專利名稱：高通量可目視化人乳頭瘤病毒基因芯片快速分型檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于與基因檢測(cè)相關(guān)的領(lǐng)域，涉及一種高通量可目視化對(duì)人乳頭瘤病毒 (HPV)進(jìn)行快速分型檢測(cè)的方法，特別涉及一種可通過(guò)目視直接進(jìn)行信號(hào)判斷而無(wú)需昂貴 的信號(hào)檢測(cè)設(shè)備的經(jīng)濟(jì)型診斷方法。
背景技術(shù)：
宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤，死亡率僅次于乳腺癌，位于婦女癌癥死亡的第二 位。我國(guó)每年宮頸癌新發(fā)病例約13. 15萬(wàn)，占世界宮頸癌新發(fā)病例總數(shù)的28.8%。此外由 于條件限制而漏檢的疾患則遠(yuǎn)不止此數(shù)。所以，早期發(fā)現(xiàn)和治療是提高宮頸癌患者生存率 的關(guān)鍵。目前HPV還不能在體外培養(yǎng)，大多數(shù)HPV感染的患者沒有顯微鏡診斷的依據(jù)，另外 血清學(xué)檢測(cè)也不敏感，多數(shù)為陰性。因此檢測(cè)HPV感染主要依賴DNA序列的分子水平檢測(cè) 及分型(HPV基因組檢測(cè))。HPV病毒的各型基因序列與其生物學(xué)行為存在著高度相關(guān)性， 不同基因型的HPV具有不同的致病危險(xiǎn)性。HPV DNA的檢測(cè)和分型對(duì)了解相關(guān)病情、判斷預(yù) 后及指導(dǎo)治療具有重要價(jià)值，特別是對(duì)女性生殖道腫瘤的癌情預(yù)報(bào)具有重要意義。
基因芯片可以一次性對(duì)大量標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)分析，具有通量高、速度快、信息量大、 所需樣品少、污染少等特點(diǎn)，解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)操作繁雜、自動(dòng)化程度低、通量 低的缺點(diǎn)。其示蹤的探針有酶、熒光、放射性同位素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等，但是這些示蹤物質(zhì)普 遍都存在易失活，易污染的缺點(diǎn)。 目前用基因芯片檢測(cè)人乳頭瘤病毒的方法中，其示蹤的探針大多是酶、熒光、放射
性同位素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等，檢測(cè)結(jié)果不能通過(guò)肉眼直接看到，需要通過(guò)相應(yīng)的儀器檢測(cè)，
如熒光檢測(cè)儀等，這樣檢測(cè)的成本就大大增加，并且造成檢測(cè)步驟繁瑣等缺點(diǎn)。 膠體金作為一種新興的示蹤物具有易保存，無(wú)污染的優(yōu)點(diǎn)，膠體金最早應(yīng)用于免
疫細(xì)胞化學(xué)方面。隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，膠體金標(biāo)記技術(shù)也逐步發(fā)展成為研究基因
功能的重要手段。近年來(lái)，越來(lái)越多的科學(xué)家選擇膠體金來(lái)取代上述標(biāo)記物，美國(guó)西北大學(xué)
的Mirkin等報(bào)道了一系列在基因芯片上使用膠體金標(biāo)記核酸探針，通過(guò)銀染來(lái)提高檢測(cè)
信號(hào)，達(dá)到更高靈敏度的方法。 目前，尚未有將膠體金標(biāo)記核酸探針用于檢測(cè)人乳頭瘤病毒的方法中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高通量可目視化人乳頭瘤病毒(HPV)基因芯片快速 分型檢測(cè)方法，其解決了背景技術(shù)中人乳頭瘤病毒基因芯片檢測(cè)方法中由于示蹤的探針大 多是酶、熒光、放射性同位素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等，檢測(cè)結(jié)果不能通過(guò)肉眼直接看到，需要通過(guò) 昂貴的儀器檢測(cè)，檢測(cè)成本高的技術(shù)問(wèn)題。 本發(fā)明的原理是確定臨床常見的HPV病毒作為檢測(cè)對(duì)象，引用常用的通用引物 (GP5， GP6)，此通用引物根據(jù)病毒多種不同亞型的保守區(qū)域設(shè)計(jì)，可擴(kuò)增出短片斷(150bp 左右)PCR產(chǎn)物。依據(jù)每種短片斷PCR產(chǎn)物序列，篩選出多條高度特異、長(zhǎng)度相同、Tm值和G+CX含量接近的檢測(cè)探針，同時(shí)設(shè)計(jì)非限制性引物的反義鏈作為捕獲探針，檢測(cè)探針將固 定在醛基化修飾的片基上，制備成低密度30-mer寡核苷酸診斷基因芯片，捕獲探針經(jīng)巰基 化修飾后與膠體金鏈接。對(duì)已知或疑似HPV感染樣品組織進(jìn)行處理，通過(guò)不對(duì)稱PCR，獲得 大量與檢測(cè)探針和捕獲探針序列互補(bǔ)的ssDNA，通過(guò)樣本與探針的固液相體系雜交，經(jīng)銀染
使雜交結(jié)果足夠放大形成肉眼可見的顏色信號(hào)，可通過(guò)肉眼觀察或掃描儀記錄結(jié)果，從而 實(shí)現(xiàn)HPV目視化基因芯片檢測(cè)與分型。 以通用引物GP6的互補(bǔ)鏈作為捕獲探針，該探針的序列如下 5' -GAA TAT GAT TTA CAG TTT ATT TTT CTT TTT TTT TT-3' 在該捕獲探針的3'端做SH_C6修飾； (3. 2)用膠體金標(biāo)記經(jīng)SH_C6修飾的捕獲探針； (4)芯片雜交 取不對(duì)稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和經(jīng)膠體金標(biāo)記的捕獲探針置于芯片表面，放置雜交盒內(nèi)
進(jìn)行雜交反應(yīng)，反應(yīng)完畢后清洗芯片； [OO45] (5)銀染顯色 取銀顯影液均勻涂布在芯片雜交區(qū)域上，避光反應(yīng)后，沖洗掉顯影液，室溫離心甩
干后肉眼觀察，或用平面掃描儀對(duì)玻片進(jìn)行信號(hào)掃描，利用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 上述步驟(3. 2)捕獲探針的膠體金標(biāo)記，其具體實(shí)現(xiàn)方法是 (3. 2. 1)將經(jīng)SH_C6修飾的捕獲探針10D溶解在1ml雙蒸水中，取30ul加入1ml
膠體金(濃度約4nm)，室溫放置16小時(shí)； (3. 2. 2)加入500ul 0. 3M NaCl， 10mM PBS，再放置40小時(shí)，離心，棄上清，深紅色 沉淀用0. l麗aCl， 10mM PBS(pH7. 0)溶液洗滌，去除未標(biāo)記的寡核苷酸；
(3. 2. 3)洗滌后的深紅色沉淀經(jīng)14000rpm離心30min，然后用0. 3M NaCl， 10mM PBS (pH7. 0) 1ml重懸，4t:放置備用。 上述步驟(4)芯片雜交的具體實(shí)現(xiàn)方法是將不對(duì)稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，1X雜交液
和膠體金標(biāo)記的捕獲探針以i : 8 : i的體積比混合，取混合樣品置于芯片表面的雜交
盒內(nèi)52t:雜交45min;取出芯片，立即浸入洗液中清洗，最后常溫下將芯片離心甩干；所述 雜交液是pH7. O，O. 3M的PBS ;洗液是pH7. 0， 1. 2M的PBN， PBN成分是0. 3M NaN03和10mM PBS (pH7. 0)。 上述膠體金的粒徑為10士2nm，最大吸收峰在520nm。
上述步驟(1. 2)芯片點(diǎn)制的具體實(shí)現(xiàn)方法是 (1. 2. 1)片基處理用APTES溶液對(duì)片基進(jìn)行處理，再與戊二醛反應(yīng)，離心甩干經(jīng)
掃描后選取背景均一且背景值較低的醛基化片基，室溫干燥保存以備用； (1. 2. 2)芯片點(diǎn)樣用生物芯片點(diǎn)樣儀將檢測(cè)探針片段有序地按陣列設(shè)計(jì)打印在
片基上； (1. 2. 3)后處理將點(diǎn)制好的芯片干燥后封閉，封閉方法為將芯片放入1% BSA 中，42t:封閉lh，然后用0. lM的PBS清洗，室溫下快速甩干，4t:保存?zhèn)溆谩?
上述步驟(2. 2)待檢樣本先經(jīng)過(guò)預(yù)處理，具體實(shí)現(xiàn)方法是樣本用病毒裂解液裂 解后煮沸，離心，收集上清，上清液作為待檢液。 上述生物芯片點(diǎn)樣儀用晶芯smart arrayer 48生物芯片點(diǎn)樣儀為宜。 上述病毒裂解液的成分是10mM NaOH，O. 45% Tween-20，0. 45% Triton-100，調(diào)pH
至8.0。 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn) 1、該方法使用膠體金標(biāo)記核酸探針，通過(guò)銀染來(lái)提高金信號(hào)，可通過(guò)目視直接進(jìn) 行信號(hào)判斷，無(wú)需昂貴的信號(hào)檢測(cè)設(shè)備。 2、HPV分型檢測(cè)的基因芯片集成系統(tǒng)，能夠?qū)Ω腥綡PV病毒亞型進(jìn)行快速排查，檢
6測(cè)對(duì)象將涵蓋我國(guó)常見高發(fā)且危害嚴(yán)重的多種HPV亞型。通過(guò)對(duì)芯片的設(shè)計(jì)，達(dá)到一次試
驗(yàn)可檢測(cè)多個(gè)病人的高通量臨檢要求。 3、操作簡(jiǎn)便，省時(shí)。 4、靈敏度高，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，準(zhǔn)確性好。 5、該方法可廣泛用于臨床診斷和女性體檢，還可用于宮頸癌、濕疣等疾病的早期 篩查，對(duì)于HPV的臨床診斷和宮頸癌的早期預(yù)防有重要的意義。


圖1為目視化芯片陣列示意圖。其中圖l(a)為HPV芯片整體圖，共設(shè)計(jì)八個(gè)雜交 區(qū)域可同時(shí)檢測(cè)八個(gè)樣本；圖l(b)為左圖單個(gè)區(qū)域的放大圖，區(qū)域探針設(shè)計(jì)為6X5的陣 列，其中，A1， A2為空白對(duì)照，A3， A4為HPV6探針，A5， A6為HPV11探針，B1，B2為HPV16探 針，B3，B4為HPV18探針，B5，B6為HPV31探針，C1，C2為HPV33探針，C3，C4為HPV35探針， C5，C6為HPV45探針，D1，D2為HPV51探針，D3，D4為HPV52探針；D5，D6為HPV53探針，E1， E2為HPV56探針，E3， E4為HPV58探針，E5， E6為陽(yáng)性質(zhì)控探針。 圖2是HPV 13亞型普通PCR產(chǎn)物鑒定結(jié)果圖。其中M為DNA Marker(DL2000) ;B 為陰性對(duì)照;LaneH3依次為:HPV 6， HPVll， HPV16， HPV18， HPV31， HPV33， HPV35， HPV45， HPV51， HPV52， HPV53， HPV56， HPV58PCR產(chǎn)物。 圖3是引物比例梯度不對(duì)稱PCR聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果圖。其中M為 DNAMarker(DL 2000);從左至右依次是引物(GP5/GP6)比例為l : l，l : 10， 1 : 20，
i : 40，i : 60，i : so，i : ioo的不對(duì)稱PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。 圖4是單一質(zhì)粒芯片雜交結(jié)果圖。圖中1號(hào)區(qū)域?yàn)镠PV18亞型雜交結(jié)果；2號(hào)區(qū) 域?yàn)镠PV16亞型雜交結(jié)果。 圖5是混合質(zhì)粒芯片雜交結(jié)果圖。圖中1，2區(qū)域均為HPV16， 18亞型混合雜交結(jié) 果。 圖6是臨床樣本芯片雜交結(jié)果圖。具體是臨床樣本1，2，3，4號(hào)的PCR雜交結(jié)果， 從圖中可以看出1號(hào)樣本為HPV16亞型感染，2號(hào)樣本為HPV16亞型感染，3號(hào)樣本為HPV6 亞型感染，4號(hào)樣本為HPV16亞型感染。 圖7是臨床樣本芯片雜交結(jié)果圖。具體是臨床樣本5， 6， 7， 8號(hào)的芯片雜交結(jié)果， 從圖中可以看出5號(hào)樣本沒有HPV病毒感染，6號(hào)樣本為HPV6亞型感染，7號(hào)樣本為HPV11 亞型感染，8號(hào)樣本為HPV6和11亞型混合感染。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明采用的高通量可目視化人乳頭瘤病毒基因芯片快速分型檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)步 驟如下 本發(fā)明制備芯片中的檢測(cè)探針和芯片點(diǎn)制均可采用公知技術(shù)。
(1)制備芯片
(1. 1)設(shè)計(jì)檢測(cè)探針 根據(jù)人乳頭瘤病毒的13種亞型設(shè)計(jì)檢測(cè)探針，探針序列如下
HPV 6 ATCCGTAACTACATCTTCCACATACACCAA
HPV11ATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAAHPV16GTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGAHPV18TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCAHPV31TGTTTGTGCTGCAATTGCAAACAGTGATACHPV33TTTATGCACACAAGTAACTAGTGACAGTACHPV35GTCTGTGTGTTCTGCTGTGTCTTCTAGTGAHPV45ACACAAAATCCTGTGCCAAGTACATHPV51AGCACTGCCACTGCTGCGGTTTCCCCAACAHPV52TGCTGAGGTTAAAAAGGAAAGCACATATAAHPV53TCTATGTCTACATATAATTCAAAGCAAATHPV56GTACTGCTACAGAACAGTTAAGTAAATATGHPV58ATTATGCACTGAAGTAACTAAGGAAGGTAC 上述序列從左至右為5' -3'，檢測(cè)探針的5'端均采用NH2_C6修飾； [OO92] (1.2)芯片點(diǎn)制 先進(jìn)行片基表面修飾處理，然后將檢測(cè)探針按照設(shè)計(jì)好的陣列固定在片基上，再 進(jìn)行芯片點(diǎn)樣后處理，得寡核苷酸芯片； 片基采用硅烷化玻片，參照實(shí)驗(yàn)室醛基化芯片片基制備的標(biāo)準(zhǔn)化操作方案，用 APTES溶液對(duì)片基進(jìn)行處理，再與戊二醛反應(yīng)，離心甩干經(jīng)掃描后選取背景均一且背景值較 低的醛基化片基，室溫干燥保存以備用； 用生物芯片點(diǎn)樣儀將檢測(cè)探針片段有序地按陣列設(shè)計(jì)打印在片基上；將點(diǎn)制好的 芯片干燥后封閉，封閉方法為將醛基化片基放入1% BSA中，42t:封閉lh，然后用0. 1M的 PBS清洗，室溫下快速甩干，fC保存?zhèn)溆谩?生物芯片點(diǎn)樣儀可以用晶芯smart arrayer 48生物芯片點(diǎn)樣儀。 [OO97] (2)待測(cè)樣本的處理 待檢樣本取已知或疑似病料樣品組織，該組織需要先經(jīng)過(guò)預(yù)處理，具體實(shí)現(xiàn)方法 是樣本用病毒裂解液裂解后煮沸，離心，收集上清，上清液作為待檢液。病毒裂解液裂是實(shí) 驗(yàn)室自制，其成分是10mM NaOH，O. 45% Tween_20，0. 45% Triton-100， pH調(diào)至8. 0。
(2. 1)引物的設(shè)計(jì)合成 設(shè)計(jì)合成與人乳頭瘤病毒病原對(duì)應(yīng)的引物，即通用引物GP5和GP6，序列如下
GP5—-5' -TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC-3'
GP6—5， -GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT C_3' [O103] (2. 2)制備不對(duì)稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 用引物對(duì)待檢樣本進(jìn)行不對(duì)稱PCR擴(kuò)增，生成不對(duì)稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，該產(chǎn)物是與寡 核苷酸探針特異性互補(bǔ)的單鏈DNA產(chǎn)物；
(3)膠體金標(biāo)記經(jīng)修飾的捕獲探針 [owe] (3. 1)設(shè)計(jì)合成捕獲探針 以通用引物GP6的互補(bǔ)鏈作為捕獲探針，該探針的序列如下 5' -GAA TAT GAT TTA CAG TTT ATT TTT CTT TTT TTT TT-3'在該捕獲探針的
3'端做SH-Ce修飾；
(3. 2)用膠體金標(biāo)記經(jīng)SH_C6修飾的捕獲探針，其具體實(shí)現(xiàn)方法是 (3. 2. 1)將經(jīng)SH_C6修飾的捕獲探針溶解在雙蒸水中，再加入膠體金，室溫放置16
小時(shí)； (3. 2. 2)加入PBS，再放置40小時(shí)，離心，棄上清，深紅色沉淀用PBS溶液洗滌，去 除未標(biāo)記的寡核苷酸； (3. 2. 3)洗滌后的深紅色沉淀經(jīng)離心后，用PBS重懸，4t:放置備用。 上述膠體金的粒徑為10士2nm，最大吸收峰在520nm處。膠體金可以是自制的也可
以購(gòu)買商品化的產(chǎn)品。 自制粒徑為10±2nm的膠體金的方法是 1)取250ml三角瓶，加入79ml雙蒸水和1ml 1%氯化金，預(yù)熱至60 70°C ;
2)取50ml燒杯，加入4ml 1X檸檬酸鈉，0.7ml 1X單寧酸，0.2ml 0.謹(jǐn)1(2(:03，混合 后加雙蒸水至20ml預(yù)熱至60 70°C 。 3)將上兩種溶液迅速混合并充分混勻，加熱至沸并保溫10分鐘，自然冷卻，制得 膠體金。4)制備的膠體金用透射電鏡掃描，可知粒徑在10士2nm且分散均勻。
(4)芯片雜交 將不對(duì)稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和經(jīng)膠體金標(biāo)記的捕獲探針置于芯片表面的雜交盒內(nèi)進(jìn) 行雜交反應(yīng)，反應(yīng)完畢后清洗； 芯片雜交的具體實(shí)現(xiàn)方法是將不對(duì)稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，1X雜交液和膠體金標(biāo) 記的捕獲探針以l : 8 : 1的體積比混合，取混合樣品置于芯片表面的雜交盒內(nèi)6(TC雜 交60min;取出芯片，立即浸入洗液中清洗，最后常溫下將芯片離心甩干；所述雜交液是 pH7. 0， 0. 3M PBS ;洗液是pH7. 0， 1. 2M的PBN。
(5)銀染顯色 將銀顯影液均勻涂布在芯片雜交區(qū)域上，避光反應(yīng)后，沖洗掉顯影液，室溫離心甩
干后肉眼觀察，或用平面掃描儀對(duì)玻片進(jìn)行信號(hào)掃描，利用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
驗(yàn)證試驗(yàn) 以HPV6， 11， 16， 18，31，33，35，45，51，52，53，56，58這13種質(zhì)粒為病毒模板，用本
發(fā)明的方法來(lái)驗(yàn)證試驗(yàn)分型檢測(cè)結(jié)果可通過(guò)目視直接進(jìn)行信號(hào)判斷。 該實(shí)驗(yàn)使用的材料是 病毒模板實(shí)驗(yàn)室擁有HPV6， 11， 16， 18，31，33，35，45，51，52，53，56，58 ;13種質(zhì) 粒。除HPV58型質(zhì)粒的宿主細(xì)胞為JM109夕卜，其余10型的宿主細(xì)胞均為DH5 a 。
主要試劑Taq DNA polymerse、dNTP均購(gòu)自天根公司；DNA MarkerDL2000均購(gòu)自 大連寶生物(TaKaRa)公司；BSA購(gòu)自Invitrogen公司；3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTES) 購(gòu)自Sigama公司，芯片玻片片基購(gòu)自美國(guó)Goldseal公司；封閉液(PBS緩沖溶液、BSA溶液、 0. 3M氯化鈉溶液)均為本實(shí)驗(yàn)室自配。 主要儀器Eppendorf 5415D微量高速離心機(jī)、Eppendorf 5804R高速冷凍離心 機(jī)、Mastercycler gradient基因擴(kuò)增儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；生物芯片點(diǎn)樣儀-晶芯艮 smart arrayer 48購(gòu)自北京博奧生物芯片有限公司；基因芯片掃描儀Gen印ix 4000B購(gòu)自 美國(guó)Axon公司；紫外分光光度儀8453購(gòu)自Agilent公司；UVP G800凝膠成像系統(tǒng)、雜交箱HL-2000均購(gòu)自美國(guó)UVP公司。















方法 檢測(cè) HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV HPV
探針由上海生工生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，序列如下
6 ATCCGTAACTACATCTTCCACATACACCAA 11 ATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAA 16 GTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGA 18 TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA 31 TGTTTGTGCTGCAATTGCAAACAGTGATAC 33 TTTATGCACACAAGTAACTAGTGACAGTAC 35 GTCTGTGTGTTCTGCTGTGTCTTCTAGTGA 45 ACACAAAATCCTGTGCCAAGTACAT
51 AGCACTGCCACTGCTGCGGTTTCCCCAACA
52 TGCTGAGGTTAAAAAGGAAAGCACATATAA
53 TCTATGTCTACATATAATTCAAAGCAAAT 56 GTACTGCTACAGAACAGTTAAGTAAATATG 58 ATTATGCACTGAAGTAACTAAGGAAGGTAC
上述探針從左至右為5' -3'，5'端均采用NH2-C6修飾。
參照實(shí)驗(yàn)室醛基化芯片片基制備的標(biāo)準(zhǔn)化操作方案，用APTES溶液對(duì)Goldseal硅 烷化玻片進(jìn)行處理，然后與戊二醛反應(yīng)，離心甩干經(jīng)掃描后選取背景均一且背景值較低的 醛基化片基，室溫干燥保存以備用。 HPV芯片設(shè)計(jì)為6X5的陣列(見圖1)，每個(gè)探針橫向重復(fù)打印2個(gè)點(diǎn)。陣列中 的A1，A2位點(diǎn)為空白對(duì)照(IX點(diǎn)樣緩沖液)，E5，E6為病毒檢測(cè)的陽(yáng)性質(zhì)控探針(根據(jù)人 P _球蛋白基因設(shè)計(jì)，序列為5' -CACAACTGTGTTCACTAGC-3')，起監(jiān)視體系的作用，其他點(diǎn)分 別代表待檢測(cè)病毒基因的檢測(cè)探針，從左到右依次為HPV6，11，16，18，31，33，35，45，51，52， 53， 56， 58亞型探針。 用晶芯smart arrayer 48生物芯片點(diǎn)樣儀將探針片段有序地按陣列設(shè)計(jì)打印。將 點(diǎn)制好的芯片12(TC干烤2h后，進(jìn)行封閉，用以封閉芯片上活躍的基團(tuán)從而雜交時(shí)減少非 特異性雜交。封閉方法為將醛基化玻片放入1% BSA中，42t:封閉lh，然后用0. 1M的PBS 清洗2次，室溫下600rpm 10min快速甩干，隨機(jī)抽取3張進(jìn)行掃描檢驗(yàn)封閉效果，之后4°C 保存?zhèn)溆谩?引物采用通用引物GP5—-5， -TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC-3'GP6—5' -GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT C_3' 同時(shí)設(shè)計(jì)GP6的反義鏈P1作為和膠體金連接的探針，即捕獲探針。PI—-5' -GAA TAT GAT TTA CAG TTT ATT TTT CTT TTT TTT TT-3' 為了能與膠體金連接在PI的3'端作SH_C6修飾。 單鏈DNA片段的制備 (l)普通PCR驗(yàn)證普通PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為25ul，含有5ul 10XPCR buffer，2ul 2. 5mmo1/LdNTP，2ul模板，20umol/L的GP5、GP6各0. 625ul，0. 5ulTaqDNA聚合酶(3U/ul)，加(1朋20至 終體積25ul。PCR反應(yīng)條件95。C 5min ;95。C 30s，43。C 30s，72。C 30s，35個(gè)循環(huán);72。C 5min。 收集PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，如圖2所示，從電泳結(jié)果可知各亞型擴(kuò) 增產(chǎn)物大小正確，符合所用這對(duì)通用引物之間的DNA片斷長(zhǎng)度150bp，無(wú)非特異性條帶出 現(xiàn)，同時(shí)設(shè)立的陰性對(duì)照未擴(kuò)增出任何條帶，證明反應(yīng)體系無(wú)污染。
(2)不對(duì)稱PCR弓|物比例的優(yōu)化 經(jīng)過(guò)對(duì)上述引物不對(duì)稱梯度實(shí)驗(yàn)后，我們選擇l : 20作為后期實(shí)驗(yàn)的引物比 例。PCR體系為Virus模板(50ng/ul)2ul、 10 x reaction buffer 5ul、 dNTP每禾中濃度為 2.5mM(dATP 0.5ul、dGTP 0.5ul、dCTP 0.5ul、dTTP 0. 3ul) 、 Primer :sense
primer (luM) 0. 625ul、 anti-sense (20uM)0. 625ul，兩者比例為1 : 20， Tag DNApolymerse(3U/L)0. 5ul，無(wú)菌水補(bǔ)至25ul。不對(duì)稱PCR反應(yīng)條件95。C 5min ;95。C 30s， 43°C 30s，72。C 30s，40個(gè)循環(huán)；72。C 5min。以HPV 16亞型為例，上下游引物(GP5/GP6)比例
依次為i : i，i : io，i : 20，i : 40，i : 60，i : 80，i : ioo做不對(duì)稱PCR，產(chǎn)物用12%
聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定結(jié)果如圖3所示，從圖中可以看出隨著上下游引物比例的降低，
單鏈產(chǎn)物和雙鏈產(chǎn)物都在減少。在i : io，i : 20時(shí)單鏈產(chǎn)物最多，因此后期選擇i : 20
作為不對(duì)稱PCR的引物比例。
膠體金標(biāo)記探針的制備 膠體金的制備 膠體金是按以下步驟制備的 (1)取250ml三角瓶，加入79ml雙蒸水和lml 1%氯化金，預(yù)熱至60 70°C ;
(2)取50ml燒杯，加入4ml 1X檸檬酸鈉，0.7ml 1X單寧酸，0.2ml 0.1MK2C03，M 合后加雙蒸水至20ml預(yù)熱至60 70°C 。 (3)將上兩種溶液迅速混合并充分混勻，加熱至沸并保溫10分鐘，自然冷卻，制得 膠體金。 探針的膠體金標(biāo)記 (1)將巰基探針10D溶解在200ul雙蒸水中，再取30ul加入到lml膠體金中，室溫 放置16小時(shí)； (2)加入500ul 0. 3M PBS，再放置40小時(shí)，隨后18000rpm離心45min，棄上清，深
紅色沉淀用0. 1M PBS溶液洗滌，去除未標(biāo)記的寡核苷酸； (3) 18000rpm離心30min，后用0. 3M PBS重懸。4。C放置備用。 芯片雜交 (1)雜交 將不對(duì)稱PCR樣品，1 X雜交液(0. 3M PBS， pH 7. 0)和膠體金標(biāo)記的捕獲探針以 1:8: l的體積比混合。取混合樣品至芯片表面，置于雜交盒內(nèi)52t:雜交。雜交時(shí)間45min
(2)芯片清洗取出芯片，立即浸入洗液I(O. 3M PBN， pH 7.0)中清洗2次，每次2min，常溫下將
芯片離心甩干。 (3)銀染顯色 將銀顯影液均勻涂布在芯片雜交區(qū)域上，避光反應(yīng)10min，沖洗掉顯影液，室溫離心甩干用平面掃描儀對(duì)玻片進(jìn)行信號(hào)掃描，利用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
單一質(zhì)粒芯片雜交結(jié)果 取HPV16， 18亞型質(zhì)粒的不對(duì)稱PCR產(chǎn)物與膠體金標(biāo)記探針?lè)磻?yīng)后，分別與芯片進(jìn) 行雜交，反應(yīng)完清洗后用銀染液染色。結(jié)果如圖4所示，芯片1號(hào)區(qū)域18亞型探針處顯示 特異性陽(yáng)性信號(hào)，其它位點(diǎn)無(wú)非特異性雜交；芯片2號(hào)區(qū)域16亞型探針處顯示特異性陽(yáng)性 信號(hào)，其它位點(diǎn)無(wú)非特異性雜交。
混合質(zhì)粒芯片雜交結(jié)果 將HPV16， 18亞型質(zhì)粒的不對(duì)稱PCR產(chǎn)物等量混合，加入膠體金標(biāo)記探針然后與芯 片雜交，清洗銀染后檢測(cè)。結(jié)果如圖5所示，芯片1，2區(qū)域16和18亞型探針處顯示有特異 性陽(yáng)性信號(hào)，其它位點(diǎn)無(wú)非特異性雜交。 通過(guò)上述驗(yàn)證試驗(yàn)可知本發(fā)明涉及的方法可快速、特異地對(duì)HPV進(jìn)行檢測(cè)與分
型，該方法適用于臨床檢測(cè)。 臨床樣本檢測(cè)試驗(yàn) 樣本由陜西省人民醫(yī)院提供的女性宮頸糜爛分泌物，用本發(fā)明的方法對(duì)該臨床樣 本進(jìn)行分型檢測(cè)。
(1)女性宮頸糜爛分泌物的處理方法 將分泌物的洗脫液12000g離心10min，棄去上清液，保留管底的細(xì)胞塊。向管中加 入50-100ul裂解液，振蕩懸浮沉淀，煮沸5-10min， 13000g離心10min，保留上清液做模板 用。 (2)不對(duì)稱PCR 取(1)中上清液，做不對(duì)稱PCR，擴(kuò)增體系為模板2ul， 10Xreactionbuffer(Mg2+f ree)2. 5ii L，MgCl2溶液2. 5ii L，dNTP四種組分濃度均為2. 5mM(dATP 0. 5ii L、dGTP 0. 5 ii L、 dCTP 0. 5iiL、dTTP 0. 5 ii L) ， GP5 (luM) 0. 625ul， GP6 (20uM) 0. 625ul，(上下游引物比例 為l : 20)， Tag DNA polymerse (3U/L) 0. 5ul，無(wú)菌水補(bǔ)至25ul 。循環(huán)為條件95。C 5min ; 95。C 30s，43。C 30s，72。C 30s，40個(gè)循環(huán)；72。C 5min。
(3)芯片雜交 將不對(duì)稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和經(jīng)膠體金標(biāo)記的捕獲探針置于芯片表面的雜交盒內(nèi)進(jìn) 行雜交反應(yīng)，反應(yīng)完畢后清洗； 芯片雜交的具體實(shí)現(xiàn)方法是將不對(duì)稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，1X雜交液和膠體金標(biāo)
記的捕獲探針以i : 8 : i的體積比混合，取混合樣品置于芯片表面的雜交盒內(nèi)52t:雜
交45min;取出芯片，立即浸入洗液中清洗，最后常溫下將芯片離心甩干；所述雜交液是pH 7. 0， 0. 3M的PBS ;洗液是pH 7. 0， 0. 3M的PBN。
(4)銀染顯色 將銀顯影液均勻涂布在芯片雜交區(qū)域上，避光反應(yīng)10min后，沖洗掉顯影液，室溫 離心甩干后肉眼觀察，用平面掃描儀對(duì)玻片進(jìn)行信號(hào)掃描，PCR產(chǎn)物芯片雜交結(jié)果如圖6和 圖7所示。圖6是臨床樣本1，2，3，4號(hào)的PCR雜交結(jié)果，從圖中可以看出1號(hào)樣本為HPV16 亞型感染，2號(hào)樣本為HPV16亞型感染，3號(hào)樣本為HPV6亞型感染，4號(hào)樣本為HPV16亞型感 染。 圖7是臨床樣本5，6，7，8號(hào)的芯片雜交結(jié)果，從圖中可以看出5號(hào)樣本為HPV6和11亞型混合感染，6號(hào)樣本為HPVll亞型感染，7號(hào)樣本為HPV6亞型感染，8號(hào)樣本沒有 HPV病毒感染。
權(quán)利要求
高通量可目視化人乳頭瘤病毒基因芯片快速分型檢測(cè)方法，其特征在于該方法的實(shí)現(xiàn)步驟包括(1)制備芯片(1.1)設(shè)計(jì)檢測(cè)探針根據(jù)人乳頭瘤病毒的13種亞型設(shè)計(jì)檢測(cè)探針，從左至右為5’-3’，探針序列如下HPV 6 5’-ATCCGTAACTACATCTTCCACATACACCAA-3’HPV 115’-ATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAA-3’HPV 165’-GTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGA-3’HPV 185’-TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA-3’HPV 315’-TGTTTGTGCTGCAATTGCAAACAGTGATAC-3’HPV 335’-TTTATGCACACAAGTAACTAGTGACAGTAC-3’HPV 355’-GTCTGTGTGTTCTGCTGTGTCTTCTAGTGA-3’HPV 455’-ACACAAAATCCTGTGCCAAGTACAT-3’HPV 515’-AGCACTGCCACTGCTGCGGTTTCCCCAACA-3’HPV 525’-TGCTGAGGTTAAAAAGGAAAGCACATATAA-3’HPV 535’-TCTATGTCTACATATAATTCAAAGCAAAT-3’HPV 565’-GTACTGCTACAGAACAGTTAAGTAAATATG-3’HPV 585’-ATTATGCACTGAAGTAACTAAGGAAGGTAC-3’檢測(cè)探針的5’端均采用NH2-C6修飾；(1.2)芯片點(diǎn)制先進(jìn)行片基表面醛基化修飾處理，然后將檢測(cè)探針按照設(shè)計(jì)好的陣列固定在片基上，再進(jìn)行芯片點(diǎn)樣后處理，得寡核苷酸芯片；(2)待檢測(cè)樣本的處理(2.1)引物的選用選用人乳頭瘤病毒病原對(duì)應(yīng)的引物，即通用引物GP5和GP6，序列如下GP5---5’-TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC-3’GP6---5’-GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT C-3’(2.2)制備不對(duì)稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用引物對(duì)待檢樣本進(jìn)行不對(duì)稱PCR，生成不對(duì)稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，該產(chǎn)物是與固定在芯片上的檢測(cè)探針特異性互補(bǔ)的單鏈DNA產(chǎn)物；(3)膠體金標(biāo)記經(jīng)修飾的捕獲探針(3.1)設(shè)計(jì)合成捕獲探針以通用引物GP6的互補(bǔ)鏈作為捕獲探針，該探針的序列如下5′-GAA TAT GAT TTA CAG TTT ATT TTT CTT TTT TTT TT-3′在該捕獲探針的3′端做SH-C6修飾；(3.2)用膠體金標(biāo)記經(jīng)SH-C6修飾的捕獲探針；(4)芯片雜交取不對(duì)稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和經(jīng)膠體金標(biāo)記的捕獲探針置于芯片表面，放置雜交盒內(nèi)進(jìn)行雜交反應(yīng)，反應(yīng)完畢后清洗芯片；(5)銀染顯色取銀顯影液均勻涂布在芯片雜交區(qū)域上，避光反應(yīng)后，去除多余的顯影液，室溫離心甩干后肉眼觀察，或用平面掃描儀對(duì)玻片進(jìn)行信號(hào)掃描，利用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量可目視化人乳頭瘤病毒基因芯片快速分型檢測(cè)方法，其特征在于(3. 2)捕獲探針的膠體金標(biāo)記，其具體實(shí)現(xiàn)方法是(3. 2. 1)將經(jīng)SH-C6修飾的捕獲探針10D溶解在lml雙蒸水中，取30ul加入1ml膠體 金，使?jié)舛葹?nm，室溫放置16小時(shí)；(3.2.2)加入500ul 0. 3M NaCl，10mM PBS，再放置40小時(shí)，離心，棄上清，深紅色沉淀 用0. 1M NaCl和pH7. 0， 10mM的PBS溶液洗滌，去除未標(biāo)記的寡核苷酸；(3. 2. 3)洗滌后的深紅色沉淀經(jīng)14000rpm離心30min，然后用0. 3M NaCl和pH 7. 0， 10mM的PBS lml重懸，4。C放置備用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量可目視化人乳頭瘤病毒基因芯片快速分型檢測(cè)方法， 其特征在于步驟(4)芯片雜交的具體實(shí)現(xiàn)方法是將不對(duì)稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，雜交液和膠體金標(biāo)記的捕獲探針以i : 8 : l的體積比混合，取混合樣品加在芯片表面置雜交盒內(nèi)52t:雜交45min;取出芯片，立即浸入洗液中清洗，最后常溫下將芯片離心甩干；所述雜交液是 pH7. O，O. 3M的PBS ;洗液是pH7. 0， 1. 2M的PBN， PBN成分是0. 3M NaN03和pH7. 0， 10mM的 PBS。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的高通量可目視化人乳頭瘤病毒基因芯片快速分型檢 測(cè)方法，其特征在于所述膠體金的粒徑為10士2nm，最大吸收峰在520nm處。<
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量可目視化人乳頭瘤病毒基因芯片快速分型檢測(cè)方法， 其特征在于(1. 2)芯片點(diǎn)制的具體實(shí)現(xiàn)方法是(1. 2. 1)片基處理用APTES溶液對(duì)片基進(jìn)行處理，再與戊二醛反應(yīng)，離心甩干經(jīng)掃描 后選取背景均一且背景值較低的醛基化片基，室溫干燥保存?zhèn)溆茫?1. 2. 2)芯片點(diǎn)樣用生物芯片點(diǎn)樣儀將檢測(cè)探針片段有序地按陣列設(shè)計(jì)打印在片基上；(1. 2. 3)后處理將點(diǎn)制好的芯片干燥后封閉，封閉方法為將芯片放入1% BSA中， 42t:封閉lh，然后用0. 1M的PBS清洗，室溫下快速甩干，4t:保存?zhèn)溆谩?br> 6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量可目視化人乳頭瘤病毒基因芯片快速分型檢測(cè)方法， 其特征在于(2. 2)待檢測(cè)樣本先經(jīng)過(guò)預(yù)處理，具體實(shí)現(xiàn)方法是樣本用病毒裂解液裂解后 煮沸，離心，收集上清，上清液作為待檢液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的高通量可目視化人乳頭瘤病毒基因芯片快速分型檢測(cè)方法， 其特征在于所述生物芯片點(diǎn)樣儀是晶芯smart arrayer 48生物芯片點(diǎn)樣儀。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的高通量可目視化人乳頭瘤病毒基因芯片快速分型檢測(cè)方法， 其特征在于病毒裂解液的成分是lOmM NaOH，O. 45% Tween_20，0. 45% Triton-100，調(diào)pH 至8.0。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高通量可目視化對(duì)人乳頭瘤病毒(HPV)進(jìn)行快速分型檢測(cè)的方法，該方法中使用膠體金標(biāo)記核酸探針，通過(guò)銀染來(lái)提高金信號(hào)，可通過(guò)目視直接進(jìn)行信號(hào)判斷，無(wú)需昂貴的信號(hào)檢測(cè)設(shè)備。操作簡(jiǎn)便，省時(shí)，靈敏度高，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，準(zhǔn)確性好。解決了目前檢測(cè)結(jié)果不能通過(guò)肉眼直接看到，需要通過(guò)相應(yīng)的儀器檢測(cè)的缺點(diǎn)。該HPV分型檢測(cè)的基因芯片集成系統(tǒng)，能夠?qū)Ω腥綡PV病毒亞型進(jìn)行快速排查，檢測(cè)對(duì)象將涵蓋我國(guó)常見高發(fā)且危害嚴(yán)重的多種HPV亞型。通過(guò)對(duì)芯片的設(shè)計(jì)，達(dá)到一次試驗(yàn)可檢測(cè)多個(gè)病人的高通量臨檢要求。該方法可廣泛用于臨床診斷和女性體檢，還可用于宮頸癌、濕疣等疾病的早期篩查，對(duì)于HPV的臨床診斷和宮頸癌的早期預(yù)防有重要的意義。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101792819SQ20091021953
公開日2010年8月4日 申請(qǐng)日期2009年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月17日
發(fā)明者黨二樂(lè), 黨倩麗, 李錚, 王小強(qiáng), 郭森, 陳超 申請(qǐng)人:陜西北美基因股份有限公司