反應(yīng)的終止采用煮沸10分鐘的方 法。反應(yīng)液中葡萄糖的濃度采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶分析試劑盒(Sigma-Aldrich Corp. ,St. Louis,M0, USA)來分析。一個酶活單位定義為每分鐘釋放1 P mol的葡萄糖所需酶量。本實施例中的各項性能指標(biāo)結(jié)果說明，實施例2所得DNA序列在原核表達(dá)系統(tǒng)中
7的重組蛋白具有高可溶性表達(dá)和冷適應(yīng)的特性，低溫下降解乳糖的效果好，可用于高效、廉 價、大規(guī)模的生產(chǎn)低溫乳糖酶，在食品工業(yè)上具有重要的應(yīng)用潛力。 DNA序列在乳品業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用序列表.txt SEQUENCE LISTING <110>中山大學(xué)
<120>DNA序列在乳品業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用 <130> <160>5
<170>PatentIn version 3. 5 <210>1 <211>2019 <212>DNA <213> 土壤(soil) <100>1atgatcaacgaagacctccccgatatttggta cggtggcgattataatccggagcaatgg60
gaggaggaagtgtgggacgaggatattcgcatgtttgatctagcgggaatcgatgtggcc120
accttgaacgtcttttcttgggcgttaaatcaaccagatgaagaaacatatgatttcact180
tggcttgacgaacaaatcgaccggttgtatgagaatggaatctacacatgtctggctacc240
tctacggccgcgcatcccgcctggatggcggacgactatcccgatgtcttgcgcgtagat300
taccaaggacgagatgaggccttcgggggcagacacaattcctgtcccaactccccaacg360
tatgatgagtatgctgaagagatggcagacgaattaggtgaaacctataaagaccatccc420
ggagttctcatctggcacgtctcgaacgaatatggtggttactgctactgcgataactgt480
gctgcgtcgtttgaagattggttgcaacaatggtatggaacacttcagaacgtcaatgat540
gcatggaacaccaggttctgggggcataccttttacgactgggatgaaatcgttccccca600
aatgctttgtcggaggagtgggaaggtgactctacaaattttcaagggatttctttggat660
taccgcatcttccagtccgactcgttgcttgagtgctccgatttagaagaggatgctttg720
gaagaccacactcccaatttgcctgttacaacgaacttgatgggcacatacaaagaactc780
gactatttcgattggggggacgaaatggatgttgtgagttgggataactatccggcttat840
gacaccccagtgtcgtttaccgctatggcccatgacctcatgtgcgggttagattctggt900
caacccttcatgttgatggaacaaaccccttctcaacagaattggcagccttataacagt960
cttgatgagcctggcgtgatggaactttggtcttaccaagctgttgccgatggcgctgat1020
actgtcatgttttttcaattggaagaatctgtcggtgcctgcgagtgttatcatggtgcc1080
gttatcgaacatgttggtcatgaaaataccgaccaaaatgatgaaaccgctgctttacat1140
gatgaattgggtaacttgagttacgctttgttggatgctcgtgttcaagccgaggtcgcc1200
atcgtctttgactgggaaaaccgctgggctactgaactttcctctggcccctctgctggc1260
ttagattatgtttatgaagttcataattattatgctgccttatttgatgaaaacatcccc1320
gtcgacatgatcggcgtcgatgaagatttatctaaatacgagatcgtcatagcgcctgtg1380
ttgtatatggtcaagtccggttacgctgacccctgcgatgaattcgttcaaaacggggga1440
acttttttcaccacattcttctcgggcatcgtcaacgaacacgacttggtcacccttggc15000098]
0099]
0100] 0101] 0102]
0103]
0104]
0105]
0106]
0107]
0108]
0109]
0110] 0111] 0112]
0113]
0114]
0115]
0116]
0117]
0118]
0119]
0120] 0121] 0122]
0123]
0124]
0125]
0126]
0127]
0128]
0129]
0130]
0131]
0132]
0133]
0134]
0135]
0136]
ggctacccaggcgagactgacccccggaggagaagaaccattggaatgcgaactcttgtttatggttctgatttctacgcgatgettattacgttggtacgtctgtggcgaaaaggaaatgaacgtcgaaaggatggagcgagttggagateggegaaggtcccttgacccatacaccga<210>2<211>2019<212>DNA<213> 土壤(soil)<220><221>CDS<222>⑴ (2016)<400>2atg ate aac gaa gac cMet lie Asn Glu Asp I
agatcttctc gatagtaatt tgacatcatc tggcacccca ctgtccagat cgctccttta atcttacttc aactgatttg gggacacctc
ggaatctggg acaaacgata cactctgaag gtaattaccc caggcttttc ctgaacgtcc ttcacctatg cttaccggca gatttctga
ttgaagagat
ccgggtcttt
gtgccgacgt
gccatgccta
ttaccgactt
ctaaaggcgt
ttcataatgc
aggaacttac
agatgccttg
aacggggcct
cttggccgaa
tggcgcaacc
ccaagacact
cgaggtaact
ttctaccgtc
cactgaattg
ccg Pro
gat Asp
tta Leu
caa
Gin
65
tct
Ser
ttg Leu
gag Glu
eta Leu
aat
Asn
50
ate
lie
acg Thr
cgc Arg
caa Gin
gcg
Ala
35
caa
Gin
gac Asp
gcc Ala
gta Val
tgg Trp 20 gga Gly
cca Pro
egg Arg
gcg Ala
gat Asp 100
5
gag Glu
ate lie
gat Asp
ttg Leu
cat
His
85
tac
Tyr
gag Glu
gat Asp
gaa Glu
tat
Tyr
70
ccc
Pro
caa Gin
ccc Pro
gaa Glu
gtg Val
gaa
Glu
55
gag
Glu
gcc Ala
gga Gly
gat Asp
gtg Val
gcc
Ala
40
aca
Thr
aat Asn
tgg Trp
cga Arg
att lie
tgg
Trp
25
acc
Thr
tat Tyr
gga Gly
atg Met
tgg Trp 10 gac Asp
ttg Leu
gat Asp
ate lie
gcg Ala 90
tac Tyr
gag Glu
aac Asn
ttc Phe
tac
Tyr
75
gac
Asp
ggt Gly
gat Asp
gtc Val
act
Thr
60
aca
Thr
gac Asp
ggc gat Gly Asp
att lie
ttt Phe 45 tgg Trp
tgt Cys
tat Tyr
cgc
Arg
30
tct
Ser
ctt Leu
ctg Leu
ccc Pro
tat Tyr 15 atg Met
tgg Trp
aat Asn
ttt Phe
gcg Ala
gac gaa Asp Glu
get Ala
gat
Asp
95
aga
Arg
acc
Thr
80
gtc
Val
1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2019
cac His
aat tcc tgt ccc aac tcc cca acg
gat gag gcc ttc ggg ggc Asp Glu Ala Phe Gly Gly 105110
tat gat gag tat get gaa gag atg
48
96
144
192
240
288
336
3840137]AsnSerCysProAsnSerProThrTyrAspGluTyrAlaGluGluMet0138]115120125 0139]gcagacgaattaggtgaaacctatgaccatcccggagttctcate4320140]AlaAspGluLeuGlyGluThrTyrLysAspHisProGlyValLeulie0141]1301351400142]tggcacgtctegaacgaatatggtggttactgctactgcgataactgt4800143]TrpHisValSerAsnGluTyrGlyGlyTyrCysTyrCysAspAsnCys0144]1451501551600145]getgcgtegtttgaagattggttgcaacaatggtatggaacacttcag5280146]AlaAlaSerPheGluAspTrpLeuGinGinTrpTyrGlyThrLeuGin0147]1651701750148]aacgtcaatgatgcatggaacaccaggttctgggggcataccttttac5760149]AsnValAsnAspAlaTrpAsnThrArgPheTrpGlyHisThrPheTyr0150]1801851900151]gactgggatgaaategttcccccaaatgetttgteggaggagtgggaa6240152]AspTrpAspGlulieValProProAsnAlaLeuSerGluGluTrpGlu0153]1952002050154]ggtgactctacaaattttcaagggatttctttggattaccgcatettc6720155]GlyAspSerThrAsnPheGinGlylieSerLeuAspTyrArgliePhe0156]2102152200157]cagtccgactegttgcttgagtgctccgatttagaagaggatgetttg7200158]GinSerAspSerLeuLeuGluCysSerAspLeuGluGluAspAlaLeu0159]2252302352400160]gaagaccacactcccaatttgcctgttacaacgaacttgatgggcaca7680161]GluAspHisThrProAsnLeuProValThrThrAsnLeuMetGlyThr0162]2452502550163]tacgaactcgactatttcgattggggggacgaaatggatgttgtg8160164]TyrLysGluLeuAspTyrPheAspTrpGlyAspGluMetAspValVal0165]2602652700166]agttgggataactatccggettatgacaccccagtgtegtttaccget8640167]SerTrpAspAsnTyrProAlaTyrAspThrProValSerPheThrAla0168]2752802850169]atggcccatgacctcatgtgcgggttagattctggtcaacccttcatg9120170]MetAlaHisAspLeuMetCysGlyLeuAspSerGlyGinProPheMet0171]2902953000172]ttgatggaacaaaccccttctcaacagaattggcagccttataacagt9600173]LeuMetGluGinThrProSerGinGinAsnTrpGinProTyrAsnSer0174]3053103153200175]cttgatgagcctggcgtgatggaactttggtcttaccaagetgttgcc1008
Leu Asp GluPro Gly Val Met Glu Leu Trp Ser Tyr Gln Ala Val Ala325330335gat ggc getgat act gtc atg ttt ttt caa ttg gaa gaa tct gtc ggt 1056Asp Gly Ala Asp Thr Val Met Phe Phe Gln Leu Glu Glu Ser Val Gly340345350gcc tgc gagtgt tat cat ggt gcc gtt ate gaa cat gtt ggt cat gaa 1104Ala Cys GluCys Tyr His Gly Ala Val lie Glu His Val Gly His Glu355360365aat acc gaccaa aat gat gaa acc get get tta cat gat gaa ttg ggt 1152Asn Thr AspGln Asn Asp Glu Thr Ala Ala Leu His Asp Glu Leu Gly370375380aac ttg agttac get ttg ttg gat get cgt gtt caa gcc gag gtc gcc 1200Asn Leu SerTyr Ala Leu Leu Asp Ala Arg Val Gln Ala Glu Val Ala385390395400ate gtc tttgac tgg gaa aac cgc tgg get act gaa ctt tcc tct ggc 1248lie Val PheAsp Trp Glu Asn Arg Trp Ala Thr Glu Leu Ser Ser Gly405410415ccc tct getggc tta gat tat gtt tat gaa gtt cat aat tat tat get 1296Pro Ser Ala Gly Leu Asp Tyr Val Tyr Glu Val His Asn Tyr Tyr Ala420425430gcc tta tttgat gaa aac ate ccc gtc gac atg ate ggc gtc gat gaa 1344Ala Leu PheAsp Glu Asn lie Pro Val Asp Met lie Gly Val Asp Glu435440445gat tta tctaaa tac gag ate gtc ata gcg cct gtg ttg tat atg gtc 1392Asp Leu SerLys Tyr Glu lie Val lie Ala Pro Val Leu Tyr Met Val450455460aag tcc ggttac get gac ccc tgc gat gaa ttc gtt caa aac ggg gga 1440Lys Ser GlyTyr Ala Asp Pro Cys Asp Glu Phe Val Gln Asn Gly Gly465470475480act ttt ttcacc aca ttc ttc tcg ggc ate gtc aac gaa cac gac ttg 1488Thr Phe PheThr Thr Phe Phe Ser Gly lie Val Asn Glu His Asp Leu485490495gtc acc cttggc ggc tac cca ggc gag act gaa gat ctt ctc gga ate 1536Val Thr LeuGly Gly Tyr Pro Gly Glu Thr Glu Asp Leu Leu Gly lie500505510tgg gtt gaagag ata gat gcc ttg ccc ccg gag gag aag aac cag ata 1584Trp Val GluGlu lie Asp Ala Leu Pro Pro Glu Glu Lys Asn Gln lie515520525
gta att acaaac gat acc ggg tct tta acg ggg cct ttg gaa tgc gaa 1632
Val lie Thr Asn Asp Thr Gly Ser Leu Thr Gly Pro Leu Glu Cys Glu530535540ctc ttg ttt gac ate ate cac tct gaa ggt gcc gac gtc ttg gcc gaa 1680Leu Leu Phe Asp lie lie His Ser Glu Gly Ala Asp Val Leu Ala Glu545550555560tat ggt tct gat ttc tac get ggc acc cca gta att acc cgc cat gcc 1728Tyr Gly Ser Asp Phe Tyr Ala Gly Thr Pro Val lie Thr Arg His Ala565570575tat ggc gca acc gat get tat tac gtt ggt acc tgt cca gat cag get 1776Tyr Gly Ala Thr Asp Ala Tyr Tyr Val Gly Thr Cys Pro Asp Gln Ala580585590ttt ctt acc gac ttc caa gac act gtc tgt ggc gaa aag gaa ate get 1824Phe Leu Thr Asp Phe Gln Asp Thr Val Cys Gly Glu Lys Glu lie Ala595600605cct tta ctg aac gtc cct aaa ggc gtc gag gta act gaa cgt cga aag 1872Pro Leu Leu Asn Val Pro Lys Gly Val Glu Val Thr Glu Arg Arg Lys610615620gat gga gca tct tac ttc ttc acc tat gtt cat aat get tct acc gtc 1920Asp Gly Ala Ser Tyr Phe Phe Thr Tyr Val His Asn Ala Ser Thr Val625630635640gag ttg gag ate ggc gaa gga act gat ttg ctt acc ggc aag gaa ctt 1968Glu Leu Glu lie Gly Glu Gly Thr Asp Leu Leu Thr Gly Lys Glu Leu645650655acc act gaa ttg tcc ctt gac cca tac acc gag gga cac ctc gat ttc 2016Thr Thr Glu Leu Ser Leu Asp Pro Tyr Thr Glu Gly His Leu Asp Phe660665670tga2019<210>3<211>672<212>PRT<213> 土壤(soil)<400>3Met lie Asn Glu Asp Leu Pro Asp lie Trp Tyr Gly Gly Asp Tyr Asn151015Pro Glu Gln Trp Glu Glu Glu Val Trp Asp Glu Asp lie Arg Met Phe202530Asp Leu Ala Gly lie Asp Val Ala Thr Leu Asn Val Phe Ser Trp Ala354045Leu Asn Gln Pro Asp Glu Glu Thr Tyr Asp Phe Thr Trp Leu Asp Glu
505560 Gln lie Asp Arg Leu Tyr Glu Asn Gly lie Tyr Thr Cys Leu Ala Thr65707580Ser Thr Ala Ala His Pro Ala Trp Met Ala Asp Asp Tyr Pro Asp Val859095Leu Arg Val Asp Tyr Gln Gly Arg Asp Glu Ala Phe Gly Gly Arg His100105110Asn Ser Cys Pro Asn Ser Pro Thr Tyr Asp Glu Tyr Ala Glu Glu Met115120125Ala Asp Glu Leu Gly Glu Thr Tyr Lys Asp His Pro Gly Val Leu lie130135140Trp His Val Ser Asn Glu Tyr Gly Gly Tyr Cys Tyr Cys Asp Asn Cys145150155160Ala Ala Ser Phe Glu Asp Trp Leu Gln Gln Trp Tyr Gly Thr Leu Gln165170175Asn Val Asn Asp Ala Trp Asn Thr Arg Phe Trp Gly His Thr Phe Tyr180185190Asp Trp Asp Glu lie Val Pro Pro Asn Ala Leu Ser Glu Glu Trp Glu195200205Gly Asp Ser Thr Asn Phe Gln Gly lie Ser Leu Asp Tyr Arg lie Phe210215220Gln Ser Asp Ser Leu Leu Glu Cys Ser Asp Leu Glu Glu Asp Ala Leu225230235240Glu Asp His Thr Pro Asn Leu Pro Val Thr Thr Asn Leu Met Gly Thr245250255Tyr Lys Glu Leu Asp Tyr Phe Asp Trp Gly Asp Glu Met Asp Val Val260265270Ser Trp Asp Asn Tyr Pro Ala Tyr Asp Thr Pro Val Ser Phe Thr Ala275280285Met Ala His Asp Leu Met Cys Gly Leu Asp Ser Gly Gln Pro Phe Met290295300Leu Met Glu Gln Thr Pro Ser Gln Gln Asn Trp Gln Pro Tyr Asn Ser305310315320Leu Asp Glu Pro Gly Val Met Glu Leu Trp Ser Tyr Gln Ala Val Ala325330335Asp Gly Ala Asp Thr Val Met Phe Phe Gln Leu Glu Glu Ser Val Gly340345350Ala Cys Glu Cys Tyr His Gly Ala Val lie Glu His Val Gly His Glu355360365
Asn Thr Asp Gln Asn Asp Glu Thr Ala Ala Leu His Asp Glu Leu Gly370375380Asn Leu Ser Tyr Ala Leu Leu Asp Ala Arg Val Gln Ala Glu Val Ala385390395400lie Val Phe Asp Trp Glu Asn Arg Trp Ala Thr Glu Leu Ser Ser Gly405410415Pro Ser Ala Gly Leu Asp Tyr Val Tyr Glu Val His Asn Tyr Tyr Ala420425430Ala Leu Phe Asp Glu Asn lie Pro Val Asp Met lie Gly Val Asp Glu435440445Asp Leu Ser Lys Tyr Glu lie Val lie Ala Pro Val Leu Tyr Met Val450455460Lys Ser Gly Tyr Ala Asp Pro Cys Asp Glu Phe Val Gln Asn Gly Gly465470475480Thr Phe Phe Thr Thr Phe Phe Ser Gly lie Val Asn Glu His Asp Leu485490495Val Thr Leu Gly Gly Tyr Pro Gly Glu Thr Glu Asp Leu Leu Gly lie500505510Trp Val Glu Glu lie Asp Ala Leu Pro Pro Glu Glu Lys Asn Gln lie515520525Val lie Thr Asn Asp Thr Gly Ser Leu Thr Gly Pro Leu Glu Cys Glu530535540Leu Leu Phe Asp lie lie His Ser Glu Gly Ala Asp Val Leu Ala Glu545550555560Tyr Gly Ser Asp Phe Tyr Ala Gly Thr Pro Val lie Thr Arg His Ala565570575Tyr Gly Ala Thr Asp Ala Tyr Tyr Val Gly Thr Cys Pro Asp Gln Ala580585590Phe Leu Thr Asp Phe Gln Asp Thr Val Cys Gly Glu Lys Glu lie Ala595600605Pro Leu Leu Asn Val Pro Lys Gly Val Glu Val Thr Glu Arg Arg Lys610615620Asp Gly Ala Ser Tyr Phe Phe Thr Tyr Val His Asn Ala Ser Thr Val625630635640Glu Leu Glu lie Gly Glu Gly Thr Asp Leu Leu Thr Gly Lys Glu Leu645650655Thr Thr Glu Leu Ser Leu Asp Pro Tyr Thr Glu Gly His Leu Asp Phe660 665670<210>4
<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>4cgcggatcca tgatcaacga agacctcccc gat33<210>5<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>5cccaagcttg aaatcgaggt gtccctcggt g3權(quán)利要求
一條DNA序列在乳品業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用，其特征在于所述DNA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于該應(yīng)用是將所述DNA序列通過克隆技術(shù)轉(zhuǎn)化 入原核表達(dá)載體中，所得重組蛋白用于乳品業(yè)中乳糖分解。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其特征在于所述重組蛋白進(jìn)行乳糖分解時的反應(yīng)pH為 6. 0 8. O0
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其特征在于所述重組蛋白進(jìn)行乳糖分解時的反應(yīng)溫度為 0°C 30°C。
全文摘要
本發(fā)明公開一條DNA序列在乳品業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用，該DNA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。本發(fā)明人通過宏基因組學(xué)技術(shù)得到新的尚未有功能研究的DNA序列，然后通過基因克隆技術(shù)，對該DNA序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的分析研究，發(fā)現(xiàn)該DNA序列在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的重組蛋白可在低溫情況下保持較高的、穩(wěn)定的乳糖分解活性，而且該蛋白還具有高可溶性表達(dá)的特性，可應(yīng)用于乳品業(yè)中，滿足乳品業(yè)對低溫乳糖分解酶的需求。
文檔編號C12N9/38GK101812471SQ200910214209
公開日2010年8月25日 申請日期2009年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月28日
發(fā)明者劉玉煥, 李剛 申請人:中山大學(xué)