專利名稱：重組副溶血弧菌鞭毛蛋白及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種操作簡便、成本低廉、重組蛋白
純度好、得率高、適應(yīng)于工業(yè)化生產(chǎn)的重組副溶血弧菌鞭毛蛋白及制備方法。
背景技術(shù)：
副溶血性弧菌是一種常見的革蘭氏陰性細(xì)菌，生存于近岸、河口和海洋環(huán)境中，該 弧菌屬條件致病性細(xì)菌，能夠感染多種養(yǎng)殖動物，如魚、蝦、鮑等，常造成大量死亡，給海水 養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。弧菌粘附于宿主細(xì)胞表面是對機(jī)體感染致病的先決條件，弧 菌的鞭毛蛋白在其粘附過程及對副溶血弧菌侵入宿主并有效發(fā)揮毒素等起著重要作用，毒 力實(shí)驗(yàn)表明副溶血弧菌鞭毛蛋白是魚類感染過程中的一個(gè)毒力細(xì)胞器。鞭毛不僅與運(yùn)動有 關(guān)，更重要的是在感染與免疫以及分類鑒定等方面發(fā)揮重要的作用，特別是免疫原性具有 重要的實(shí)際意義。研究表明，弧菌鞭毛蛋白不僅可以激發(fā)機(jī)體的體液免疫，還可以引起細(xì)胞 免疫，產(chǎn)生交叉保護(hù)作用，具備作為優(yōu)良亞單位疫苗的主要特點(diǎn)。然而，從弧菌中直接提取 該蛋白的操作復(fù)雜、成本高、產(chǎn)量少，不能大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)且所得蛋白容易降解，因此人 們致力于重組制備副溶血弧菌鞭毛蛋白。 現(xiàn)有技術(shù)已有關(guān)于弧菌鞭毛蛋白(FlaA)表達(dá)的報(bào)道(錢榮華。溶藻弧菌主要毒 力相關(guān)基因的克隆、表達(dá)及其免疫原性研究。浙江大學(xué)，博士學(xué)位論文，2007， 45-60)，是通 過將溶藻弧菌鞭毛蛋白(FlaA)基因與pET-30a(+)表達(dá)載體重組獲得表達(dá)質(zhì)粒來表達(dá)FlaA 蛋白的。但是，此方法在表達(dá)過程中產(chǎn)生了包涵體，所以在純化前要對樣品進(jìn)行變性和復(fù) 性，不僅操作復(fù)雜，增加制備成本，也容易使蛋白結(jié)構(gòu)遭到破壞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了克服現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種操作簡便、成本低 廉、重組蛋白純度好、得率高、適應(yīng)于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的重組副溶血弧菌鞭毛蛋白及制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種重組副溶血弧菌鞭毛蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO :4。 —種上述重組副溶血弧菌鞭毛蛋白的制備方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行
a.培養(yǎng)副溶血弧菌菌種并提取DNA ; b.設(shè)計(jì)副溶血弧菌鞭毛蛋白編碼序列的引物對，以上述提取的副溶血弧菌DNA為 模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增； c.PCR電泳回收產(chǎn)物與克隆載體pMD19T連接并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DH5a ，在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)通過藍(lán)白斑法篩選陽性克隆，選擇1131bp 大小的條帶進(jìn)行回收； d.用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I分別雙酶切c步驟回收產(chǎn)物和表達(dá)載體 pET-32a(+)，將得到的兩種目的基因片斷用DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DH5 a進(jìn)行培養(yǎng)并篩選提取重組表達(dá)質(zhì)粒；
e.將所提取的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)內(nèi)，培養(yǎng)菌株得
菌液，用IPTG誘導(dǎo)菌液，收集菌種； f.將所收集的菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，收集菌體； g.將菌體破碎、裂解、純化，收集純化液。 所述引物對的核苷酸序列為 上游引物PaF : 5' -GCGCGGATCCATGGCGATTAACGTTAATACT-3';
下游引物PaR : 5' -GACTCGAGGCCCAACAAGCTTAGCGCTGC-3'。 所述PCR反應(yīng)條件為94t:預(yù)變性5分鐘后進(jìn)行94t:變性30秒、58。C復(fù)性30秒、 72t:延伸30秒的30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，72t:延伸7分鐘后保存于4°C 。 所述e步驟是將所提取的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21 (DE3)后， 挑取單菌落接種于5ml Amp LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，再取50 yl過夜培養(yǎng)的菌液接種5ml Amp LB液體培養(yǎng)基，37°C 、200轉(zhuǎn)/分搖菌2. 5小時(shí)，至菌液的0D600為0. 4，向菌液中加誘 導(dǎo)劑IPTG至終濃度為lmM，37。C搖菌4小時(shí)后，回收菌體。 所述g步驟是用PBS重懸f步驟所得菌體，用超聲波破碎細(xì)菌并用孔徑為0. 22 ii m 的過濾器過濾細(xì)菌裂解液，在4ml Bind buffer中加lml 50^的Ni-NTA HisBind樹脂懸 液，輕輕混勻，靜置，待樹脂沉淀后取沉淀；在沉淀中加4ml細(xì)菌裂解液，輕輕混勻后用振蕩 器4°C ， 200rpm振蕩1 2h形成混合液；將混合液移入純化柱，用0. 5ml Elute buffer洗 脫，收集洗脫液。 本發(fā)明根據(jù)GenBank中副溶血弧菌鞭毛蛋白的DNA序列，設(shè)計(jì)針對鞭毛蛋白編碼 序列的引物對，以CTAB法提取的副溶血弧菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物與pMD19T 載體連接得重組質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切后再與表達(dá)載體pET-32a (+)連接，獲重組表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化 至大腸桿菌BL21(DE3)中；通過IPTG誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)了重組蛋白的可溶性表達(dá)。因在表達(dá)過程中 不產(chǎn)生包涵體，該表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)的融合蛋白帶有組氨酸標(biāo)簽，方便了樣品的鑒定和純化，避 免了樣品的變性和復(fù)性，不但操作簡單，降低了制作成本，更主要的是蛋白結(jié)構(gòu)不受破壞； 重組蛋白純度好、得率高且不易降解，適應(yīng)于工業(yè)化生產(chǎn)，為進(jìn)一步研究副溶血弧菌鞭毛蛋 白的功能奠定基礎(chǔ)。


圖1本發(fā)明實(shí)施例副溶血弧菌鞭毛蛋白基因片斷的瓊脂糖凝膠電泳分析圖。
圖2本發(fā)明實(shí)施例重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切電泳鑒定圖。
圖3本發(fā)明實(shí)施例純化柱洗脫組分的SDS-PAGE分析圖。
圖4本發(fā)明實(shí)施例重組表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析圖。
圖5本發(fā)明實(shí)施例重組表達(dá)質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白印跡分析圖。
具體實(shí)施例方式 實(shí)施例 a.將副溶血弧菌菌種ATCC 17802接種于2216E瓊脂平板上，28。C過夜培養(yǎng)，從所 述接種于2216E瓊脂平板上的副溶血弧菌菌體中以CTAB法提取DNA。 b.根據(jù)已發(fā)表的GenBank中副溶血弧菌的鞭毛蛋白基因保守序列設(shè)計(jì)針對鞭毛蛋白編碼序列的引物對，以上述提取的副溶血弧菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物對的核苷 酸序列為 上游引物PaF : 5' _GCGCGGATCCATGGCGATTAACGTTAATACT_3';
下游引物PaR : 5' -GACTCGAGGCCCAACAAGCTTAGCGCTGC-3'。 PCR反應(yīng)條件為94t:預(yù)變性5分鐘后進(jìn)行94t:變性30秒、58。C復(fù)性30秒、72。C 延伸30秒的30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，72t:延伸7分鐘后保存于4°C 。 引物對由上海生物工程有限公司合成，劃線部分分別為BamH I酶切位點(diǎn)和Xhol 酶切位點(diǎn)。 以副溶血弧菌基因組DNA為模板，用PCR技術(shù)獲得目的基因。目的基因片斷的瓊 脂糖凝膠電泳分析圖如圖1所示，圖中1 :Maker DL2000 ;2 :鞭毛蛋白基因的PCR產(chǎn)物；3 : 陰性對照；。 c.PCR電泳回收產(chǎn)物與克隆載體pMD19T連接并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DH5 a ，在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)通過藍(lán)白斑法篩選陽性克隆，用酶切方法 對陽性克隆進(jìn)行分析以鑒定重組質(zhì)粒并選擇1131bp大小的條帶進(jìn)行回收。
d.用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I分別雙酶切c步驟回收產(chǎn)物和表達(dá)載體 pET-32a(+) ，37t:作用2小時(shí)后，酶切產(chǎn)物用DNAFragment Purification Kit(Takara公 司)回收，PCR酶切產(chǎn)物和載體酶切產(chǎn)物按5 : 1混合，T4DNA連接酶(Takara公司)16°C 過夜連接，37t:過夜培養(yǎng)，提取重組表達(dá)質(zhì)粒pET-FlaA ;用BamH I和Xho I對重組表達(dá)質(zhì)粒雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖2所示圖中1 : MakerDL2000 ;2 :pET-FlaA質(zhì)粒;3 :pET-FlaA經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切產(chǎn)物。測序結(jié)果表 明，所測序列與其他弧菌鞭毛蛋白FlaA編碼序列同源性極高，故初步確認(rèn)所提取的重組表 達(dá)質(zhì)粒為副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA的編碼序列。 e.將所提取的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)內(nèi)，培養(yǎng)菌株得 菌液，挑取單菌落接種5ml Amp LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，取50 yl過夜培養(yǎng)的菌液接種5ml Amp LB液體培養(yǎng)基，37°C 200轉(zhuǎn)/分搖菌2. 5小時(shí)，至0D600為0. 4，所搖菌液加誘導(dǎo)劑IPTG 至終濃度為lmM， 37t:搖菌4小時(shí)后，回收菌體，即得到菌種。
f.將所收集的菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，收集菌體； g.用BugBuste贈Ni-NTA His 廳纖Purification kit (Novagen公司)純 化融合蛋白，具體操作步驟是用PBS重懸f步驟所得菌體，用超聲波破碎細(xì)菌并用孔徑為 0. 22 ii m的過濾器過濾細(xì)菌裂解液，除去其中的大顆粒。在4ml Bindbuffer中加lml 50% 的Ni-NTA His Bind樹脂懸液，輕輕混勻，靜置，待樹脂沉淀后用移液槍吸去上清液取沉淀； 在沉淀中加4ml細(xì)菌裂解液，輕輕混勻后用振蕩器4°C ， 200rpm振蕩1 2h形成混合液；將 混合液移入純化柱，打開底部的蓋子，收集液體；用4ml Wash buffer洗滌，收集洗滌液；用 0.5ml Elute buffer洗脫，收集洗脫液。SDS-PAGE分析各收集液，其結(jié)果如圖3所示圖中 1 :洗滌部分；2 :蛋白Marker ;3 :純化蛋白部分；洗脫液部分即為純化的蛋白液。
實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子 克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條 件，或按照制造廠商所建議的條件。
重組副溶血弧菌鞭毛蛋白(FlaA)的鑒定
1. SDS-PAGE電泳 配制12%的分離膠和5%的濃縮膠。將誘導(dǎo)前的樣品和誘導(dǎo)后的樣品各取20
分別加入20 ill 2XSDS loading buffer混勻，沸水煮5分鐘，12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，
留取上清做SDS-PAGE。 120V恒壓電泳2h、考馬斯亮藍(lán)R250染色2小時(shí)、脫色液脫色。 觀察，在61.78kDa處有明顯條帶出現(xiàn)，如圖4所示，圖中1 :pET32a(+)誘導(dǎo)前產(chǎn)
物；2 :pET32a(+)誘導(dǎo)后表達(dá)蛋白；3 :pET-FlaA誘導(dǎo)前產(chǎn)物；4 :蛋白Marker ;5 :pET-FlaA
誘導(dǎo)后表達(dá)蛋白。 2. Western Blot鑒定 當(dāng)SDS-PAGE電泳即將結(jié)束時(shí)，用蒸餾水洗清石墨板并擦干。從SDS-PAGE膠上切下 需要轉(zhuǎn)膜的部分，切6張濾紙和1張硝酸纖維素膜(NC)。把硝酸纖維素膜浸沒于去離子水 的水面中，濾紙浸沒于轉(zhuǎn)移緩沖液中，平衡5分鐘。按紙、膜、膠、紙的順序從陽極到陰極擺 放正確，連接電源，注意正負(fù)極。根據(jù)凝膠面積按0. 65-1. OmA/ci^接通電流，電轉(zhuǎn)移O. 5_2h。 轉(zhuǎn)移結(jié)束后，切斷電源，從上至下拆卸裝置，逐一拆去各層。在NC上作標(biāo)記。把凝膠取出 進(jìn)行抗體標(biāo)記。硝酸纖維素膜放在密封的塑料袋中，內(nèi)加封閉液和Anti-His Antibody。 (Anti-HisAntibody為1 : 1000稀釋)，37。C搖床中溫育lh。 37。C搖床中溫育lh。取出硝 酸纖維素膜，用PBS漂洗3次，每次10分鐘。濾膜再用TBST漂洗10分鐘。
硝酸纖維素膜放在密封的塑料袋中，內(nèi)加封閉液和l : 2000稀釋的HRP標(biāo)記的羊 抗鼠酶標(biāo)二抗。37t:搖床中溫育lh。取出NC膜，用PBS漂洗4次。將NC膜放在底物液中直 到有條帶出現(xiàn)( 一般l-5min)，取出NC在水中漂洗一下，放在PBS中。觀察結(jié)果，在61. 78KDa 處有一條特異性免疫條帶。如圖5所示，圖中1 :蛋白Marker ;2 :誘導(dǎo)前的pET-FlaA作為 陰性對照；3 :誘導(dǎo)后的pET-FlaA，和預(yù)期的pET-FlaA大小一致。序列表〈110〉大連水產(chǎn)學(xué)院〈120〉重組副溶血弧菌鞭毛蛋白及制備方法〈160>4〈170>Patentin Version 3. 1〈210>1〈211>31〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈223〉引物〈400>1gcgcggatcc atggcgatte 3cgtt朋tec t〈210>2
〈211>29〈212>DNA〈213〉人工序列
〈220〉 〈221>misc_feature 〈223〉引物 〈400>2 gactcgaggc ccaacaagct tegcgctgc 29 〈210>3 〈211>1131 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈221>CDS 〈223〉副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA基因 〈400>3atggcgatteacgtteatecteacgtttctgcgatgaccgcacagcgtte ccteaaccac60gcggctg皿gcgtttgtctt120gcg^agatgatgctgc郷tctecagatttcaaaccgtttg皿cgctca皿gccgtggc180ctegacatggcgcg皿cgacggtetctccattgC3C3ggt tgctg皿ggt240gc皿tg皿tgcatcctecagcgtetgcgtgacctetcgct tcaatctgcg300aacggttcteag皿cgtgtegcgatcc皿g皿g皿gteac agcgcte皿c360gacggacteaaccgtetcgctctttcggtggteac皿3ct gctteacggt420acgtecggtectcaatctttccaaatcggtgcggactctggcgaagctgt aatgctttct■3tgggC3gCCtecgttctgatecttcagcaatgggtggteagagctectc 3gc3g皿g皿540ggt腿gatgcatcttggac3gttggtgat皿皿ctgagctte皿3tgag ctecacc皿c600actteccatc皿ggcteagc皿ggCg3Cg3 C3tCg3gC3g660ctegcaactt3C3tC皿Cgggatgtea皿gcgtctgttgg tg皿gacggc720皿gctec皿gtetttgcttctectcag皿3gt腿tggtgaagttgagtt ctctggcaac780ctegctggcgagatcggttttggtgatgcg3皿g3cgteacggtte皿ga catcgacgte8403C皿Cggttgcaggctctcaag皿gctgtegcagttetcg3cggtgcact te皿tcagte■g3C3gCC皿Cgtgcgtcactaggtgctttccagaaccgtttcaaccacgc aatcagcaac960ctegac朋c3cgtteatgca tcteacagccgtette皿ga tectgattec1020C皿C3gCg3tgactea， cg caaattcttcagcaagcaag tecttcaatc1080ctggctcaagcg皿gcagtcaccatctgca gcgctaagcttgttgggcte a1131 〈210>4 〈211>376 〈212>PRT 〈213>人工序列 〈220〉 〈221>CDS 〈223〉副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA0105]〈400>4
0106]MetAlalieAsnValAsnThrAsnValSerAlaMetThrAlaGinArg
0107]151015
0108]TyrLeuAsnHisAlaAlaGluGlyGinGinLysSerMetGluArgLeu
0109]202530
0110] 0111 ]SerSerGly 35TyrLyslieAsnSer 40AlaLysAspAspAla 45AlaGlyLeu
0112]GinlieSerAsnArgLeuAsnAlaGinSerArgGlyLeuAspMetAla
0113]505560
0114]ValLysAsnAlaAsnAspGlylieSerlieAlaGinValAlaGluGly
0115]65707580
0116]AlaMetAsnGluSerThrAsnlieLeuGinArgMetArgAspLeuSer
0117]859095
0118]LeuGinSerAlaAsnGlySerAsnSerLysAlaGluArgValAlalie
0119]100105110
0120]GinGluGluValThrAlaLeuAsnAspGlyLeuAsnArglieAlaGlu
0121]115120125
0122]ThrThrSerPheGlyGlyAsnLysLeuLeuAsnGlyThrTyrGlyThr
0123]130135140
0124]GinSerPheGinlieGlyAlaAspSerGlyGluAlaValMetLeuSer
0125]145150155160
0126]MetGlySerLeuArgSerAspThrSerAlaMetGlyGlyLysSerTyr
0127]165170175
0128]SerAlaGluGluGlyLysAspAlaSerTrpThrValGlyAspLysThr
0129]180185190
0130]GluLeuLysMetSerTyrThrAsnLysGinGlyGluGluLysGluLeu
0131]195200205
0132]ThrlieLysAlaLysGinGlyAspAsplieGluGinLeuAlaThrTyr
0133]210215220
0134]lieAsnGlyGinSerGluAspValLysAlaSerValGlyGluAspGly
0135]225230235240
0136]LysLeuGinValPheAlaSerThrGinLysValAsnGlyGluValGlu
0137]245250255
0138]PheSerGlyAsnLeuAlaGlyGlulieGlyPheGlyAspAlaLysAsp
0139]260265270
0140]ValThrValLysAsplieAspValThrThrValAlaGlySerGinGlu
0141]275280285
0142]AlaValAlaVallieAspGlyAlaLeuLysSerValAspSerGinArg
0143]290295300GlyAlaPheGinAsnArgPheAsnHisAlalieSerAsn305310315320LeuAspAsnlieAsnGluAsnValAsnAlaSerAsnSerArglieLys325330335AspThrAspTyrAlaLysGluThrThrAlaMetThrLysSerGinlie340345350LeuGinGinAlaSerThrSerlieLeuAlaGinAlaLysGinSerPro355360365SerAlaAlaLeuSerLeuLeuGly37037權(quán)利要求
一種重組副溶血弧菌鞭毛蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO4。
2. —種如權(quán)利要求1所述重組副溶血弧菌鞭毛蛋白的制備方法，其特征在于按如下步 驟進(jìn)行a. 培養(yǎng)副溶血弧菌菌種并提取DNA ;b. 設(shè)計(jì)副溶血弧菌鞭毛蛋白編碼序列的引物對，以上述提取的副溶血弧菌DNA為模板 進(jìn)行PCR擴(kuò)增；c. PCR電泳回收產(chǎn)物與克隆載體pMD19T連接并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 a ，在 含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)通過藍(lán)白斑法篩選陽性克隆，選擇1131bp大小的條 帶進(jìn)行回收；d. 用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I分別雙酶切c步驟回收產(chǎn)物和表達(dá)載體 pET-32a(+)，將得到的兩種目的基因片斷用DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DH5 a進(jìn)行培養(yǎng)并篩選提取重組表達(dá)質(zhì)粒；e. 將所提取的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)內(nèi)，培養(yǎng)菌株得菌 液，用IPTG誘導(dǎo)菌液，收集菌種；f. 將所收集的菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，收集菌體；g. 將菌體破碎、裂解、純化，收集純化液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組副溶血弧菌鞭毛蛋白的制備方法，其特征在于所述引物 對的核苷酸序列為上游引物PaF:5' -GCGCGGATCCATGGCGATTAACGTTAATACT-3'; 下游引物PaR :5' -GACTCGAGGCCCAACAAGCTTAGCGCTGC-3'。所述PCR反應(yīng)條件為94t:預(yù)變性5分鐘后進(jìn)行94t:變性30秒、58"C復(fù)性30秒、72"C 延伸30秒的30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，72t:延伸7分鐘后保存于4°C 。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組副溶血弧菌鞭毛蛋白的制備方法，其特征在于所述e 步驟是將所提取的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21 (DE3)后，挑取單菌落接種 于5ml Amp LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，再取50 yl過夜培養(yǎng)的菌液接種5ml Amp LB液體培 養(yǎng)基，37°C 、200轉(zhuǎn)/分搖菌2. 5小時(shí)，至菌液的0D600為0. 4，向菌液中加誘導(dǎo)劑IPTG至終 濃度為lmM，37t:搖菌4小時(shí)后，回收菌體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組副溶血弧菌鞭毛蛋白的制備方法，其特征在于所述g 步驟是用PBS重懸f步驟所得菌體，用超聲波破碎細(xì)菌并用孔徑為0. 22 ii m的過濾器過濾 細(xì)菌裂解液，在4ml Bind buffer中加lml 50X的Ni-NTA HisBind樹脂懸液，輕輕混勻，靜 置，待樹脂沉淀后取沉淀；在沉淀中加4ml細(xì)菌裂解液，輕輕混勻后用振蕩器4°C ， 200rpm振 蕩1 2h形成混合液；將混合液移入純化柱，用0. 5ml Elute buffer洗脫，收集洗脫液。
全文摘要
本發(fā)明公開一種重組副溶血弧菌鞭毛蛋白及制備方法，根據(jù)副溶血弧菌鞭毛蛋白的DNA序列，設(shè)計(jì)引物對并以CTAB法提取的副溶血弧菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物與pMD19T載體連接得重組質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切后再與表達(dá)載體pET-32a(+)連接，獲重組表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中；通過IPTG誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)了重組蛋白的可溶性表達(dá)。因在表達(dá)過程中不產(chǎn)生包涵體，該表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)的融合蛋白帶有組氨酸標(biāo)簽，方便了樣品的鑒定和純化，避免了樣品的變性和復(fù)性，不但操作簡單，降低了制作成本，更主要的是蛋白結(jié)構(gòu)不受破壞；重組蛋白純度好、得率高且不易降解，適應(yīng)于工業(yè)化生產(chǎn)，為進(jìn)一步研究副溶血弧菌鞭毛蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。
文檔編號C12P21/02GK101698675SQ20091021966
公開日2010年4月28日 申請日期2009年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月5日
發(fā)明者仇雪梅, 王秀利, 袁野, 郭設(shè)平 申請人:大連水產(chǎn)學(xué)院