專利名稱：一種快速鑒別5種家畜肉和肉干制品種類的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于線粒體12S rRNA基因440bp片段的遺傳變異，采用PCR-限 制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)，快速鑒定豬、山羊、黃牛、水牛、牦牛5種家畜肉類和 肉干制品種類的方法，屬于生物高技術(shù)領(lǐng)域。在動(dòng)物食品檢驗(yàn)檢疫、防止商業(yè)欺詐、建立食 品回溯追查系統(tǒng)方面具有重要的意義。
背景技術(shù)：
隨著人民生活水平的日益提高，我國肉類食品的產(chǎn)出量及消費(fèi)量都呈現(xiàn)出逐年增 加的趨勢(shì)。同時(shí)，由于消費(fèi)能力的增加和消費(fèi)習(xí)慣的改變，對(duì)健康綠色肉類食品的需求也大 大增加。而與此相對(duì)應(yīng)的是我國肉類食品加工及監(jiān)管環(huán)節(jié)水平嚴(yán)重落后，消費(fèi)市場不規(guī)范， 食品中原料肉摻雜摻假和以次充好的商業(yè)欺詐行為時(shí)有發(fā)生。另外，防止全球性的動(dòng)物疫 病通過食品進(jìn)口途徑傳入我國也已成為食品檢驗(yàn)檢疫相關(guān)部門迫切需要解決的問題，如防 止瘋牛病通過進(jìn)口牛肉傳入我國。我國是一個(gè)多民族國家，各宗教會(huì)有不同的肉類選擇標(biāo) 準(zhǔn)，因此肉類食品中的摻假行為也將對(duì)宗教文化造成深刻地影響。因此，建立一種快速、簡 單、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的家畜肉(包括肉干制品)種類鑒定方法在維護(hù)公共健康、防止商業(yè)欺詐、保 護(hù)民族信仰方面都具有重要意義。 RFLP是最早出現(xiàn)的DNA指紋技術(shù)之一，其原理是檢測(cè)DNA在限制性內(nèi)切酶消化后 形成的特定DNA片段電泳圖譜。不同的限制性內(nèi)切酶可識(shí)別并切割DNA分子中特定的位點(diǎn)， 一旦這些位點(diǎn)的堿基序列發(fā)生變化則不再被其相應(yīng)的酶所識(shí)別，同時(shí)非酶切位點(diǎn)也可以由 于堿基的突變而產(chǎn)生出一個(gè)新的識(shí)別位點(diǎn)。因此，凡是能引起酶切位點(diǎn)改變的突變和一般 DNA片段缺失所造成的酶切產(chǎn)物片段大小的改變，均可用來作為物種檢測(cè)的標(biāo)記。常用于家 養(yǎng)動(dòng)物肉種類鑒定的遺傳標(biāo)記主要來源于線粒體基因組，包括細(xì)胞色素b基因、控制區(qū)序 列、16S rRNA基因和12S rRNA基因。其中，12S rRNA基因由于具有較高的保守型，進(jìn)化速度 適中，一個(gè)較小的基因片段就同時(shí)包括了種間和種內(nèi)的遺傳信息，是常被采用的遺傳標(biāo)記。
經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見與本發(fā)明方法相同的公開報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速、簡單、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的鑒別5種家畜肉和肉干制品 種類的方法。 本發(fā)明基于線粒體12S rRNA基因440bp片段的遺傳變異，采用PCR-限制性片段 長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)，對(duì)豬、山羊、黃牛、水牛、牦牛5種家畜肉類及其肉干制品種類 進(jìn)行鑒定。 本發(fā)明方法通過同時(shí)擴(kuò)增豬、山羊、黃牛、水牛、牦牛5種家畜線粒體12S rRNA基 因440bp片段，分析該片段在物種間和種內(nèi)的核苷酸位點(diǎn)多態(tài)性信息，選擇Alul和Bfal兩 種限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，結(jié)果產(chǎn)生物種特異性的酶切片段電泳圖譜，實(shí)現(xiàn)對(duì)5 種家畜肉類及肉干制品種類的鑒定。本發(fā)明方法的具體步驟如下
(1)肉和肉干制品基因組DNA提取使用酚/氯仿法和鹽酸胍裂解法提取新鮮肉 及肉干制品中基因組DNA; (2)以步驟(1)提取的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)， PCR反應(yīng)引物擴(kuò)增引物上下游序列分別見序列表SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2 ;
PCR反應(yīng)體系:總體系為50ii L，包含lOOng基因組DNA， 10mM Tris-HCl(pH 8.3)， 2. 5mM MgCl2，50mM KC1， 10pM上下游引物，1U Taq聚合酶； PCR反應(yīng)程序:94。C，預(yù)變性4min ;94。C變性50s， 62。C退火50s， 72。C延伸60s，重 復(fù)30個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。 (3)PCR產(chǎn)物檢測(cè)取PCR產(chǎn)物2iiL在1.0%的瓊脂糖上電泳，電泳緩沖液為 1XTBE， 150V恒壓電泳5min，溴乙啶染色5分鐘，凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。
(4)限制性內(nèi)切酶消化10 ii L Alul內(nèi)切酶消化反應(yīng)體系，包括1 y L PCR反應(yīng)產(chǎn) 物，3U AluI，liiL酶切緩沖液；37t:酶切6小時(shí)。10 y L Bfal內(nèi)切酶消化反應(yīng)體系，包括 1 y L PCR反應(yīng)產(chǎn)物，3U Bfal， 1 y L酶切緩沖液;37。C酶切6小時(shí)。 (5)酶切產(chǎn)物分型取消化產(chǎn)物8 ii L在10 %的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，電泳緩沖 液為1XTBE， 120V恒壓電泳60min，溴乙啶染色10分鐘，凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。
(6)樣品鑒定根據(jù)酶切產(chǎn)物片段長度多態(tài)性電泳圖譜，各樣品的鑒定標(biāo)準(zhǔn)為
Alul內(nèi)切酶消化豬肉及其肉干制品，162bp和278bp ;山羊肉及其肉干制品， 200bp和240bp ;黃牛肉及其肉干制品，91bp和349bp ;水牛肉及其肉干制品，440bp ;牦牛肉 及其肉干制品，91bp和349bp。 Bfal內(nèi)切酶消化豬肉及其肉干制品，30bp、100bp和310bp，其中30bp在10%的 聚丙烯酰胺凝膠上較模糊；山羊肉及其肉干制品，130bp和310bp;黃牛肉及其肉干制品， 48bp、82bp和310bp ;水牛肉及其肉干制品，35bp、130bp和275bp ;牦牛肉及其肉干制品， 130bp和310bp。 本發(fā)明的方法具有快速、簡單、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，能在微量的新鮮組織和商品化 肉干產(chǎn)品中成功實(shí)施，且適合于在大規(guī)模樣本檢測(cè)中推廣應(yīng)用。該方法的建立在動(dòng)物食品 檢驗(yàn)檢疫、防止商業(yè)欺詐、建立食品回溯追查系統(tǒng)幾方面都具有重要意義。


圖1 :豬、山羊、黃牛、水牛、牦牛5種家畜線粒體12S rRNA基因PCR擴(kuò)增片段的 Alul內(nèi)切酶消化產(chǎn)物的電泳圖譜。其中泳道M為50bp的核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為未被酶 切PCR產(chǎn)物的陽性對(duì)照，泳道2-3為豬的樣本，泳道4-5為山羊的樣本，泳道6-7為黃牛的 樣本，泳道8-9為水牛的樣本，泳道10-11為牦牛的樣本。 圖2:豬、山羊、黃牛、水牛、牦牛5種家畜線粒體12S rRNA基因PCR擴(kuò)增片段的 Bfal內(nèi)切酶消化產(chǎn)物的電泳圖譜。其中泳道M為50bp的核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為未被酶 切PCR產(chǎn)物的陽性對(duì)照，泳道2-3為豬的樣本，泳道4-5為山羊的樣本，泳道6-7為黃牛的 樣本，泳道8-9為水牛的樣本，泳道10-11為牦牛的樣本。
具體實(shí)施方案 實(shí)施例1 :對(duì)豬、山羊、黃牛、水牛、牦牛5種家畜新鮮肉的鑒定
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1 、遺傳標(biāo)記選擇和弓I物設(shè)計(jì) 根據(jù)大量文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果，選擇線粒體12S rRNA基因作為鑒定豬、山羊、黃牛、水牛、 牦牛5種家畜肉種類的遺傳標(biāo)記。引物通用性好(引物核苷酸序列見序列表中SEQ ID No. 1 和SEQ ID No.2)，能同時(shí)用于擴(kuò)增不同物種，預(yù)測(cè)擴(kuò)增片段長度為440bp。引物由上海英俊 生物技術(shù)有限公司合成。
2、限制性內(nèi)切酶設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中報(bào)道的豬、山羊、黃牛、水牛、牦牛5種家畜線粒體12S rRNA基因 序列，使用Primer 5. 0軟件搜索限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，最終選擇Alul和Bfal兩種限制 性內(nèi)切酶，進(jìn)行PCR-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析。
3、樣本采集 采集經(jīng)過外貌鑒定的豬、山羊、黃牛、水牛、牦牛5種家畜的新鮮肉樣本，每個(gè)物種 采集2個(gè)個(gè)體。 4 、樣品基因組DNA提取 使用酚/氯仿法提取新鮮肉中基因組DNA。 5、PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系總體系為50 ii L，包含100ng基因組DNA， 10mM Tris-HCl (pH 8. 3)， 2. 5mM MgCl2，50mM KC1， 10pM上下游引物，1U Taq聚合酶；PCR反應(yīng)程序94t:，預(yù)變性4min ;94。C變性50s，62t:退火50s，72t:延伸60s，重 復(fù)30個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。
6、PCR產(chǎn)物檢測(cè) 取PCR產(chǎn)物2 ii L在1. 0%的瓊脂糖上電泳，電泳緩沖液為1 X TBE， 150V恒壓電泳 5min，溴乙啶染色5分鐘，凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。
7、Alul內(nèi)切酶消化 反應(yīng)體系總體系10iiL，包括liiL PCR反應(yīng)產(chǎn)物，3U Alul， 1 ii L酶切緩沖液。
反應(yīng)條件37t:酶切6小時(shí)。
8、Bfal內(nèi)切酶消化 反應(yīng)體系總體系10 ii L，包括1 ii L PCR反應(yīng)產(chǎn)物，3U Bfal， 1 ii L酶切緩沖液。
反應(yīng)條件37t:酶切6小時(shí)。
9、酶切產(chǎn)物檢測(cè) 取消化產(chǎn)物8 ii L在10%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，電泳緩沖液為1 X TBE， 120V恒 壓電泳60min，溴乙啶染色10分鐘，凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照(圖1，圖2)。
10、酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)帶型 圖1為豬、山羊、黃牛、水牛、牦牛5種家畜線粒體12S rRNA基因PCR擴(kuò)增片段 Alul酶切產(chǎn)物電泳圖譜，其中泳道2-3為豬的樣本(162bp和278bp)，泳道4_5為山羊的 樣本(200bp和240bp)，泳道6_7為黃牛的樣本(91bp和349bp)，泳道8_9為水牛的樣本 (440bp)，泳道10-11為牦牛的樣本(91bp和349bp)。 圖2為豬、山羊、黃牛、水牛、牦牛5種家畜線粒體12S rRNA基因PCR擴(kuò)增片段Bfal 酶切產(chǎn)物電泳圖譜，其中泳道2-3為豬的樣本(30bp、 100bp和310bp)，泳道4-5為山羊的樣 本(130bp和310bp)，泳道6-7為黃牛的樣本(48bp、82bp和310bp)，泳道8—9為水牛的樣本(35bp、130bp和275bp)，泳道10-11為牦牛的樣本(130bp和310bp)。
實(shí)施例2 :對(duì)商品化牛肉干的鑒定 對(duì)商品化牛肉干鑒定的方法步驟基本同實(shí)施例1。不同之處在于 1、在超市采購標(biāo)注為牦牛或黃牛肉的牛肉干共8份，分為五香味、燒烤味、咖喱
味、香辣味和醬鹵味類型。 2、使用鹽酸胍裂解法提取牛肉干中基因組DNA。 3、當(dāng)使用AluI內(nèi)切酶消化時(shí)所有樣本均表現(xiàn)為兩條酶切帶型(91bp和349bp)，當(dāng) 使用Bfal內(nèi)切酶消化時(shí)其中4個(gè)樣本表現(xiàn)為兩條酶切帶型(130bp和310bp)，為牦牛肉； 剩余的4個(gè)樣本表現(xiàn)為三條酶切帶型(48bp、82bp和310bp)，為黃牛肉。序列表〈110〉中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所〈120〉 一種快速鑒別5種家畜肉和肉干制品種類的方法〈130〉說明書〈160>2〈170>PatentIn version 3. 3〈210>1〈211>26〈212>DNA〈213〉人工合成〈220〉〈221>primer_bind〈222〉 (1) (26)〈400>1caaactggga ttagataccc cactat〈210>2〈211>20〈212>DNA〈213〉人工合成〈220〉〈221>primer_bind〈222〉 (1) (20)〈400>2g3gggtg3CgggCggtgtgt
權(quán)利要求
一種快速鑒別5種家畜肉類和肉干制品種類的方法，其特征在于本發(fā)明方法通過同時(shí)擴(kuò)增豬、山羊、黃牛、水牛、牦牛5種家畜線粒體12S rRNA基因440bp片段，分析該片段在物種間和種內(nèi)的核苷酸位點(diǎn)多態(tài)性信息，選擇AluI和BfaI兩種限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，結(jié)果產(chǎn)生物種特異性的酶切片段電泳圖譜，實(shí)現(xiàn)對(duì)5種家畜肉類及肉干制品種類的鑒定；本發(fā)明方法的具體步驟如下(1)使用酚/氯仿法和鹽酸胍裂解法提取新鮮肉及肉干制品中基因組DNA；(2)以新鮮肉及肉干制品中提取的基因組DNA為模板，采用已報(bào)道的PCR反應(yīng)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)體系總體系為50μL，包含100ng基因組DNA，10mM Tris-HCl(pH 8.3)，2.5mM MgCl2，50mM KCl，10pM上下游引物，1U Taq聚合酶；PCR反應(yīng)程序94℃，預(yù)變性4min；94℃變性50s，62℃退火50s，72℃延伸60s，重復(fù)30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；(3)PCR產(chǎn)物檢測(cè)取PCR產(chǎn)物2μL在1.0％的瓊脂糖上電泳，電泳緩沖液為1×TBE，150V恒壓電泳5min，溴乙啶染色5分鐘，凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照；(4)限制性內(nèi)切酶消化10μL AluI內(nèi)切酶消化反應(yīng)體系，包括1μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物，3U AluI，1μL酶切緩沖液；37℃酶切6小時(shí)。10μL BfaI內(nèi)切酶消化反應(yīng)體系，包括1μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物，3U BfaI，1μL酶切緩沖液；37℃酶切6小時(shí)；(5)酶切產(chǎn)物分型取消化產(chǎn)物8μL在10％的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，電泳緩沖液為1×TBE，120V恒壓電泳60min，溴乙啶染色10分鐘，凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照；(6)樣品鑒定根據(jù)酶切產(chǎn)物片段長度多態(tài)性電泳圖譜，各樣品的鑒定標(biāo)準(zhǔn)為AluI內(nèi)切酶消化豬肉及其肉干制品，162bp和278bp；山羊肉及其肉干制品，200bp和240bp；黃牛肉及其肉干制品，91bp和349bp；水牛肉及其肉干制品，440bp；牦牛肉及其肉干制品，91bp和349bp；BfaI內(nèi)切酶消化豬肉及其肉干制品，30bp、100bp和310bp，其中30bp在10％的聚丙烯酰胺凝膠上較模糊；山羊肉及其肉干制品，130bp和310bp；黃牛肉及其肉干制品，48bp、82bp和310bp；水牛肉及其肉干制品，35bp、130bp和275bp；牦牛肉及其肉干制品，130bp和310bp。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于線粒體12S rRNA基因440bp片段的遺傳變異，采用PCR-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)，鑒定豬、山羊、黃牛、水牛、牦牛5種家畜肉和肉干制品種類的方法，屬于生物高技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的鑒定方法包括樣本基因組DNA提取，PCR擴(kuò)增，限制性內(nèi)切酶消化，酶切產(chǎn)物檢測(cè)，及樣本鑒定的主要步驟。本發(fā)明的鑒定方法具有快速、簡單、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，能在新鮮肉類和商品化肉干樣本大規(guī)模檢測(cè)中應(yīng)用。該方法的建立在動(dòng)物食品檢驗(yàn)檢疫、防止商業(yè)欺詐、建立食品回溯追查系統(tǒng)幾方面都具有重要意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101712996SQ20091021833
公開日2010年5月26日 申請(qǐng)日期2009年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月14日
發(fā)明者劉益平, 姚永剛, 陳仕毅 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所