專利名稱：：一種誘導性多能干細胞及其制備方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于基因工程
技術領域：
，具體涉及一種誘導性多能干細胞及其制備方法。
背景技術：
：2006年，日本學者Yamanaka[1]首次報道，利用小鼠轉錄因子0ct4，Sox2，c_Myc，Klf4組合共同轉染小鼠體細胞，獲得了小鼠的誘導性多能干細胞(inductedpluripotentstemcells,iPSCs)。隨后，世界范圍內掀起了誘導多潛能干細胞的研究熱潮。從動物品種、轉錄因子種類和數量、轉錄因子組合方式以及外源基因導入方法等等很多方面都作了研究。2007年Yamanaka[2]又利用同樣的轉錄因子成功得到人類的iPS細胞；同年，Yu(俞君英)與Thomson^等人利用用另外四種轉錄因子(0ct3/4，Sox2，Nanog，Lin28)也成功得到人類iPS細胞。隨后有恒河猴[4]、大鼠[5]、豬[6]等動物iPS細胞成功的報道(Lietal.，2009;Liaoetal.，2009;Liuetal.，2008)。由于iPSCs與胚胎干細胞(ESCs)具有非常相似的生物學特性，所以在現有的iPSCs的建立過程中都借鑒了ES細胞的培養(yǎng)條件，例如應用ESCs的培養(yǎng)液，應用小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)作為飼養(yǎng)層來提供多種生長因子以維持iPSCs的多能性。但是，在家畜，例如豬、牛、羊等動物還沒有公認的建系的胚胎干細胞[7]，從早期胚胎中分離這些胚胎干細胞非常困難，而且培養(yǎng)體系沒有完全確定?，F有的胚胎干細胞培養(yǎng)條件，都是必須采用小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)作為培養(yǎng)層，才能維持ESCs處于未分化狀態(tài)。在ESCs培養(yǎng)體系中應用小鼠胚胎成纖維細胞，直接引入了異種動物細胞，這就直接影響了ESCs細胞的臨床應用，也增加了培養(yǎng)過程中的工作量與難度。自從1981年小鼠胚胎干細胞[8]與1998年人類胚胎干細胞[9]建系以來，至今已經過去了二十多年，可是家畜胚胎干細胞至今難以建系，則說明家畜要從早期胚胎材料分離獲得胚胎干細胞還存在著許多技術與理論上的制約因素。因此，利用轉錄因子轉染體細胞獲得牛iPS細胞具有重要的意義。參考文獻[l]Takahashi，K.，andYamanaka，S.(2006).Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefnedfactors.Cell126,663-676.[2]Takahashi，K.，Tanabe，K.，0h皿ki，M.，Narita，M.，Ichisaka，T.，Tomoda，K.，andYamanaka，S.(2007).Inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors.Cell131，861_872.[3]Yu，J.Y.，Vodyanik，M.A.，Smuga-0tto，K.，Antosiewicz-Bourget，J.，Frane，J丄，Tian，S.，Nie，J.，Jonsdottir，G.A.，Ruotti，V.，Stewart,R.，etal.(2007).Inducedpluripotentstemcelllinesderivedfromhumansomaticcells.Science318，1917-1920.[4]Liu，H.S.，Zhu，E.F.，Yong，J.，Zhang，P.B.，Hou，P.P.，Li，H.G.，Jiang，W.，Cai，J.，Liu，M.，Cui，K.，etal.(2008).GenerationofInducedPluripotentStemCellsfromAdultRhesusMonkeyFibroblasts.CellStemCell3，587—590.[5]Li，W.L，Wei，W.，Zhu，S.，Zhu，J.，Shi，Y.，Lin，T.，Hao，E.，Hayek，A.，Deng，H.，andDing，S.(2009).GenerationofRatandHumanInducedPluripotentStemCellsbyCombiningGeneticR印rogrammingandChemicalInhibitors(vol4，pg16,2009).CellStemCell4，370-370.[6]Esteban，M.A.，Xu，J.，Yang，J.，Peng，M.，Qin，D.，Li，W.，Jiang，Z.，Chen，J.，Deng，K.，Zhong，M.，etal.(2009).GenerationofInducedPluripotentStemCellLinesfromTibetanMiniaturePig.JournalofBiologicalChemistry284，17634-17640.[7]Keefer，C.L.，Pant，D.，Blomberg，L.，andTalbot，N.C.(2007).Challengesandprospectsfortheestablishmentofembryonicstemcelllinesofdomesticatedungulates.AnimalReproductionScience98,147—168.[8]Martin,G.R.(1981).Isolationofapluripotentcelllinefromearlymouseembryosculturedinmediumconditionedbytera_tocarcinomastemcells.ProcNatlAcadSciUSA78,7634-7638.[9]Thomson，J.A.，Itskovitz-Eldor，J.，Shapiro,S.S.，Waknitz，M.A.，Swiergiel，J.J.，Marshall,V.S.，andJones，J.M.(1998).Embryonicstemcelllinesderivedfromhumanblastocysts.Science282，1145-1147.
發(fā)明內容針對上述現有技術中存在的問題與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種誘導性多能干細胞(iPSCs)，該細胞在細胞集落形態(tài)、生長特性、干細胞表面標記、干性基因表達、主要干性基因啟動子序列區(qū)域甲基化模式、類胚體形成與體外分化能力、畸胎瘤形成能力，以及參與嵌合體形成等八個方面都與胚胎干細胞特性非常相似。實現上述發(fā)明目的技術方案是產生一種集落形態(tài)、生長特性、表面標志、體內外分化能力以及嵌合體形成都和胚胎干細胞特性非常相類似的誘導性多能干細胞(iPSCs)。本發(fā)明還有一個目的是提供上述誘導性多能干細胞(iPSCs)的制備方法，具體包括下列步驟1)牛皮膚成纖維細胞的分離與培養(yǎng)以成年牛皮膚成纖維細胞BDFs和新生牛皮膚成纖維細胞NDFs經常規(guī)培養(yǎng)分別獲得大量的成年牛皮成纖維細胞膚細胞和新生牛皮膚成纖維細胞；2)牛維持多能性基因轉錄因子的克隆及其逆轉錄病毒載體的構建從50-60日齡牛胎兒中分離生殖嵴，提取總RNA，經過逆轉錄反應得到cDNA;以cDNA為模板，經過PCR反應得到牛0ct4、Sox2與Nanog三個基因擴增產物并經測序驗證序列正確而后將目的基因插入到逆轉錄病毒載體pMSCVneo中，構建這3種基因的逆轉錄病毒表達載體；3)逆轉錄病毒的包裝與準備將PT67包裝細胞按照常規(guī)方法培養(yǎng)在含有15X胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，應用脂質體將構建的逆轉錄病毒質粒轉染進入包裝細胞PT67細胞；在應用脂質體包裝病毒顆粒前1小時，將包裝細胞PT67的培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)液，將4-8iig包含有轉錄因子基因的逆轉錄病毒質粒DNA和10-20ill脂質體分別加入到2份500illOpti-MEM-I+GlutaMAX-I轉染優(yōu)化液進行稀釋，輕輕混勻，室溫下孵育5分鐘，然后將含有脂質體lipofectamine2000的稀釋液緩慢滴入含有逆轉錄病毒質粒的稀釋液中，輕輕混勻，室溫下再孵育20分鐘，然后將上述混合液逐滴加入PT67包裝胞培養(yǎng)皿中；轉染24小時后，每24小時更換含有病毒顆粒培養(yǎng)液一次，連續(xù)3天，收集病毒懸浮液，在4t:條件下經25000轉/分離心90分鐘后，10倍濃縮病毒上清液；將包含有0ct4、Sox2與Nanog三個基因病毒上清液進行等量混合，并加入8iig/mlPolybrene組成特定的三因子基因組合，_80°C保存?zhèn)溆茫?)逆轉錄病毒感染牛皮膚成纖維細胞以及牛的iPS細胞的獲得將成年牛皮膚成纖維細胞BDFs和新生公牛皮膚成纖維細胞NDFs按照常規(guī)方法培養(yǎng)在60mm塑料培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)皿中細胞生長到70-80%融合時將包含0ct4、Sox2和Nanog基因轉錄因子的逆轉錄病毒上清液混合液大約5ml，分別加入到成纖維細胞BDFs與NDFs培養(yǎng)皿中感染成纖維細胞；細胞長滿后培養(yǎng)皿后按l:3常規(guī)傳代，視細胞生長情況在第6-10d將細胞以1乂105細胞/孔的密度，轉移至預先鋪有人羊膜(HAM)的6孔培養(yǎng)板上，用人羊膜代替小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)作為飼養(yǎng)層培養(yǎng)感染后的牛細胞，同時培養(yǎng)液更換成干細胞培養(yǎng)液；培養(yǎng)孔內每天半量換液，連續(xù)觀察20-28d，直到有細胞集落出現為止，記為0代，即為牛iPSCs細胞。所述的干細胞培養(yǎng)液組成為每100ml溶液中含有82.69ml的knockout-DMEM、15mlFBS、lml濃度為200mM谷氨酰胺、lml濃度為10mM非必需氨基酸、200yl濃度為55mM13-巰基乙醇、10ii1濃度為400ng/mL人重組堿性成纖維生長因子(bFGF)、100yl濃度為105U/ml白血病抑制因子(LIF)。牛iPSCs傳代時，應用0.05%trypsin+0.02%EDTA消化液消化，經過中和、離心與重懸再傳代至新的HAM支持物上，在37-381:，5%左右C02，飽和濕度條件下擴增培養(yǎng)，得到牛iPS細胞株。牛iPSCs每隔3-5天傳代一次，目前已經傳代120天，超過25代。液氮凍存，解凍后生長活力較好，大約有80%-90%存活率。本發(fā)明獲得誘導性多能干細胞和其制備方法與現有技術相比，具有以下優(yōu)點1、本發(fā)明中應用自主克隆牛的3種維持干細胞多能性基因，通過干細胞逆轉錄病毒介導，誘導牛皮膚成纖維細胞，使其重編程為完全具有胚胎干細胞生物特性的牛iPSCs。2、本發(fā)明在培養(yǎng)條件中首次采用脫細胞后人羊膜作HAM為支持物代替小鼠胚胎成纖維細胞MEF來維持牛iPSCs體外增殖并長期保持未分化的多能性狀態(tài)，而且避免了應用小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)作為干細胞的飼養(yǎng)層所帶來的異種動物細胞污染問題。3、本發(fā)明采用基因誘導產生多能性干細胞的方法，不但解決了家畜特別是牛多能性干細胞難以獲得的技術難題，為其他動物干細胞建系提供了理論依據和實驗基礎。圖1成年母牛皮膚成纖維細胞(BDFs)50x顯微鏡圖。圖2新生公牛皮膚成纖維細胞(NDFs)50x顯微鏡圖。圖3PT67包裝細胞50x顯微鏡圖。圖4電鏡下逆轉錄病毒顆粒10萬倍電鏡圖。圖5集落堿性磷酸酶染色lOOx顯微鏡圖。圖6集落堿性磷酸酶染色200x顯微鏡圖。圖7SSEA-1明視野顯微鏡圖。圖8SSEA-1染色(+++)顯微鏡圖。圖90ct4明視野顯微鏡圖。[OO39]圖100ct4染色(+++)顯微鏡圖。圖11囊腔樣類胚體結構顯微鏡圖。圖12代表外胚層細胞系的13III-Tubulin染色陽顯微鏡圖。圖13代表中胚層細胞系的a-actin染色陽性顯微鏡圖。圖14代表內胚層細胞系的甲胎蛋白(a-fetoprotein)染色陽性顯微鏡圖。圖15腺體樣結構(內胚層)400x顯微鏡圖。圖16骨骼肌結構(中胚層)400x顯微鏡圖。圖17原始神經元結構(外胚層)400x顯微鏡圖。圖18EB的RT-PCR檢測結果凝膠電泳圖。圖19嵌合體小鼠(雌雄各一只)各組織檢測的PCR結果凝膠電泳圖。具體實施例方式以下通過申請人給出的具體獲得牛iPSCs的方法及經過多種試驗證明它在集落形態(tài)、生長特性、表面標志、體內外分化能力以及嵌合體形成等諸多方面都具有與胚胎干細胞完全一致的生物學特性。實施例1牛皮膚成纖維細胞的分離與培養(yǎng)成年牛皮膚成纖維細胞(bovinedermalfibroblasts,BDFs)來自成年雌性Holstein奶牛耳緣皮膚。將組織清洗消毒后剪成細小組織塊，在常規(guī)培養(yǎng)條件下，用含15%-20%胎牛血清(FBS)(Gibco公司產品)的高糖DMEM(Gibco公司產品)中培養(yǎng)。每2-3d換養(yǎng)液1次，7-10d后就有成纖維細胞從組織塊邊緣移出，12-16d后大量成纖維細胞緊密排布于組織塊周圍。用胰蛋白酶與EDTA溶液消化后傳代，即獲得大量的成年牛成纖維細胞皮膚細胞，見圖l。新生公牛皮膚成纖維細胞(newbornbovinedermalfibroblast,NDFs)來自Holstein品種新生公牛耳緣皮膚，見圖2，分離和培養(yǎng)方法與上述母牛皮膚成纖維細胞方法相同。為了保證細胞活力，本發(fā)明采用26代以內的細胞作為誘導前靶細胞。實施例2牛維持多能性關鍵基因轉錄因子的克隆及其逆轉錄病毒載體的構建從50-60日齡荷斯坦品種奶牛(Holstein)的胎兒體內分離生殖嵴，組織勻漿后用TRIzolLSReagent提取總RNA，經過DNaseI(RNasefree)處理以除去基因組DNA污染。經反轉錄反應得到cDNA。然后以cDNA為模板，分別經PCR擴增0ct4，Sox2和Nanog三種轉錄因子基因開放性閱讀框(0RF)全序列，其序列見序列表l，基因克隆所用引物序列見表1所示。表1擴增牛0ct4，Sox2和Nanog3個基因的引物7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>其中0ct4基因PCR擴增的擴增參數是94。C預變性5min，94。C變性45sec，60。C退火45sec，72t:延伸lmin，循環(huán)35次，72"C再延伸10min，預期PCR產物長度應為1083bp;Sox2基因的擴增參數是94。C預變性5min，94。C變性45sec，54。C退火30sec，72。C延伸lmin，循環(huán)35次，72t:再延伸10min，預期PCR產物長度應為963bp;Nanog基因擴增參數為94。C預變性4min，94。C變35s，58。C退火lmin，72。C延伸lmin，共35個循環(huán)，72t:再延伸10min，預期PCR產物長度應為903bp;上述PCR產物各取5iil，在1%瓊脂糖凝膠電泳以鑒定其大小，剩余PCR產物-2(TC保存。電泳檢測結果顯示，PCR擴增產物長度與預期奶牛3種轉錄因子基因大小完全一致，符合試驗設計要求。然后將3種PCR產物剩余部分分別經過DNA片段GelExtractionkit純化、回收；回收產物與克隆載體pMD18-T以solutionI混合連接，16°C連接過夜。將連接產物轉化入感受態(tài)細胞TGI內進行克隆。經含Ampicillin(80iig/ml)、X-gal與IPTG的LB平板上37。C篩選培養(yǎng)14-16小時。從3種培養(yǎng)物中分別挑取6_10個白色菌落接種含氨芐青霉素(Ampicillin)的LB培養(yǎng)液中小量搖菌，并按照質粒抽提試劑盒說明書步驟抽提微量質粒。包含0ct4，Sox2和Nanog3種基因的質粒經過雙酶切、單酶切和質粒PCR鑒定。其中質粒經過Bgl1I+EcoRI雙酶切和EcoRI單酶切以及質粒PCR鑒定，以獲得pMD-18T-0ct4和pMD-18T-Sox2二種質粒陽性克隆。由于引物中引入的內切酶種類不同，包含Nanog基因的質粒經過H即I+Bgl11雙酶切和Bgl11單酶切以及質粒PCR鑒定，以獲得pMD-18T-Nanog質粒陽性克隆。選送鑒定結果為陽性的質粒到生物公司測序。測序結果應用DNAstart7.10軟件與GenBank中參考序列進行同源性比較分析。分析結果表明，0ct4，Sox2和Nanog的基因序列與參考序列同源性分別為99.4%，99.9%，100%。將上述測序正確的pMD-18T-0ct4與pMD-18T-Sox2二種質?；厥占兓笈c逆轉錄病毒pMSCVneo載體分別經過BglII+EcoRI雙酶切；質粒pMD-18T-Nanog與逆轉錄病毒經過BglII+H即I雙酶切，然后純化與回收酶切后的3種目的基因片段和線性化pMSCVneo質粒載體。將線性化的反轉錄病毒載體pMSCVneo與回收的目的片段應用DNALigationKitVersion2.0在16。C連接過夜，14-16小時后，連接產物轉化入JM109感受態(tài)細胞，經過氨芐青霉素(Ampicillin，50iig/mL)LB平板上篩選出逆轉錄病毒質粒的陽性克隆。從3個培養(yǎng)物板中，每一種重組質粒分別挑取6-10個菌落小量搖菌，微量方法提取重組的逆轉錄病毒質粒。經過BglII+EcoRI(或者應用Bgl1I+H即I適合于Nanog基因)雙酶消化鑒定、質粒PCR擴增鑒定及測序分析鑒定。三種重組逆轉錄病毒質粒經過雙酶切后，都可以獲得已知大小的目的基因片段與逆轉錄病毒載體片段，說明本發(fā)明所構建的重組逆轉錄病毒表達載體結構正確。通過測序檢測，所有重組逆轉錄病毒質粒中所包含的3個目的基因的序列與PCR擴增序列完全一致，也與GenBank中參考序列完全一致，表明在本發(fā)明中所構建得3種重組逆轉錄病毒質粒過程中目的基因沒有發(fā)生閱讀框的移碼和堿基突變等情況，說明所應用的3中基因序列完全正確。本發(fā)明中所構建的3種重組逆轉錄病毒表達載體分別命名為pMSCV-0ct4，pMSCV-Sox2，pMSCV-Nanog。實施例3逆轉錄病毒的包裝與準備PT67包裝細胞按照常規(guī)方法培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中，待細胞達到70%-80%匯合時，應用脂質體將逆轉錄病毒載體轉染進入包裝細胞PT67細胞，進行病毒包裝以獲得具有感染性逆轉錄病毒顆粒。轉染前1小時，將含有胎牛血清的匿EM培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)液，4-8iig逆轉錄病毒質粒DNA和10-20iil脂質體分別加入到500ylOpti-MEM-I+GlutaMAX-I(Gibco公司產品)優(yōu)化轉染液中，輕柔混勻，室溫孵育，然后將稀釋的質粒DNA和脂質體輕柔混勻，再室溫孵育20分鐘后，將混合液逐滴加入PT67細胞培養(yǎng)皿中。細胞在37°C，5%C02和飽和濕度條件下培養(yǎng)4-6小時后，轉染液換成新的含15%FBS的DMEM培養(yǎng)液。經過24小時轉染后，收集PT67細胞培養(yǎng)液上清，該上清中就包含感染性逆轉錄病毒顆粒。上清液經過0.45ym孔徑的濾膜過濾。每24h收集一次，連續(xù)收集3d。病毒懸浮液在fC條件下，經過25，000轉/分，離心90分鐘，10倍濃縮病毒上清液。將包含有0ct4，Sox2，Nanog三種基因病毒上清液進行等量混合，并添加8yg/mlPolybrene組成特定的三因子基因組合，-S(TC保存，準備轉染牛皮膚成纖維細胞。實施例4逆轉錄病毒感染牛皮膚成纖維細胞以及牛的iPS細胞的獲得及傳代成年母牛的耳緣皮膚成纖維細胞(BDFs)和新生犢牛皮膚成纖維細胞(NDFs)，兩種細胞均在病毒感染的前1天，把2X105個細胞接種于60mm培養(yǎng)皿。培養(yǎng)24小時后，一般細胞會有70-80%融合，將含有0ct4、Sox2和Nanog三個基因的逆轉錄病毒上清混合液分別加入成纖維細胞BDFs與NDFs培養(yǎng)皿中感染成纖維細胞；細胞長滿培養(yǎng)皿后按1:3常規(guī)傳代，視細胞生長情況在第6-10d將細胞以1X105細胞/孔的密度，轉移至預先鋪有人羊膜(HAM)6孔培養(yǎng)板上，用HAM代替MEF作為飼養(yǎng)層培養(yǎng)感染后的牛細胞，同時培養(yǎng)液更換成干細胞培養(yǎng)液；培養(yǎng)孔內每天半量換液，連續(xù)觀察20-28d，直到有ES細胞樣集落出現記為0代，即為牛iPS細胞。牛iPSCs傳代時，應用0.05%trypsin+0.02%EDTA消化液消化，經過中和、離心與重懸再傳代至新的HAM支持物上，在37-381:，5%左右C02，飽和濕度條件下擴增培養(yǎng)，得到牛iPS細胞株。牛iPSCs每隔3-5天傳代一次，目前已經傳代120天，超過25代。液氮凍存，解凍后生長活力較好，大約有85%-90%存活率。干細胞培養(yǎng)液組成為每100ml溶液中含有82.69ml的knockout-DMEM、15mlFBS、lml濃度為200mM谷氨酰胺、lml濃度為10mM非必需氨基酸、200iil濃度為55mMP-巰基乙醇、10ii1濃度為400ng/mL人重組堿性成纖維生長因子(bFGF)、100y1濃度為105U/ml白血病抑制因子(LIF)。試驗例1建立的牛iPS細胞系的鑒定為了鑒定本發(fā)明中所建立的牛誘導性多能干細胞(bovineinducedpluripotentstemcells,iPSCs)與傳統(tǒng)意義上胚胎干細胞具有非常類似的生物學特性，發(fā)9明人在多個不同方面設計鑒定本發(fā)明所建立的牛的iPS細胞，1.作為靶細胞奶牛皮膚成纖維細胞形態(tài)，見圖1-2。2.PT67包裝細胞與包裝后的逆轉錄病毒顆粒形態(tài)，見圖3-4。3.iPSCs集落形態(tài)與AP染色陽性(紅色)鑒定，見圖5-6。4.iPSCs集落的免疫熒光細胞化學染色鑒定，見圖7-10。5.類胚體的形成于體外分化鑒定。利用牛iPSCs體外懸浮培養(yǎng)7天后就可以形成多個球形和囊腔樣類胚體(EmbryoidBody，EB)結構，見圖11，其中A顯示為球形的類胚體結構，B顯示的是囊腔樣類胚體結構。利用牛iPSCs形成的類胚體(EB)，再經過貼壁培養(yǎng)14-21天，并通過添加誘導培養(yǎng)基的方法使其定向分化，形成代表3個胚層的不同細胞形態(tài)。3個胚層代表細胞系，見圖12-14示。6.畸胎瘤形成與三個胚層細胞的分化將牛iPSCs(大約1.3X1()6細胞)注射到裸鼠皮下，經過6-9周時間聚會在裸鼠注射部位皮下形成腫瘤，即為畸胎瘤?；チ鲋苽涑山M織切片，經過H.E.染色后顯微鏡觀察，可以觀察到三個胚層細胞形態(tài)同時存在畸胎瘤中，觀察結果如下圖15-17所示(箭頭)，說明牛iPSCs具有發(fā)育的全能性。另外，對畸胎瘤組織提取總RNA，應用三個胚層代表性基因引物進行RT-PCR檢測，結果也顯示了三個胚層細胞的存在，也說明所建立的牛iPSCs具有發(fā)育多能性。類胚體三個胚層細胞代表基因的RT-PCR檢測結果見圖18，圖中泳道1:P-Actin為內參；泳道2:Nestin，泳道3:P-tubulin(外胚層);泳道4:GATA4，泳道5:Actinalpha2(中胚層)；泳道6:Keratin-14，泳道7:PDX-1，泳道8:AFP(內胚層)，所用引物見表2。表2.檢測分化細胞代表基因PCR所用引物<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>試驗例2利用牛iPSCs建立"牛_小鼠"嵌合體把獲得的牛iPSCs其中一株，按照顯微注射的方法注射入小鼠的8-細胞胚胎或桑椹胚內，每個胚胎注射1215個牛iPS細胞，之后移植到假孕鼠的子宮。共注射115枚胚胎，移植給5只假孕鼠，其中一只妊娠，生下6只小鼠。根據牛的線粒體DNA的D-L00P高變區(qū)序列設計引物，對其中兩只新生小鼠(雌雄各一只)進行線粒體DNA的D-L00P高變區(qū)PCR擴增檢測，結果證明嵌合有牛組織細胞的組織包括有心、肝、脾、肺、腎、血液、血管、睪丸(或卵巢)等多個組織，PCR產物凝膠電泳結果見圖23所示。證明這兩只新生小鼠不同組織器官中都嵌合有牛的細胞。試驗結果揭示了我們所建立的牛iPS細胞參與了牛-小鼠嵌合體的形成。當小鼠8-cel1胚胎中注射入牛iPS細胞制作嵌合體小鼠時，共出生嵌合體小鼠6只，但是，所生6只嵌合體小鼠全身白色皮毛，未發(fā)現有皮毛嵌合。PCR產物凝膠電泳圖19上部分1-17泳道代表嵌合雌性小鼠各組織檢測結果1心，2肝，3腦，4肺，5腎，6消化道，7肌肉，8脾，9脊髓，10卵巢，11胰腺，12血液，13皮膚(_)，14受體小鼠(_)，15普通小鼠(_)，16BDF細胞，17BDF-iPS0細胞。牛的線粒體DNA的D-L00P高變區(qū)PCR檢測結果凝膠電泳圖23下部分所示，圖中1-17泳道代表嵌合雄性小鼠各組織檢測結果1心，2肝，3腦，4肺，5腎，6消化道，7肌肉，8脾，9脊髓，10睪丸，11血液，12軟骨(-)，13皮膚(-)，14BDF細胞，15BDF-iPS0細胞，16受體小鼠(-)，17普通小鼠(-)。〈110〉西北農林科技大學〈120〉一種誘導性多能干細胞及其制備方法〈160>3〈210>1〈2H〉1083bp〈212>DNA〈213>0CT4〈400〉1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>權利要求一種誘導性多能干細胞(iPSCs)，其特征在于，該細胞集落形態(tài)、生長特性、表面標志、體內外分化能力以及嵌合體形成都和胚胎干細胞特性相類似。2.制備權利要求l所述誘導性多能干細胞(iPSCs)的方法，其特征在于，包括如下步驟1)牛皮膚成纖維細胞的分離與培養(yǎng)以成年牛皮膚成纖維細胞BDFs和新生牛皮膚成纖維細胞NDFs經常規(guī)培養(yǎng)分別獲得大量的成年牛皮膚成纖維細胞和新生牛皮膚成纖維細胞；2)牛維持多能性基因轉錄因子的克隆及其逆轉錄病毒載體的構建從50-60日齡牛胎兒中分離生殖嵴，提取總RNA，經過逆轉錄反應得到cDNA;以cDNA為模板，經過PCR反應得到牛0ct4、Sox2與Nanog三個基因擴增產物并經測序驗證序列正確而后將目的基因插入到逆轉錄病毒載體pMSCVneo中，構建這3種基因的逆轉錄病毒表達載體；3)逆轉錄病毒的包裝與準備將PT67包裝細胞按照常規(guī)方法培養(yǎng)在含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，應用脂質體將構建的逆轉錄病毒轉染進入包裝細胞PT67細胞；將8iig含有0ct4、Sox2與Nanog三個不同基因的逆轉錄病毒表達載體質粒和3份20iil轉染試劑脂質體lipofectamine2000分別用500ii1Opti-MEM-I+GlutaMAX-I轉染優(yōu)化液進行稀釋，輕輕混勻，室溫下孵育5分鐘，然后將含有脂質體lipofectamine2000的稀釋液緩慢滴入含有逆轉錄病毒質粒的稀釋液中，輕輕混勻，室溫下再孵育20分鐘后，然后將上述混合液逐滴加入PT67包裝胞培養(yǎng)皿中；轉染24小時后，每天更換含有病毒顆粒培養(yǎng)液一次，連續(xù)3天，收集病毒懸浮液，在4°C條件下經25000轉/分離心90分鐘后，10倍濃縮病毒上清液；將含有0ct4、Sox2與Nanog三個基因病毒上清液進行等量混合，并加入8iig/mlPolybrene組成特定的三因子基因組合，-S(TC保存?zhèn)溆茫?)逆轉錄病毒感染牛皮膚成纖維細胞以及牛的iPS細胞的獲得將成年牛皮膚成纖維細胞BDFs和新生公牛皮膚成纖維細胞NDFs按照常規(guī)方法培養(yǎng)在60mm塑料培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)皿中細胞生長到70-80%融合時將包含0ct4、Sox2與Nanog基因轉錄因子的逆轉錄病毒上清液混合液5ml分別加入到成纖維細胞BDFs與NDFs培養(yǎng)皿中感染成纖維細胞；細胞長滿培養(yǎng)皿后按1:3常規(guī)傳代，視細胞生長情況在第6-10d將細胞以1乂105細胞/孔的密度，轉移至預先鋪有人羊膜(HAM)的6孔培養(yǎng)板上，用人羊膜代替小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)作為飼養(yǎng)層培養(yǎng)感染后的牛細胞，同時培養(yǎng)液更換成特制的干細胞培養(yǎng)液；培養(yǎng)孔內每天半量換液，連續(xù)觀察20-28d，直到有細胞集落出現為止，記為0代，即為牛iPSCs細胞。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于在應用脂質體包裝病毒顆粒前1小時，將包裝細胞PT67的培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)液，4_8yg包含有轉錄因子基因的逆轉錄病毒質粒DNA和10-20ii1脂質體分別加入到兩份500y1Opti-MEM-I+GlutaMAX-I優(yōu)化轉染液中，輕柔混勻，室溫孵育，然后將稀釋的質粒DNA和脂質體輕柔混勻，再室溫孵育20分鐘后，將質粒_脂質體混合液逐滴加入PT67細胞培養(yǎng)皿中。4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的干細胞培養(yǎng)液的組成為每100ml溶液中含有82.69ml的knockout-DMEM、15mlFBS、lml濃度為200mM谷氨酰胺、lml濃度為10mM非必需氨基酸、200ii1濃度為55mMP-巰基乙醇UOy1濃度為400ng/ml人重組堿性成纖維生長因子、100iU濃度為105U/ml白血病抑制因子。全文摘要本發(fā)明公開了一種產生誘導性多能干細胞(iPSCs)方法，該干細胞利用轉錄因子轉染牛體細胞獲得的，具體包括下列步驟1)牛皮膚成纖維細胞的分離與培養(yǎng)；2)牛維持多能性基因轉錄因子的克隆及其逆轉錄病毒載體的構建；3)逆轉錄病毒的包裝與準備；4)逆轉錄病毒感染牛皮膚成纖維細胞以及牛的iPS細胞的獲得。本發(fā)明首次采用脫細胞后人羊膜作為支持物代替小鼠胚胎成纖維細胞來維持牛iPSCs體外增殖并長期保持未分化的多能性狀態(tài)。這種采用基因誘導產生多能性干細胞的方法，不但解決了家畜特別是牛多能性干細胞難以獲得的技術難題，而且還避免了應用鼠胚胎成纖維細胞作為干細胞的飼養(yǎng)層所帶來的異種動物細胞污染問題。文檔編號C12N15/867GK101735985SQ20091021898公開日2010年6月16日申請日期2009年11月16日優(yōu)先權日2009年11月16日發(fā)明者呂長榮,竇忠英,辛曉玲,陳冬梅申請人:西北農林科技大學