專利名稱：：豬用干擾素-胸腺肽廣譜抗病毒藥物制劑及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供一種豬用新型廣譜抗病毒生物制劑，本發(fā)明還提供了該生物制劑的合成方法，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：干擾素(IFN)是細(xì)胞分泌的小肽，具有抗病毒，抗增生和免疫調(diào)節(jié)等廣泛的生物學(xué)活性。研究表明，干擾素在動(dòng)物中是普遍存在的，不僅人和高等動(dòng)物的細(xì)胞能夠產(chǎn)生干擾素，甚至許多低等動(dòng)物和細(xì)菌也能產(chǎn)生干擾素。干擾素誘生劑或病毒均可誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體或動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生干擾素。已研究的所有哺乳動(dòng)物中，都含有IFN-a，IFN-e(I型)和IFN-y(II型)基因。其中IFN-P和IFN-y具有種屬特異性，而IFN-a具有異種動(dòng)物的抗病毒活性。正常細(xì)胞一般不自發(fā)產(chǎn)生干擾素，只存在合成干擾素的潛能，IFN基因處于被抑制狀態(tài)。在有誘發(fā)劑的條件下，IFN基因解除抑制而獲得表達(dá)。胸腺中包含多種激素，歸屬于a、13、Y三類，共同誘導(dǎo)T細(xì)胞的成熟分化。胸腺肽主要活性成份是由28個(gè)氨基酸組成的胸腺肽al(THYa1)，現(xiàn)已有化學(xué)合成的商品。近年來，由于胸腺肽在多種抗病毒免疫中的高效、低毒等特性，其應(yīng)用也日趨廣泛。目前國內(nèi)獸醫(yī)臨床上干擾素和胸腺肽應(yīng)用很少，尤其二者融合蛋白的表達(dá)及其應(yīng)用的研究至今尚無報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明公開了豬用干擾素_胸腺肽廣譜抗病毒藥物制劑及制備方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明這種豬用新型廣譜抗病毒生物制劑的合成方法如下依據(jù)IFN-a1和THY-a1的分子結(jié)構(gòu)特征及大腸桿菌密碼子的偏愛性設(shè)計(jì)引物，采用PCR方法獲得二者的融合基因。將該基因克隆至pGEX4T-2原核表達(dá)載體中，構(gòu)建了pGEX4T-IFNa1-THYa1原核表達(dá)質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)受體菌中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、表達(dá)、純化獲得IFNal-THYa1融合蛋白。通過細(xì)胞病變抑制實(shí)驗(yàn)和E玫瑰花環(huán)形成實(shí)驗(yàn)對(duì)蛋白進(jìn)行生物活性檢測(cè)。上述引物序列如下IF1:5，-cgcggatcctgtgacctgcctcagac-3，(BamHI);IF2:5，-ccggaattccaggtttctggaggaaga-3，(EcoRI)IT1:5，-atccaccgccgcatccgagccggctgcagcgcccaggtttctgga-3，；IT2:5'-ttttagatctttggtggttatttccgacgaggtatccaccgccgcatc-3';IT3:5'_ccgctcgagtcaattttcggcttcttccaccacttcttttttttcttttagatctttggt_3，；IT4:5，-ccgctcgagtcaattttcggcttcttc-3，(XhoI)本發(fā)明這種豬用新型廣譜抗病毒生物制劑的合成方法，包括以下步驟31、豬干擾素a1與胸腺肽a融合基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建(1)從豬全血基因組中擴(kuò)增干擾素a1基因；(2)人工合成豬胸腺肽a1基因；(3)通過linker(連接肽)將豬干擾素a1基因和胸腺肽a1基因連接起來形成融合基因；(4)將融合基因克隆至pGEX4T-2表達(dá)載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒；(5)采用PCR、限制性酶酶切、序列測(cè)定等方法鑒定重組質(zhì)粒。2、融合蛋白的表達(dá)、純化及活性分析(1)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21宿主細(xì)胞感受態(tài)菌中，篩選陽性克隆菌；(2)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定；(3)目的蛋白分離純化；(4)目的蛋白活性檢測(cè)。以下實(shí)驗(yàn)表明IFNa1-THYa1融合蛋白具有兩種生物活性融合蛋白的生物活性檢測(cè)1、細(xì)胞病變抑制實(shí)驗(yàn)IFN-a1可以使細(xì)胞建立抗病毒狀態(tài)，使細(xì)胞免受病毒攻擊的損害，據(jù)此可以判斷融合蛋白是否具有干擾素的抗病毒活性。實(shí)驗(yàn)方法如下1.1豬腎上皮細(xì)胞PK15的復(fù)蘇(1)將培養(yǎng)液置于37t:水槽水浴加熱，之后用70%酒精擦拭，移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。(2)自液氮罐中取出冷凍管，立即放入37t:水浴中快速解凍，輕搖冷凍管使其在lmin內(nèi)全部融化，以70%酒精擦拭冷凍管外部，移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。(3)取出0.9mL解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)液的細(xì)胞瓶內(nèi)(稀釋比例為1:10-1:15)，混合均勻，放入C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(4)解凍后，1000rpm離心5min，棄去上清，加入新鮮培養(yǎng)液，混合均勻，放入C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。1.2細(xì)胞傳代(1)倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞是否需要傳代及細(xì)胞需要稀釋的倍數(shù)。將培養(yǎng)液置37t:下預(yù)熱。(2)將培養(yǎng)液瓶口用75%酒精消毒，過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁。(3)倒掉培養(yǎng)細(xì)胞的舊培養(yǎng)液，用少量胰酶消化90s。(4)每個(gè)大培養(yǎng)瓶加入2mL胰酶，小瓶用量酌減，蓋好瓶蓋后在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞收回突起變圓時(shí)立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫離胰酶，然后將胰酶倒掉。注意勿使細(xì)胞提早脫落入消化液中。(5)加入少量的DMEM完全培養(yǎng)液，反復(fù)吹打消化好的細(xì)胞使其脫壁并分散，再根據(jù)分傳瓶數(shù)補(bǔ)加一定量的DMEM完全培養(yǎng)液(7-10mL/大瓶，3-5mL/小瓶)制成細(xì)胞懸液，然后分裝到新培養(yǎng)瓶中。放回C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。1.3抗病毒活性測(cè)定用DMEM完全培養(yǎng)液將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。將CRFK細(xì)胞懸液加入2塊6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔2mL。設(shè)第一組，第二組，第三組，第四組，共四組，每組三孔。放入C02培養(yǎng)箱37t:孵育，至形成均勻的細(xì)胞單層。棄去6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)液。將純化并測(cè)定含量的重組IFN-a1，IFNa1-THYa1蛋白分別用匿EM完全培養(yǎng)液100倍稀釋后再進(jìn)行2倍系列稀釋，按2mL/孔的量，將IFN-a1加入到第二組的三個(gè)孔中，將IFNa1-THYal加入到第三組的三個(gè)孔中，將購買的人重組IFN-a2a加入到第四組三個(gè)孔中。放入C02培養(yǎng)箱37t:孵育過夜。用DMEM培養(yǎng)液10倍系列稀釋豬瘟病毒(SFV)，重復(fù)接種6孔，每孔2mL。C02培養(yǎng)箱37t:孵育20h后，觀察并記錄結(jié)果。附圖1為未接病毒時(shí)豬腎上皮細(xì)胞(PK15)的形態(tài)，圖2為豬瘟病毒(SFV)接種20h后細(xì)胞的形態(tài)，其中，第一組為病毒對(duì)照組，第二組為接種SFV后加入IFN-a1的細(xì)胞，第三組為接種SFV后加入IFNa1-THYa1后細(xì)胞的形態(tài)，第四組為接種SFV后加入人重組IFN-a2a的對(duì)照，實(shí)結(jié)果表明融合蛋白的抗病毒活性與標(biāo)準(zhǔn)干擾素活性基本一致。結(jié)果表明融合蛋白的抗病毒活性與標(biāo)準(zhǔn)干擾素活性基本一致。2、玫瑰花結(jié)形成實(shí)驗(yàn)THY-a1具有促進(jìn)細(xì)胞表面受體表達(dá)的活性，根據(jù)E玫瑰花結(jié)形成實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)融合蛋白促進(jìn)細(xì)胞表面受體表達(dá)的活性，據(jù)此判斷融合蛋白中THY-a1的生物學(xué)活性。樣品活力=樣品管中E玫瑰花結(jié)百分率-對(duì)照管E玫瑰花結(jié)百分率。實(shí)驗(yàn)過程如下2.1淋巴細(xì)胞懸液的制備取lmL淋巴細(xì)胞分離液加lmL肝素抗凝血，使血液輕輕覆蓋在分離液上面，并使血液與分離液之間保持清晰的界面，立即置水平式離心機(jī)中以2000rpm離心20min，離心后分為四層，最上面為血漿，中間層為分離液，上層和中間層之間的乳白色層含有大量淋巴細(xì)胞，最下層為紅細(xì)胞。小心吸取淋巴細(xì)胞于試管中，用Hank's液洗滌，以1500rpm離心5min沉淀淋巴細(xì)胞，棄上清，加入適量Hank's液，制成淋巴細(xì)胞懸液。置45。C恒溫水浴保溫30min，每5min搖動(dòng)一次，取出后以1500rpm離心5min，棄去上清。用Hank's液洗滌3次。細(xì)胞計(jì)數(shù)，用Hank's液配成5X106/mL的細(xì)胞懸液。2.2綿羊紅細(xì)胞懸液的制備取一定量阿氏液保存的綿羊血于離心管中，Hank's液洗滌3次，取末次洗滌后的血球用Hank's液調(diào)整細(xì)胞濃度為2X108/mL。2.3活性測(cè)定取融合蛋白樣品用Hank's液配制成lmg/mL濃度。取小管10支，其中5支各加Hank's液O.lmL作為對(duì)照；另外5支各加樣品溶液0.lmL作為測(cè)定管，每管中各加脫E受體的淋巴細(xì)胞懸液0.2mL，搖勻，37t:孵育lh，加入綿羊紅細(xì)胞懸液0.2mL，500rpm離心3min，放入4t:冰箱過夜，次日取出，棄去上清，每管中加固定液一滴，輕輕搖勻，靜置10min，加入染色液2滴并搖勻，靜置15min后開始計(jì)數(shù)，視野中淡藍(lán)色的較大的細(xì)胞為淋巴細(xì)胞，共數(shù)計(jì)數(shù)板16個(gè)大方格上所有淋巴細(xì)胞的個(gè)數(shù)(不少于200個(gè))，統(tǒng)計(jì)其中的E玫瑰花結(jié)形成的細(xì)胞數(shù)(結(jié)合3個(gè)以上綿羊紅細(xì)胞的淋巴細(xì)胞)，計(jì)算花結(jié)形成百分率，取各管的平均值。E玫瑰花環(huán)形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果——各樣品的玫瑰花結(jié)形成情況如下5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表達(dá)樣品提高了玫瑰花結(jié)形成率，2448h表達(dá)產(chǎn)物的玫瑰花結(jié)形成率均在10%以上，即表明表達(dá)產(chǎn)物均有胸腺肽活性。融合蛋白樣品活力為23.12%-14.7%=8.42%。從以上體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IFNa1-THYa1融合蛋白具有IFNa1和THYa1雙重生物活性，人醫(yī)臨床數(shù)據(jù)顯示干擾素、胸腺肽聯(lián)合應(yīng)用可提高二者的抗病毒功效，因此，本研究所獲得的IFNal-THYa1融合蛋白在機(jī)體內(nèi)能夠發(fā)揮各自的生物活性，并具有協(xié)同作用。本發(fā)明積極效果在于利用基因工程的方法獲得具有雙重生物功效的IFNa1和THYa1融合蛋白，通過IFN和THY協(xié)同作用明顯高于IFN和THY各自單獨(dú)的抗病毒能力。二者融合蛋白生物制劑生產(chǎn)工藝簡單，降低生產(chǎn)成本；另一方面IFN和THY融合蛋白的聯(lián)合顯提高了IFN和THY抗病毒的功效。圖1為未接病毒細(xì)胞時(shí)細(xì)胞的形態(tài)圖；圖2為SFV接種20h后細(xì)胞的形態(tài)圖；圖3為豬IFNa1-THYa1融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物的Westernblot分析圖。具體實(shí)施例方式為了便于理解本發(fā)明，特列舉以下實(shí)施例。其作用被理解為是對(duì)本發(fā)明的闡述而非對(duì)本發(fā)明的任何形式的限制。實(shí)施例11.豬IFN-a1基因序列擴(kuò)增及克隆。1.1從豬基因組中PCR擴(kuò)增豬IFNa1目的基因。利用WholeBloodGenomicDNAMini-pr印Kit提取豬血液基因組，以IF1和IF2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得豬IFN-al目的基因。PCR擴(kuò)增IFNa1基因，按表2_1—次加入各組分后進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件如下94。C預(yù)變性5min，94。C30s，54。C30s，72。C30s，30個(gè)循環(huán)后延伸72。C，8min。表1-1豬IFNa1基因PCR反應(yīng)體系序號(hào)組分體積1豬基因組DNA2^2上游引物IF10.5|A3下游引物if20.54dNTPMixture2pLio必Tagbuffer2.5jjL6ddH2017^了￡jtr叫0,5^Totalvolume25^1.5%瓊脂糖凝膠電泳，回收。1.2豬IFN-a1基因與pMD18_T載體的連接通過PCR法擴(kuò)展獲得豬IFN-a1基因，將其連接到pMD18-T載體上。連接反應(yīng)體系見表2-2，充分混勻，16t:水浴連接，反應(yīng)過夜。表1-2豬IFN-a1基因與pMD18-T載體連接反應(yīng)體系序號(hào)組分體積1豬IFN-a1基因22SolutionI53pMD18-TSimpleVector0.54ddH202.5^Totalvolume10pi1.3轉(zhuǎn)化取連接反應(yīng)產(chǎn)物加入到適量大腸桿菌(DH5a)感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻后冰浴30min，放入預(yù)加溫至42T的水浴中，熱沖擊90sec，然后立即轉(zhuǎn)移至冰浴中，冷卻12min。轉(zhuǎn)移入800uLLB培養(yǎng)基中，于搖床上，37°C、200rpm培養(yǎng)45min。然后均勻涂布到LB-Amp(50yg/mL)瓊脂平板上，晾干。倒置平皿，于37。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1216h，觀察單菌落生長情況。1.4鑒定分別挑取單菌落至LB-Amp(50iig/mL)培養(yǎng)基中，37°C、250rpm培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒進(jìn)行BamHI、EcoRI雙酶切鑒定并測(cè)序(T7通用引物測(cè)序)。選取序列正確的T-IFNa1菌液保存并提取質(zhì)粒，取少量測(cè)定DNA含量，其余儲(chǔ)存于-2(TC。[OO84]2.pGEX4T-IFNa1-THYa1原核表達(dá)載體的構(gòu)建2.1豬IFNa1-THYa1全基因的獲得在IFN-a1和THY-a1中間設(shè)計(jì)了一個(gè)5肽的接頭，氨基酸序列為Gly-Ala-Ala-Ala-Gly。Gly和Ala的側(cè)鏈很小，因此該連接肽具有較高的柔性，可以減少對(duì)融合蛋白折疊的影響。根據(jù)THY-al氨基酸序列和大腸桿菌密碼子偏愛性設(shè)計(jì)4條引物分別與IF1配對(duì)分4次PCR反應(yīng)擴(kuò)增IFNa1-THYa1全基因序列，每次反應(yīng)均以前一次反應(yīng)的產(chǎn)物為模板。分別按表2-l，2-2，2-3，2-4—次加入各組分后進(jìn)行PCR反應(yīng)，四次反應(yīng)條件如下第一次94。C預(yù)變性5min，94。C30s，68。C30s，72。C30s，7個(gè)循環(huán)后延伸72。C，8min;第二次94。C預(yù)變性5min，94。C30s，68。C30s，72。C30s，7個(gè)循環(huán)后延伸72。C，8min;第三次94。C預(yù)變性5min，94。C30s，64。C30s，72。C30s，7個(gè)循環(huán)后延伸72。C，8min;第四次94°C預(yù)變性5min，94°C30s，58°C30s，72°C30s，25個(gè)循環(huán)后延伸72°C，8min;表2-1第一次PCR擴(kuò)增IFNa1-THYa1全基因反應(yīng)體系序號(hào)組分體積1質(zhì)粒T-IFNal1|aL2上游引物IF12pL3下游引物IT12jaL4dNTPMixture2pL10x&ra《buffer2.5jjL6細(xì)2015juL7Er7b《0.5|uLTotalvolume25PCR產(chǎn)物記為l-IFNa1--THYa1。表2-2第二次PCR擴(kuò)增IFNa1-THYa1全基因反應(yīng)體系序號(hào)組分體積11-IFNal-THYal22上游引物IFl2pL3下游引物IT22jiL4dNTPMixture2jjL510x￡xbuffer2.56ddH2014^iL7￡x7^《0.5)xLTotalvolume25joLPCR產(chǎn)物記為2-IFNa1-THYa1。表2-3第三次PCR擴(kuò)增IFNa1-THYa1全基因反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>獲得豬IFNal-THYa1全基因，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，回收:2.2豬IFNa1-THYa1全基因酶切體系如表2-5，37°C，酶切過夜。表2-5豬IFNal-THYa1全基因酶切反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>1.5%瓊脂糖凝膠電泳，博大泰克凝膠片斷回收純化試劑盒回收載體片段。2.3pGEX4T-2原核表達(dá)載體酶切體系如表2-6，37°C，酶切過夜。表2-6pGEX4T-2原核表達(dá)載體酶切反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>0.7%瓊脂糖凝膠電泳，博大泰克凝膠片斷回收純化試劑盒回收載體片段。2.4豬IFNa1-THYa1全基因與載體pGEX4T-2的連接連接通過酶切獲得的豬IFNal-THYa1全基因與載體pGEX4T_2。連接反應(yīng)體系見表2-7，充分混勻，16t:水浴連接，反應(yīng)過夜。表2-7豬IFNa1-THYa1全基因與載體pGEX4T-2連接反應(yīng)體系序號(hào)組分體積1豬IFNotl-THYal全基因4^2pGEX4T-23T4DNAligaseBuffer1^4T4DNALigase1ddH202(iLTotalvolume10/A2.5轉(zhuǎn)化。取連接反應(yīng)產(chǎn)物(設(shè)陰性對(duì)照質(zhì)粒pGEX4T-2)加入到適量大腸桿菌(DH5a)感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻后冰浴30min，放入預(yù)加溫至42t:的水浴中，熱沖擊90sec，然后立即轉(zhuǎn)移至冰浴中，冷卻12min。轉(zhuǎn)移入800iiLLB培養(yǎng)基中，于搖床上，37°C、200rpm培養(yǎng)45min。然后均勻涂布到LB-Amp(50yg/mL)瓊脂平板上，晾干。倒置平皿，于37。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1216h，觀察單菌落生長情況。2.6鑒定。分別挑取單菌落至LB-Amp(50yg/mL)培養(yǎng)基中，37°C、250rpm培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒進(jìn)行BamHI、XhoI雙酶切鑒定并測(cè)序(T7通用引物測(cè)序)。選取序列正確的pGEX4T-IFNal-THYa1菌液保存并提取質(zhì)粒，取少量測(cè)定DNA含量，其余儲(chǔ)存于一20°C。3.原核表達(dá)載體pGEX4T-IFNal-THYa1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。取測(cè)序正確的載體pGEX4T-IFNal-THYa1(設(shè)陰性對(duì)照質(zhì)粒pGEX4T-2)加入到適量BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻后冰浴30min，放入預(yù)加溫至42。C的水浴中，熱沖擊90sec，然后立即轉(zhuǎn)移至冰浴中，冷卻12min。轉(zhuǎn)移入800yLLB培養(yǎng)基中，于搖床上，37°C、200rpm培養(yǎng)45min。然后均勻涂布到LB-Amp(50yg/mL)瓊脂平板上，晾干。倒置平皿，于37t:恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1216h，觀察單菌落生長情況。4.GST-IFNal-THYa1目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)將鑒定好的陽性轉(zhuǎn)化菌單菌落接種于5mL含Amp的LB培養(yǎng)基中，37。C過夜培養(yǎng)；以l:lOO的比例接種于含有Amp的新鮮LB液體培養(yǎng)基中(剩余的菌液置4t:暫時(shí)保存)；當(dāng)OD,達(dá)O.61.0時(shí)，濃度為1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.Ommol/LIPTG于37。C誘導(dǎo)培養(yǎng)46h;取lmL上述培養(yǎng)液于4°C12000rpm離心30sec，沉淀加ddH2080yL，加入等體積的2XSDS上樣Buffer，混勻，IO(TC加熱5min，進(jìn)行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳。觀察表達(dá)量最高時(shí)的IPTG濃度。5.凝膠的染色與脫色。用至少5倍體積的染色液浸泡凝膠，水平搖床室溫染色4h以上；將凝膠浸泡于脫色液中平緩搖動(dòng)48h，期間更換脫色液34次；脫色后將凝膠浸泡于水中。6.Westernblot檢測(cè)。6.1SDS-PAGE。a.裝板，置于灌膠架上，確保不泄漏。11b.確定凝膠濃度、體積，按照《分子克隆》中配方配制分離膠。c.加入TEMED后，立即注入玻璃板間隙中，并為濃縮膠留足夠空間(梳齒長約lcm)。在分離膠頂層加入適量去離子水。d.約15min聚合完成后，倒掉去離子水，用濾紙條盡量吸去凝膠頂端的殘存液體。e.配制濃縮膠，混勻后注入玻璃板間隙，插入梳齒，避免混入氣泡，垂直放置于室溫下15min。f.在濃縮膠聚合的同時(shí)，將樣品蛋白與加樣緩沖液混勻，10(TC，煮沸3min。g.濃縮膠聚合后，拔出梳齒，用濾紙條吸去梳孔中的氣泡。將凝膠放入電泳槽中，上下槽均加入電泳緩沖液，檢查是否泄漏。按次序上樣，加條帶適宜的蛋白質(zhì)分子量Markeroh.電泳以恒壓80V電泳至蛋白樣品進(jìn)入分離膠，加大電壓至160V，待指示劑染料抵達(dá)分離膠底部切斷電源。取下凝膠，染色或進(jìn)行WesternBlot分析。6.2電轉(zhuǎn)移。a.戴手套，剪6張濾紙和一張PVDF膜，大小要與凝膠完全吻合。切左上角作標(biāo)記。b.將PVDF膜浸入100%甲醇中10sec;浸入去離子水中5min;浸入電轉(zhuǎn)液中l(wèi)Omin以上，同時(shí)將濾紙和多孔墊片浸入電轉(zhuǎn)液中。c.安裝電轉(zhuǎn)移裝置從正極(紅色)到負(fù)極(黑色)依次為多孔墊片-3張濾紙-PVDF膜-凝膠-3張濾紙-多孔墊片。放于電轉(zhuǎn)槽，浸入電轉(zhuǎn)液中。d.接通電源，條件為IOOV，150mA(結(jié)束時(shí)為IOOV，240mA)，lh;或者30V，40mA(結(jié)束時(shí)為30V，90mA)，過夜。6.3WesternBlot。a.取出PVDF膜，浸入10mL含5%脫脂奶粉的TBST中封閉，室溫振蕩lh，或4"過夜。b.將PVDF膜取出，浸入20mLTBST中，室溫振蕩漂洗。c.將適量的GST單抗溶于10mLTBST中，將PVDF膜浸入其中，室溫振蕩至少2h。d.20mLTBST室溫振蕩洗膜10min，重復(fù)三次。e.將適量HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗溶于10mLTBST中，將PVDF膜浸入其中，室溫振蕩lh。f.20mLTBST室溫振蕩洗膜10min，重復(fù)三次。[O1化]6.4顯色(使用HRP-DAB底物顯色試劑盒)a.取出PVDF膜，將PVDF膜浸沒于試劑A，B，C的等比混合液中。b.避光放置1030min。7.GST-IFNa1-THYa1目的蛋白分離純化。豬IFNa1-THYa1融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物的Westernblot分析見圖3。7.l發(fā)酵將含有pGEX4T-IFNa1-THYa1的大腸桿菌BL21(DE3)接種于5mL含Amp的LB培養(yǎng)基中，37t:過夜培養(yǎng)；以l:lOO的比例接種于lL含有Amp的新鮮LB液體培養(yǎng)基中。當(dāng)0D6。。達(dá)0.8時(shí)，以終濃度為1.Ommol/L的IPTG于37。C誘導(dǎo)培養(yǎng)4h。7.2破菌收集包涵體收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，8000rpm離心10min收集菌體，按10mL/g(V/W)將菌體細(xì)胞重懸于pH8.0的PBS緩沖液中，洗菌體一次，8000rpm離心lOmin收集菌體，按6mL/g(V/W)將菌體重懸于pH8.0的PBS緩沖液中，冰浴中超聲破菌。超聲條件為功率200W，超聲時(shí)間30sec，間隔時(shí)間60sec，全程工作時(shí)間為30min。超聲裂解液在4°C12000rpm離心30min，收集包涵體。7.3包涵體的處理7.3.l包涵體的洗滌每克包涵體加入約10mL的洗滌緩沖液，而后4。C攪拌2h，12000r/min離心20min后取上清和沉淀，用12%SDS-PAGE檢測(cè)洗滌效果。7.3.2包涵體的溶解沉淀重懸于2M10mL尿素中，于4t:12000rpm離心10min，收集沉淀，保留上清，用2M尿素再重懸沉淀于4t:12000rpm離心10min，收沉淀，此即包涵體，保留上清，8M尿素于4t:溶解包涵體，2.5h后，于4t:12000rpm離心20min，棄沉淀要上清，此即為溶解的包涵體，分裝后置于-7(TC冰箱備用。7.3.3重組蛋白的復(fù)性8M尿素溶解的包涵體離心上清按1:9(體積比)加復(fù)性液放于4t:復(fù)性20h。4°C12000rpm離心20min收集上清加濃HC1調(diào)pH至5.3，4。C放置2h，再加4MNaOH調(diào)pH至7.5，用2000mL10mMPBS(PH7.5)于4t:透析24h，中間更換兩次透析液。上SDS-PAGE觀察收率，-2(TC凍存?zhèn)溆谩?.4GST-IFNa1-THYa1融合蛋白的純化GST親和柱層析采用WaltersonGST-ResinKit，型號(hào)HG3022A。7.4.l裝柱將GST親和層析填料懸液上柱，用重力沉降法，裝柱前，安裝好層析柱，使之與水平面垂直，然后在柱內(nèi)加入蒸餾水或起始緩沖液，排出柱中"死體積"內(nèi)的氣泡，使柱內(nèi)液體為柱的1/51/3高度。用玻璃棒將處理好的填料制成粘稠狀的懸液，然后將其沿著玻璃棒或?qū)游鲋鼙诘谷胫鶅?nèi)，打開層析柱出口，控制流速1015cm/h，約10倍床體積的冷PBS洗柱床。7.4.2加樣及洗脫啟開上口橡皮塞及下口螺旋夾，使柱中液體緩慢滴出，當(dāng)柱面液體與柱面相切時(shí)，立即關(guān)閉出水口，以毛細(xì)滴管沿柱壁加入樣品(體積應(yīng)<床體積的2%，蛋白濃度以<100mg/mL為宜)。松開出水口螺旋夾使柱面樣品緩慢進(jìn)入柱內(nèi)，至與柱面相切時(shí)，立即關(guān)閉下口。樣品過柱后，用20倍床體積的冷PBS洗柱床(加蛋白酶抑制劑)。洗柱后用20倍床體積的洗脫液洗脫，流速1015cm/h。收集洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。8IFNal-THYa1目的蛋白純化8.l凝血酶酶切取上步蛋白純化液以5U/mL終濃度的凝血酶4。C酶切24h。8.2IFNal-THYa1目的蛋白精純按步驟2.5.4重復(fù)操作獲得IFNal-THYa1目的蛋白。8.3精純目的蛋白濃度測(cè)定以華特生ProteinAssay試劑盒測(cè)定目的蛋白含量，方法如下(1)準(zhǔn)備工作液。取一干凈的三角燒瓶，取一份5X濃縮液，加入4份蒸餾水(例如4mL5X濃縮液+1611^蒸餾水=20mLIX工作液)混勻，再用試劑盒里面的濾紙過濾。每個(gè)樣需要5.0mL，故可以根據(jù)實(shí)際需要來配置工作液體積，所配置的工作液放室溫一星期內(nèi)可以保持穩(wěn)定。(2)按表8-1配備標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液(2mg/mLBSA貯備液由華特生公司提供)。表8-l蛋白測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制加入BSA(2mg/mL)的量(pL)加入的稀釋液的量(pL)終濃度Og/mL)300(貯備液)3001000(A)375(A)125750(B)300(B)150500(C)250(C)250250(D)250(D)250125(E)250(E)25062.5(F)250(F)25031.25(G)(3)取O.lmL標(biāo)準(zhǔn)BSA液(每個(gè)梯度一管)加入試管，同時(shí)以0.lmL生理鹽水為空白對(duì)照。向每管中加入5.OmL工作液，混勻后2min既可測(cè)定。(4)在595nm波長處比色測(cè)定，空白管調(diào)零，讀取吸光值。(5)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(6)取O.lmL樣品，按上述方法測(cè)出在595nm處的吸光值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算其濃度為0.98mg/ml8.4目的蛋白濃縮將收集的目的蛋白洗脫液以PEG(麗6000)洗縮至所需體積，加入O.02^NaN3防腐劑，于4t:保存?zhèn)溆?。序列表個(gè)人申請(qǐng)--------------------街道西安大路城市長春省份吉林國別中國〈110〉姓氏劉〈110〉名字松材-------------------〈120〉名稱THY-a1〈130〉參考文獻(xiàn)THY-a1標(biāo)準(zhǔn)序列14〈213〉生物類型人工合成〈212〉類型DNA〈211〉長度84THY-a1〈400〉1TCGGATGCGGCGGTGGATACCTCGTCGGAAATAACCACCAAAGATCTAAAAGAAAAAAAA60GAAGTGGTGGAAGAAGCCGAAAAT84〈210〉2〈211〉45〈212>DNA〈213>人工合成〈220〉〈221〉引物〈222〉(1)(45)〈400>2atccaccgccgcatccgagccggctgcagcgcccaggtttctgga45〈210>3〈211>48〈212>DNA〈213〉人工合成〈220〉〈221〉引物〈222〉(1).(48)〈400>3ttttagatctttggtggttatttccgacgaggtatccaccgccgcatc48〈210>4〈211>60〈212>DNA〈213〉人工合成〈220〉〈221〉引物〈222〉(1)(60)〈400>4ccgctcgagtcaattttcggcttcttccaccacttcttttttttcttttegatctttggt60〈210>5〈211>27〈212>DNA〈213〉人工合成〈220〉〈221〉引物〈222〉(1).(27)<400>5ccgctcgagtcaattttcggcttcttc2權(quán)利要求一種豬用干擾素-胸腺肽廣譜抗病毒藥物制劑，其特征在于融合表達(dá)豬干擾素α1與胸腺肽α1蛋白，建立原核表達(dá)系統(tǒng)；所述的胸腺肽的氨基酸序列如下Ser1-Asp-Ala-Ala-Val5-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu10-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp15-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys20-Glu-Val-Val-Glu-Glu25-Ala-Glu-AsnIFNα1-THYα1之間的5肽Linker，其基因序列如下IT15’-atccaccgccgcatccgagccggctgcagcgcccaggtttctgga-3’；IT25’-ttttagatctttggtggttatttccgacgaggtatccaccgccgcatc-3’；IT35’-ccgctcgagtcaattttcggcttcttccaccacttcttttttttcttttagatctttggt-3’；IT45’-ccgctcgagtcaattttcggcttcttc-3’。2.權(quán)利要求1所述豬用干擾素_胸腺肽廣譜抗病毒藥物制劑的合成方法，包括以下步驟依據(jù)豬干擾素al(IFN-a1)和胸腺肽a1(THY-a1)的分子結(jié)構(gòu)特征及大腸桿菌密碼子的偏愛性設(shè)計(jì)引物，采用PCR方法獲得二者的融合基因；將該基因克隆至pGEX4T-2原核表達(dá)載體中，構(gòu)建pGEX4T-IFNal-THYa1原核表達(dá)質(zhì)粒；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)受體菌中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、表達(dá)、純化獲得IFNal-THYa1融合蛋白。3.權(quán)利要求1所述豬用干擾素_胸腺肽廣譜抗病毒藥物制劑的合成方法，包括如下步驟1)豬干擾素a1與胸腺肽a融合基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建(1)從豬全血基因組中擴(kuò)增干擾素a1基因；(2)人工合成豬胸腺肽a基因；(3)通過linker(連接肽)基將豬干擾素a1基因和胸腺肽a基因連接起來形成融合基因；(4)將融合基因克隆至pGEX4T-1表達(dá)載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒；(5)采用PCR、限制性酶酶切、序列測(cè)定等方法鑒定重組質(zhì)粒；2)融合蛋白的表達(dá)、純化及活性分析(1)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21宿主細(xì)胞感受態(tài)菌中，篩選陽性克隆菌；(2)蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定；(3)目的蛋白質(zhì)分離純化；(4)目的蛋白活性檢測(cè)。全文摘要本發(fā)明公開豬用干擾素-胸腺肽廣譜抗病毒藥物制劑及制備方法，依據(jù)干擾素α1(IFN-α1)和胸腺肽α1(THY-α1)的分子結(jié)構(gòu)特征及大腸桿菌密碼子的偏愛性設(shè)計(jì)引物，采用PCR方法獲得二者的融合基因。將該基因克隆至pGEX4T-2原核表達(dá)載體中，構(gòu)建了pGEX4T-IFNα1-THYα1原核表達(dá)質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)受體菌中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、表達(dá)、純化獲得IFNα1-THYα1融合蛋白。通過細(xì)胞病變抑制實(shí)驗(yàn)和E玫瑰花環(huán)形成實(shí)驗(yàn)對(duì)蛋白進(jìn)行生物活性檢測(cè)，結(jié)果表明IFNα1-THYα1融合蛋白具有雙重生物活性。文檔編號(hào)C12N15/62GK101721686SQ20091021777公開日2010年6月9日申請(qǐng)日期2009年10月21日優(yōu)先權(quán)日2009年10月21日發(fā)明者劉松財(cái),王佳申請(qǐng)人:吉林大學(xué)