專利名稱：重組創(chuàng)傷弧菌鐵攝取調節(jié)蛋白及制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物基因工程技術領域，尤其涉及一種操作簡便、成本低廉、重組蛋白
純度好、得率高、適應于工業(yè)化生產的重組創(chuàng)傷弧菌鐵攝取調節(jié)蛋白及制備方法。
背景技術：
創(chuàng)傷弧菌是一種嗜鹽性革蘭氏陰性細菌，生存于海洋和河口環(huán)境中，易引起海洋 動物(如海水魚、蝦、貝)傷口感染、胃腸炎和敗血癥等，是主要的病原弧菌之一，給海水養(yǎng) 殖業(yè)帶來巨大的經濟損失?；【纳L及致病與很多微量元素有關，鐵是維持弧菌新陳代 謝所必需的營養(yǎng)物質之一，對病原菌的復制增殖是必需的，所以弧菌在缺鐵的環(huán)境中不能 生長，但是如果攝取過量也會因形成羥基而引起細胞毒作用和氧化應激，從而停止生長。存 在于弧菌中的鐵攝取調節(jié)蛋白(Fur)可作為阻遏蛋白與二價鐵形成穩(wěn)定的復合物，該復合 物與鐵調控基因上游長度19bp的操縱子序列結合，從而達到抑制轉錄減低細胞內鐵濃度 的目的，同時抑制鐵吸收系統(tǒng)許多編碼基因及其鐵調節(jié)基因的表達。研究鐵攝取調節(jié)蛋白 在弧菌代謝過程中的作用，有助于深入了解弧菌的致病機制，從而可有效地控制弧菌病的 流行。然而，從創(chuàng)傷弧菌中直接提取該蛋白的操作復雜、成本高、產量少，不能大規(guī)模產業(yè)化 生產且所得蛋白容易降解，因此人們致力于重組制備創(chuàng)傷弧菌鐵攝取調節(jié)蛋白。
現(xiàn)有技術已有關于對弧菌鐵攝取調節(jié)蛋白(Fur)表達的報道(錢榮華，于漣，毛芝 娟，等。溶藻弧菌鐵調蛋白基因的克隆、表達及其特征分析?？萍纪▓?，2007，23 :651-657)， 是通過將溶藻弧菌鐵攝取調節(jié)蛋白基因與pET-30a(+)表達載體重組獲得表達質粒來表達 Fur蛋白的。但是，此方法在表達過程中產生了包涵體，所以在純化前要對樣品進行變性和 復性，不僅操作復雜，增加制備成本，也容易使蛋白結構遭到破壞。

發(fā)明內容
本發(fā)明是為了克服現(xiàn)有技術所存在的上述技術問題，提供一種操作簡便、成本低 廉、重組蛋白純度好、得率高、適應于產業(yè)化生產的重組創(chuàng)傷弧菌鐵攝取調節(jié)蛋白及制備方 法。 本發(fā)明的技術解決方案是一種重組創(chuàng)傷弧菌鐵攝取調節(jié)蛋白，其氨基酸序列如 SEQ ID NO :4。 —種上述重組創(chuàng)傷弧菌鐵攝取調節(jié)蛋白的制備方法，其特征在于按如下步驟進 行 a.培養(yǎng)創(chuàng)傷弧菌菌種并提取DNA ; b.設計創(chuàng)傷弧菌鐵攝取調節(jié)蛋白編碼序列的引物對，以上述提取的創(chuàng)傷弧菌DNA 為模板進行PCR擴增； c.PCR電泳回收產物與克隆載體pMD19T連接并轉化入大腸桿菌感受態(tài)細胞 DH5 a ，在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)通過藍白斑法篩選陽性克隆，選擇450bp大 小的條帶進行回收；
d.用限制性內切酶EcoR I和Xho I分別雙酶切c步驟回收產物和表達載體 pET-32a(+)，將得到的兩種目的基因片斷用DNA連接酶連接，轉化入大腸桿菌感受態(tài)細胞 DH5 a進行培養(yǎng)并篩選提取重組表達質粒； e.將所提取的重組表達質粒轉化入大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)內，培養(yǎng)菌株得
菌液，用IPTG誘導菌液，收集菌種； f.將所收集的菌種進行擴大培養(yǎng)，收集菌體； g.將菌體破碎、裂解、純化，收集純化液。 所述引物對的核苷酸序列為 上游引物VuF : 5' -CCGGAATTCATGTCAGACAATAACCAAGC-3';
下游引物VuR :5' -CCCTCGAGGTTCTTACGTTTATGTGCG-3'。 所述PCR反應條件為94t:預變性5分鐘后進行94t:變性30秒、56. 2t:復性30 秒、72t:延伸30秒的30個循環(huán)的擴增，72t:延伸7分鐘后保存于4°C 。
所述e步驟是將所提取的重組質粒轉化入大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3)后，挑取 單菌落接種于5ml Amp LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，再取50 yl過夜培養(yǎng)的菌液接種5ml Amp LB液體培養(yǎng)基，37t:、200轉/分搖菌2. 5小時，至菌液的0D600為0. 4，向菌液中加誘導劑 IPTG至終濃度為lmM，37t:搖菌4小時后，回收菌體。 所述g步驟是用PBS重懸f步驟所得菌體，用超聲波破碎細菌并用孔徑為0. 22 ii m 的過濾器過濾細菌裂解液，在4ml Bind buffer中加lml 50^的Ni-NTA HisBind樹脂懸 液，輕輕混勻，靜置，待樹脂沉淀后取沉淀；在沉淀中加4ml細菌裂解液，輕輕混勻后用振蕩 器4°C ， 200rpm振蕩1 2h形成混合液；將混合液移入純化柱，用0. 5ml Elute buffer洗 脫，收集洗脫液。 本發(fā)明根據(jù)GenBank中創(chuàng)傷弧菌鐵攝取調節(jié)蛋白的DNA序列，設計針對鐵攝取調 節(jié)蛋白編碼序列的引物對，以CTAB法提取的創(chuàng)傷弧菌DNA為模板進行PCR擴增，PCR產物 與pMD 19T載體連接得重組質粒，經雙酶切后再與表達載體pET-32a(+)連接，獲重組表達 質粒并轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中；通過IPTG誘導實現(xiàn)了重組蛋白的可溶性表達。因在 表達過程中不產生包涵體，該表達質粒表達的融合蛋白帶有組氨酸標簽，方便了樣品的鑒 定和純化，避免了樣品的變性和復性，不但操作簡單，降低了制作成本，更主要的是蛋白結 構不受破壞；重組蛋白純度好、得率高且不易降解，適應于工業(yè)化生產，為進一步研究創(chuàng)傷 弧菌鐵攝取調節(jié)蛋白的功能奠定基礎。


圖1本發(fā)明實施例創(chuàng)傷弧菌鐵攝取調節(jié)蛋白基因片斷的瓊脂糖凝膠電泳分析圖。
圖2本發(fā)明實施例重組表達質粒的雙酶切電泳鑒定圖。
圖3本發(fā)明實施例純化柱洗脫組分的SDS-PAGE分析圖。
圖4本發(fā)明實施例重組表達質粒表達產物的SDS-PAGE分析圖。
圖5本發(fā)明實施例重組表達質粒誘導表達的蛋白印跡分析圖。
具體實施例方式 實施例
a.將創(chuàng)傷弧菌菌種ATCC 27562接種于2216E瓊脂平板上，28。C過夜培養(yǎng)，從所述 接種于2216E瓊脂平板上的創(chuàng)傷弧菌菌體中以CTAB法提取DNA。 b.根據(jù)已發(fā)表的GenBank中創(chuàng)傷弧菌的鐵攝取調節(jié)蛋白基因保守序列設計針對 鐵攝取調節(jié)蛋白編碼序列的引物對，以上述提取的創(chuàng)傷弧菌DNA為模板進行PCR擴增，引物 對的核苷酸序列為 上游引物VuF : 5' -CCGGAATTCATGTCAGACAATAACCAAGC-3';
下游引物VuR : 5' -CCCTCGAGGTTCTTACGTTTATGTGCG-3'。 PCR反應條件為94t:預變性5分鐘后進行94t:變性30秒、56. 2"C復性30秒、72t: 延伸30秒的30個循環(huán)的擴增，72t:延伸7分鐘后保存于4°C 。 引物對由上海生物工程有限公司合成，劃線部分分別為EcoR I酶切位點和Xhol 酶切位點。 以創(chuàng)傷弧菌基因組DNA為模板，用PCR技術獲得目的基因。目的基因片斷的瓊脂 糖凝膠電泳分析圖如圖1所示，圖中1 :鐵攝取調節(jié)蛋白基因的PCR產物；2 :陰性對照；M :
Maker DL2000。 c.PCR電泳回收產物與克隆載體pMD19T連接并轉化入大腸桿菌感受態(tài)細胞 DH5a ，在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)通過藍白斑法篩選陽性克隆，用酶切方法 對陽性克隆進行分析以鑒定重組質粒并選擇450bp大小的條帶進行回收。
d.用限制性內切酶EcoR I和Xho I分別雙酶切c步驟回收產物和表達載體 pET-32a(+) ，37t:作用2小時后，酶切產物用DNA Fragment Purification Kit(Takara公 司)回收，PCR酶切產物和載體酶切產物按5 : 1混合，T4DNA連接酶(Takara公司)16°C 過夜連接，37t:過夜培養(yǎng)，提取重組表達質粒pET-Fur ;用EcoR I和Xho I對重組表達質粒 雙酶切鑒定，鑒定結果如圖2所示:圖中1 :MakerDL2000 ;2 :pET-Fur經EcoR I和Xho I雙 酶切產物。測序結果表明，所測序列與其他弧菌鐵攝取調節(jié)蛋白Fur編碼序列同源性極高， 故初步確認所提取的重組表達質粒為創(chuàng)傷弧菌鐵攝取調節(jié)蛋白Fur的編碼序列。
e.將所提取的重組表達質粒轉化入大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)內，培養(yǎng)菌株得 菌液，挑取單菌落接種5ml Amp LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，取50 過夜培養(yǎng)的菌液接種5ml Amp LB液體培養(yǎng)基，37°C 200轉/分搖菌2. 5小時，至0D600為0. 4，所搖菌液加誘導劑IPTG 至終濃度為lmM， 37t:搖菌4小時后，回收菌體，即得到菌種。
f.將所收集的菌種進行擴大培養(yǎng)，收集菌體； g.用BugBuster參Ni-NTA His 扁nci像Purification kit (Novagen公司)純 化融合蛋白，具體操作步驟是用PBS重懸f步驟所得菌體，用超聲波破碎細菌并用孔徑為 0. 22 ii m的過濾器過濾細菌裂解液，除去其中的大顆粒。在4ml Bindbuffer中加1ml 50% 的Ni-NTA His Bind樹脂懸液，輕輕混勻，靜置，待樹脂沉淀后用移液槍吸去上清液取沉淀； 在沉淀中加4ml細菌裂解液，輕輕混勻后用振蕩器4°C ， 200rpm振蕩1 2h形成混合液；將 混合液移入純化柱，打開底部的蓋子，收集液體；用4ml Wash buffer洗滌，收集洗滌液；用 0.5ml Elute buffer洗脫，收集洗脫液。SDS-PAGE分析各收集液，其結果如圖3所示圖中 1 :蛋白Marker ;2 :洗滌部分；3 :純化蛋白部分；洗脫液部分即為純化的蛋白液。
實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子 克隆實驗室手冊(New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。 重組創(chuàng)傷弧菌鐵攝取調節(jié)蛋白(Fur)的鑒定
l.SDS-PAGE電泳 配制12%的分離膠和5%的濃縮膠。將誘導前的樣品和誘導后的樣品各取20分別加入20 ill 2XSDS loading buffer混勻，沸水煮5分鐘，12000轉/分離心10分鐘，留取上清做SDS-PAGE。 120V恒壓電泳2h、考馬斯亮藍R250染色2小時、脫色液脫色。
觀察，在37kDa處有明顯條帶出現(xiàn)，如圖4所示，圖中1 :pET32a(+)誘導前產物；2 :pET32a(+)誘導后表達蛋白；3 :pET-Fur誘導前產物；4 :蛋白Marker ;5 :pET-Fur誘導后表達蛋白。 2. Western Blot鑒定 當SDS-PAGE電泳即將結束時，用蒸餾水洗清石墨板并擦干。從SDS-PAGE膠上切下需要轉膜的部分，切6張濾紙和1張硝酸纖維素膜(NC)。把硝酸纖維素膜浸沒于去離子水的水面中，濾紙浸沒于轉移緩沖液中，平衡5分鐘。按紙、膜、膠、紙的順序從陽極到陰極擺放正確，連接電源，注意正負極。根據(jù)凝膠面積按0. 65-1. OmA/ci^接通電流，電轉移O. 5_2h。轉移結束后，切斷電源，從上至下拆卸裝置，逐一拆去各層。在NC上作標記。把凝膠取出進行抗體標記。硝酸纖維素膜放在密封的塑料袋中，內加封閉液和鼠血清(鼠血清為1 : 200稀釋)，37t:搖床中溫育lh。取出硝酸纖維素膜，用PBS漂洗3次，每次10分鐘。濾膜再用TBST漂洗IO分鐘。 硝酸纖維素膜放在密封的塑料袋中，內加封閉液和l : 2000稀釋的HRP標記的羊抗鼠酶標二抗。37t:搖床中溫育lh。取出NC膜，用PBS漂洗4次。將NC膜放在底物液中直到有條帶出現(xiàn)( 一般l-5min)，取出NC在水中漂洗一下，放在PBS中。觀察結果，在37kDa處有一條特異性免疫條帶，如圖5所示，圖中1 :蛋白Marker ;2 :誘導后的pET-Fur ;3 :誘導前的pET-Fur作為陰性對照，和預期的pET-Fur大小一致。序列表〈110〉大連水產學院〈120〉重組創(chuàng)傷弧菌鐵攝取調節(jié)蛋白及制備方法〈160>4〈170>Patentin Version 3. 1〈210>1〈211>29〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈223〉引物〈400>1ccgg朋ttca tgtc3gac朋t朋cc朋gc 29〈210>2〈211>27
〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈223〉引物〈400>2ccctcgaggt tcttacgttt atgtgcg27〈210>3〈211>450〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>CDS〈223〉重組創(chuàng)傷弧菌鐵攝取調節(jié)蛋白基因〈400>3atgtc3gac3 ateacc朋gc gcte朋ggatgctggtctte aagtteccct ttcaaggctg60朋朋tttteg朋gtecteca gc朋ccggattgccaacaca tcagtgctga agacctttet120aagaagctga ttgatcttgg cgaggagattggccttgcga cagtetetcg agtgttgaac180cagtttgatg atgccggtet tgttectcgccaccactttg aaggcggtea atcggtettt240gaactttcaa ctcaacatca ccatgatcacctegtttgtc tcgactgcgg tgaagttett300gagttttcgg atgacattet tgaagagcgcc朋3朋g朋3 tcgccgccgc tteteatgtt360caactgacaa accacagcct ctecctttecggcaagtgtg gcgatggctc atgcaaaggt420朋tcc3gacg cacate朋cg teag朋ctea450〈210>4〈211>150〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈221>CDS〈223〉重組創(chuàng)傷弧菌鐵攝取調節(jié)蛋白〈400>4Met Ser Asp Asn Asn Gin Ala LeuLys Asp Ala Gly Leu Lys Val Thr1 510 15Leu Ser Arg Leu Lys lie Leu GluVal Leu Gin Gin Pro Asp Cys Gin2025 30His lie Ser Ala Glu Asp Leu TyrLys Lys Leu lie Asp Leu Gly Glu35 4045Glu lie Gly Leu Ala Thr Val TyrArg Val Leu Asn Gin Phe Asp Asp50 55 760
AlaGlylieValThrArgHisHisPheGluGlyGlySerValPhe65707580GluLeuSerThrGinHisHisHisAspHisLeuValCysLeuAspCys859095GlyGluVallieGluPheSerAspAsplielieGluGluArgGinLys100105110GlulieAlaAlaAlaTyrAsnValGinLeuThrAsnHisSerLeuTyr115120125LeuTyrGlyLysCysGlyAspGlySerCysGlyAsnProAspAla130135140HisLysArgLysAsnTer145150
權利要求
一種重組創(chuàng)傷弧菌鐵攝取調節(jié)蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO4。
2. —種如權利要求1所述重組創(chuàng)傷弧菌鐵攝取調節(jié)蛋白的制備方法，其特征在于按如 下步驟進行a. 培養(yǎng)創(chuàng)傷弧菌菌種并提取DNA;b. 設計創(chuàng)傷弧菌鐵攝取調節(jié)蛋白編碼序列的引物對，以上述提取的創(chuàng)傷弧菌DNA為模 板進行PCR擴增；c. PCR電泳回收產物與克隆載體pMD19T連接并轉化入大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5 a ，在 含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)通過藍白斑法篩選陽性克隆，選擇450bp大小的條帶 進行回收；d. 用限制性內切酶EcoR I和Xho I分別雙酶切c步驟回收產物和表達載體 pET-32a(+)，將得到的兩種目的基因片斷用DNA連接酶連接，轉化入大腸桿菌感受態(tài)細胞 DH5 a進行培養(yǎng)并篩選提取重組表達質粒；e. 將所提取的重組表達質粒轉化入大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)內，培養(yǎng)菌株得菌 液，用IPTG誘導菌液，收集菌種；f. 將所收集的菌種進行擴大培養(yǎng)，收集菌體；g. 將菌體破碎、裂解、純化，收集純化液。
3. 根據(jù)權利要求2所述的重組創(chuàng)傷弧菌鐵攝取調節(jié)蛋白的制備方法，其特征在于所述 引物對的核苷酸序列為上游引物VuF:5' -CCGGAATTCATGTCAGACAATAACCAAGC-3'; 下游引物VuR :5' -CCCTCGAGGTTCTTACGTTTATGTGCG-3'。所述PCR反應條件為94t:預變性5分鐘后進行94t:變性30秒、56. 2t:復性30秒、 72t:延伸30秒的30個循環(huán)的擴增，72t:延伸7分鐘后保存于4°C 。
4. 根據(jù)權利要求3所述的重組創(chuàng)傷弧菌鐵攝取調節(jié)蛋白的制備方法，其特征在于所 述e步驟是將所提取的重組表達質粒轉化入大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3)后，挑取單菌落 接種于5ml Amp LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，再取50 yl過夜培養(yǎng)的菌液接種5ml Amp LB液 體培養(yǎng)基，37t:、200轉/分搖菌2. 5小時，至菌液的0D600為0. 4，向菌液中加誘導劑IPTG 至終濃度為lmM，37t:搖菌4小時后，回收菌體。
5. 根據(jù)權利要求4所述的重組創(chuàng)傷弧菌鐵攝取調節(jié)蛋白的制備方法，其特征在于所 述g步驟是用PBS重懸f步驟所得菌體，用超聲波破碎細菌并用孔徑為0. 22 ii m的過濾器 過濾細菌裂解液，在4ml Bind buffer中加lml 50X的Ni-NTA His Bind樹脂懸液，輕輕 混勻，靜置，待樹脂沉淀后取沉淀；在沉淀中加4ml細菌裂解液，輕輕混勻后用振蕩器4t:， 200rpm振蕩1 2h形成混合液；將混合液移入純化柱，用0. 5ml Elute buffer洗脫，收集 洗脫液。
全文摘要
本發(fā)明公開一種重組創(chuàng)傷弧菌鐵攝取調節(jié)蛋白及制備方法，根據(jù)創(chuàng)傷弧菌鐵攝取調節(jié)蛋白的DNA序列，設計引物對并以CTAB法提取的創(chuàng)傷弧菌DNA為模板進行PCR擴增，PCR產物與pMD19T載體連接得重組質粒，經雙酶切后再與表達載體pET-32a(+)連接，獲重組表達質粒并轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中；通過IPTG誘導實現(xiàn)了重組蛋白的可溶性表達。因在表達過程中不產生包涵體，該表達質粒表達的融合蛋白帶有組氨酸標簽，方便了樣品的鑒定和純化，避免了樣品的變性和復性，不但操作簡單，降低了制作成本，更主要的是蛋白結構不受破壞；重組蛋白純度好、得率高且不易降解，適應于工業(yè)化生產，為進一步研究創(chuàng)傷弧菌鐵攝取調節(jié)蛋白的功能奠定基礎。
文檔編號C12P21/02GK101698676SQ20091021966
公開日2010年4月28日 申請日期2009年11月5日 優(yōu)先權日2009年11月5日
發(fā)明者仇雪梅, 王秀利, 葛輝, 袁野 申請人:大連水產學院