專利名稱：?jiǎn)魏思?xì)胞增生利斯特氏菌菌株及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種革蘭氏陽性小桿菌，尤其涉及一株單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株 及其用途，屬于細(xì)菌學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes, L. Μ.)為革蘭氏陽性小 桿菌。其廣泛存在于土壤、水域、昆蟲、植物、動(dòng)物體內(nèi)。食品是該菌致病的主要載體。據(jù) WHO (1999)報(bào)道，4 % 8 %的水產(chǎn)品，5 % 10 %的奶與奶制品，30 %以上的肉與肉制品， 15%以上的家禽均被該菌污染。由于該菌在4°C的環(huán)境下仍可生長(zhǎng)繁殖，因此也成為冷藏食 品威脅人類健康的主要病原菌之一(沈紅，蔣興祥，趙霞贊，等.食品中單核細(xì)胞增生利斯 特氏菌檢測(cè)及污染現(xiàn)狀分析[J]，中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2007，23 (4) :417.)。L.M.作為國際公認(rèn)的四大食源性致病菌之一，可引起全球性的人獸共患病一利 斯特菌病。該病感染對(duì)象主要是新生兒(畜)、孕婦(畜)、免疫功能低下者及老年人群(家 畜)，臨床癥狀表現(xiàn)為腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)、膿腫等，最突出的特點(diǎn)是臨床病死率較高，可達(dá) 30-70%。該病在發(fā)達(dá)國家發(fā)病率較高，常呈暴發(fā)性流行。近年來，在歐美日等國家此菌的 危害程度甚至超過沙門氏菌。目前在我國雖無爆發(fā)性流行，但一些散在病例已見報(bào)道。近些年隨著抗生素在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)生產(chǎn)中的廣泛使用，特別是在食源性動(dòng)物中作 為促生長(zhǎng)劑的使用，導(dǎo)致了食源性細(xì)菌耐藥性的普遍發(fā)生。而這些耐藥菌株的出現(xiàn)導(dǎo)致臨 床治療失敗、并發(fā)癥增多、感染復(fù)發(fā)及治療時(shí)間延長(zhǎng)等情況的發(fā)生。更為嚴(yán)重的是有些耐藥 菌株的耐藥基因可在不同種的食源性致病菌之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致其耐藥性進(jìn)一步傳播和擴(kuò) 散，這更大大增加食源性疾病的防控難度。鑒于此，開展有關(guān)食源性致病菌的耐藥性監(jiān)測(cè)、 耐藥機(jī)制及耐藥性水平傳播機(jī)制等研究具有重要意義。1988年之前，L.M.被認(rèn)為對(duì)所有抗生素敏感，所以對(duì)該菌的相關(guān)耐藥性研究 較少。但自1988年首次報(bào)道L.M.的四環(huán)素耐受株以來，不斷從食品、環(huán)境及人利斯特 菌病散發(fā)病例中分離到對(duì)一種或多種抗生素耐受的L. M (Paciorek J. Antimicrobial susceptibilities of Listeria monocytogenes strains isolated from2000to2002in Poland.Pol J Microbiol,2004,53 (4) :279-281. Aureli P, Ferrini AM, Mannoni V, et al.Susceptibility of Listeria monocytogenes isolated from food in Italy toantibiotics. Int J Food Microbiol, 2003,83 (3) :325_330.)。此后，國內(nèi)外學(xué)者逐 步展開了對(duì)該菌的耐藥性研究。國內(nèi)學(xué)者對(duì)L.M.的耐藥性研究較少。僅有的幾篇報(bào)道 也主要集中在耐藥譜分析上(張亞蘭，冉陸，利迎惠，等.2003-2004中國食品中單核細(xì) 胞增生利斯特菌耐藥監(jiān)測(cè)[J]·中國食品衛(wèi)生雜志，2006，18 (5) =398-240.楊洋，付萍，郭 云昌，等.中國食源性單核細(xì)胞增生利斯特菌耐藥性趨勢(shì)分析.衛(wèi)生研究，2008，37 (2) 183-186.)，未見有關(guān)耐藥機(jī)制及耐藥基因水平傳播的相關(guān)報(bào)道。國外學(xué)者對(duì)L.M.的耐藥 性研究大多集中在耐藥譜的分析和耐藥機(jī)制的探討方面(Bertrand S，Huys G，Yde M，et al.Detection and characterization of tetM intetracycline-resistant Listeriastrains from human and food-processing origins inBelgium and France. J Med Microbiol，2005，54(12)) 1151-1156. Srinivasan ViNam HMiNquven LT，et al. Prevalence of antimicrobial resistance genes in Listeria monocytogenesisolated from dairy farms. Foodborne Pathog Dis，2005，2 (3) :201_21L Poros-Gluchowska J，Markiewicz Z.Antimicrobial resistance of Listeria monocytogenes. ActaMicrobiol Pol，2003， 52(2) :113-129.) 0僅在2002年，Pourshabm等研究發(fā)現(xiàn)從食品中分離的L. M.所攜帶四 環(huán)素耐藥基因tetM能通過接合作用轉(zhuǎn)移給另一株對(duì)四環(huán)素敏感的L. M.菌株和糞腸球菌 (Pourshaban MiFerrini A MiMannoni V，et al. Transferable tetracycline resistance in Listeria monocytogenes from food in Italy. J MedMicrobiol,2002,51 :564_566.)。 目前未見該基因向其他菌株轉(zhuǎn)移的報(bào)道。基于L.M.給人類帶來的嚴(yán)重健康隱患及其耐藥性傳播所導(dǎo)致的嚴(yán)重后果，應(yīng)大 力開展該菌的耐藥機(jī)制及耐藥基因傳播方面的研究。這樣才能為阻止其耐藥性的擴(kuò)散和新 型抗菌藥物的研制提供理論基礎(chǔ)，而目前之所以沒能深度開展這方面的工作，很主要的一 個(gè)原因是缺乏進(jìn)行此類研究的合適的菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是基于國內(nèi)缺乏用于耐藥機(jī)制及耐藥基因傳播研究 的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株，提供一種四重耐藥且攜帶可以轉(zhuǎn)移的四環(huán)素耐藥基因 tetM的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株，該菌株可以作為標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)用菌株。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一株四重耐藥且攜帶可以轉(zhuǎn)移的四環(huán)素耐藥基因的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌 株(Listeria monocytogenes) D38，其分類命名是單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，其微生物保藏號(hào)是CGMCC No. 3342 ；保藏單位中國微生物菌種保藏管理 委員會(huì)普通微生物中心；保藏地址是北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所；保 藏時(shí)間；2009年10月19日。本發(fā)明單核細(xì)胞增生利斯特氏菌D38菌株的分離方法如下分離培養(yǎng)無菌取市售生豬肉樣品置于增菌液中進(jìn)行兩次增菌，用接種環(huán)沾取增菌 液，在科瑪嘉利斯特顯色培養(yǎng)基上劃線接種，30°C培養(yǎng)24h后，挑取培養(yǎng)基上大小為l_2mm、 藍(lán)色帶有白色暈環(huán)的圓形菌落在血瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，繼續(xù)于30°C培養(yǎng)24h。然后選擇 血平板上具有明顯β溶血環(huán)的菌落穿刺于SIM半固體培養(yǎng)基，25°C培養(yǎng)48h，細(xì)菌沿穿刺線 擴(kuò)散生長(zhǎng)，呈云霧狀，距培養(yǎng)基表面數(shù)毫米處出現(xiàn)一個(gè)倒傘形生長(zhǎng)區(qū)。然后進(jìn)一步將血平板 上的具有以上特征的菌落接種于TSA-YE培養(yǎng)基上進(jìn)行純培養(yǎng)。菌株鑒定將純培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡觀察菌落為陽性短桿菌，兩端鈍圓，多單在，有的呈V字型排列，初步鑒定為單核細(xì)胞增生利斯特氏菌。將此菌株制成菌 懸液，注入API生化試劑條上的每一個(gè)小管，在需氧條件下，36°C培養(yǎng)24小時(shí)，其反應(yīng)結(jié)果 符合單核細(xì)胞增生利斯特氏菌數(shù)碼圖譜。進(jìn)而又利用基因組提取試劑盒提取上述菌株的 基因組，并采用PCR方法擴(kuò)增單核細(xì)胞增生利斯特氏菌的特異性基因，結(jié)果擴(kuò)增到大小約 210bp的特異性基因片段hlyf，進(jìn)一步證實(shí)了分離到的菌株為單核細(xì)胞增生利斯特氏菌。按照NCCLS制定的K-B法實(shí)驗(yàn)操作過程及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)本發(fā)明菌株進(jìn)行耐藥譜分析發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明菌株同時(shí)對(duì)磷霉素、四環(huán)素、諾氟沙星及頭孢噻肟四種抗生素耐受，為四 重耐藥菌株。本發(fā)明菌株可作為科研工作者標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)用菌株，可用于單一耐藥機(jī)制和多 重耐藥機(jī)制的研究，同時(shí)也可用于耐藥性消除試驗(yàn)的研究。對(duì)本發(fā)明菌株的四環(huán)素耐藥機(jī)制進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，該菌株攜帶tetM耐藥基因，且通 過接合作用，該基因可以轉(zhuǎn)移至豬鏈球菌，表明該菌株是一株攜帶可轉(zhuǎn)移的tetM基因的特 殊菌株。該菌株可用于tetM耐藥基因水平傳播機(jī)制的研究，同時(shí)也為研究四環(huán)素耐藥性擴(kuò) 散的防控手段提供物質(zhì)基礎(chǔ)?？傊?，本發(fā)明菌株為單核細(xì)胞增生利斯特氏菌多重耐藥機(jī)制、耐藥性水平傳播機(jī) 制及其相應(yīng)的防控措施的的研究提供物質(zhì)平臺(tái)。


圖1本發(fā)明菌株特異性基因hlyf的PCR鑒定結(jié)果M =DNA Maker DL2000,1 本發(fā) 明菌株的PCR產(chǎn)物。圖2本發(fā)明菌株四環(huán)素耐藥基因tetM的PCR擴(kuò)增結(jié)果；M =DNA Marker 2000 ；1 陰性對(duì)照；2 本發(fā)明菌株的PCR產(chǎn)物。圖3各菌株紅霉素耐藥基因ermB的PCR鑒定結(jié)果；M =DNA Marker 2000 ；1 :B22菌 株；2 :D38菌株；3-21 接合菌株。圖4各菌株四環(huán)素耐藥基因tetM的PCR鑒定結(jié)果；M DNA Marker 2000 ；1 :B22菌 株；2 :D38菌株；3-21 接合菌株。圖5各菌株豬鏈球菌特異性基因cps的PCR鑒定結(jié)果；M =DNA Marker2000 ； 1 :B22 菌株；2 :D38菌株；3-21 接合菌株。圖6各菌株單核細(xì)胞增生利斯特氏菌特異性基因hlyf的PCR鑒定結(jié)果；M =DNA Marker 2000 ；1 :D38 菌株；2 :B22 菌株；3-21 接合菌株。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1本發(fā)明菌株的分離鑒定一、試驗(yàn)材料1樣品來源哈爾濱市各大超市和集貿(mào)市場(chǎng)采集鮮豬肉。2標(biāo)準(zhǔn)菌株單核細(xì)胞增生利斯特氏菌CMCC54006購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏中心。3培養(yǎng)基IA、LB2增菌液和SIM動(dòng)力半固體培養(yǎng)基購自北京陸橋生物公司，科瑪嘉 利斯特顯色培養(yǎng)基購自鄭州博賽生物工程有限責(zé)任公司，TSA-YE固體培養(yǎng)基、TSB-YE液體 培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，血平板由哈爾濱獸醫(yī)研究所細(xì)菌室自制。4引物單核細(xì)胞增生利斯特氏菌特異性引物(檢測(cè)溶血素基因hlyf的引物)由金 思特科技(南京)有限公司合成。引物序列如下
Hlyf-U 5' -CGCAACAAACTGAAGCAAAGG—3‘，Hlyf-L 5' -TTGGCGGCACATTTGTCAC-3‘二、試驗(yàn)方法1菌株分離按照國標(biāo)《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)_單核細(xì)胞增生利斯特氏菌》GB/T 4789. 30-2008進(jìn)行以無菌操作取樣品25g加入到225mL LB1增菌液中，30°C培養(yǎng)24h后， 移取0. ImL轉(zhuǎn)種于IOmL LB2增菌液內(nèi)進(jìn)行二次增菌，于30°C培養(yǎng)24h。取LB2 二次增菌液劃 線接種于科瑪嘉利斯特顯色培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)24h后，挑取可疑菌落劃線培養(yǎng)于血瓊脂 平板，37°C培養(yǎng)24h。然后選擇血平板上可疑菌落穿刺于SIM半固體培養(yǎng)基，25°C培養(yǎng)48h， 觀察其生長(zhǎng)情況。并進(jìn)一步將疑似菌落接種于TSA-YE培養(yǎng)基上進(jìn)行純培養(yǎng)。2菌株鑒定2. 1染色鏡檢參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(R. E.布坎南，N. E.吉本斯.中國科學(xué)院 微生物研究所《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》翻譯組譯.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].第8版.北京科 學(xué)出版社，1984.)，進(jìn)行革蘭氏染色，觀察細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)。同時(shí)，用生理鹽水制成菌懸液， 在油鏡下觀察該菌的運(yùn)動(dòng)情況。2. 2API Listeria鑒定將上述鑒定為疑似單核細(xì)胞增生利斯特氏菌的菌落制成菌 懸液，注入API Listeria試劑條上的每一個(gè)小管，在需氧條件下，37°C培養(yǎng)24小時(shí)，參考說 明書中讀表，在3分鐘內(nèi)讀完所有的反應(yīng)。2. 3PCR鑒定將API Listeria試劑條鑒定為單核細(xì)胞增生利斯特氏菌陽性的菌落 接種于TSB-YE培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h后，用基因組DNA提取試劑盒提取該菌株的基因組。然 后以94°C預(yù)變性3min ；94°C變性30s，61°C退火35s，72°C延伸35s, 30個(gè)循環(huán)；72°C終延伸 5min的反應(yīng)條件PCR擴(kuò)增單核細(xì)胞增生利斯特氏菌的特異性基因hlyf。三、試驗(yàn)結(jié)果1菌落特征在科瑪嘉利斯特菌顯色培養(yǎng)基上形成藍(lán)色帶有白色暈環(huán)的圓形菌落， 大小為l-2mm。且此菌落在血平板上可形成狹窄、透明的β溶血環(huán)，穿刺于SIM半固體培 養(yǎng)基，可見細(xì)菌沿穿刺線擴(kuò)散生長(zhǎng)，呈云霧狀，距培養(yǎng)基表面數(shù)毫米處出現(xiàn)一個(gè)倒傘形生長(zhǎng) 區(qū)。進(jìn)一步經(jīng)革蘭氏染色鑒定，此類菌落為陽性短桿菌，兩端鈍圓，多單在，有的呈V字型排 列。在油鏡下觀察可見明顯的旋轉(zhuǎn)翻滾運(yùn)動(dòng)。2. 2ΑΡΙ鑒定結(jié)果無害利斯特氏菌/單核細(xì)胞增生利斯特氏菌陰性，七葉苷陽性， 甘露糖苷酶陰性，D-阿拉伯醇陽性，D-木糖陰性，鼠利糖陽性，D-甲基-葡萄糖苷陽性，
核酸陰性，I"磷酸葡萄糖陰性，D-塔格糖陰性。2.3PCR鑒定結(jié)果從API Listeria試劑條鑒定為陽性的菌株中均擴(kuò)增到大小為 210bp的特異性基因片段hlyf，證實(shí)分離到的菌株為單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(見圖1)。實(shí)施例2本發(fā)明菌株的耐藥譜分析一、試驗(yàn)材料試驗(yàn)用藥敏片均購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。二、試驗(yàn)方法將本發(fā)明實(shí)施例1所分離到的D38菌株接種到TSB-YE培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)18h后用 滅菌生理鹽水洗下，并稀釋菌液至0. 5麥?zhǔn)媳葷?，菌液濃度校正后?5min內(nèi)接種完畢。用 滅菌棉拭子蘸取菌液，在管內(nèi)壁將多余菌液旋轉(zhuǎn)擠去后在TSA-YE平板均勻涂布接種3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60°，最后沿平板邊緣涂布一圈。加蓋后放置5min，待平板稍干后用鑷子將 藥敏紙片平放在平板上，并輕壓使其緊貼平板表面。每個(gè)平板貼4張藥敏紙片，兩紙片相距 25mm，紙片與平板邊緣不小于15mm，貼好紙片的平板于37°C培養(yǎng)18h后觀察結(jié)果。三、試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果如下(抑菌環(huán)直徑)萬古霉素22. 5mm、多西環(huán)素16. 6mm、麥迪霉素 27. 0mm、克拉霉素32. 0mm、磷霉素0. 0mm、呋喃妥因19. 0mm、多粘菌素B9. 0mm、氨芐西林 29. 0mm、四環(huán)素9. 5mm、卡那霉素19. 0mm、鏈霉素17. 0mm、氯霉素25. 0mm、諾氟沙星11. 5mm、 先鋒V26. 0mm、林可霉素16. 0mm、紅霉素26. 0mm、羅紅霉素31. 0mm、青霉素28. 0mm、利福平 23. 0mm、頭孢噻吩25. 0mm、頭孢噻肟0. 0mm、慶大霉素20. 0mm、復(fù)方新諾明28. 0mm、環(huán)丙沙星 19.Omm0根據(jù)NCCLS判斷標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明菌株對(duì)磷霉素、四環(huán)素、諾氟沙星和頭孢噻肟四種藥 物耐受，為四重耐藥菌株。實(shí)施例3本發(fā)明菌株四環(huán)素耐藥基因的確定一、試驗(yàn)材料1試劑DNA Marker、Ex Taq酶購自大連寶生物工程有限公司。2引物四環(huán)素耐藥基因tetM特異性引物由金思特科技(南京)有限公司合成。 引物序列如下tetm-U 5' -ACAGAAAGCTTATTATATAAC-3‘tetm-L 5' -TGGCGTGTCTATGATGTTCAC-3‘二、試驗(yàn)方法將本發(fā)明D38菌株接種于TSB-YE培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h后，用基因組DNA提取試 劑盒提取該菌株的基因組。然后以95°C預(yù)變性5min，94°變性30s，50°退火30s，72°延 伸lmin，30個(gè)循環(huán)，72°終延伸IOmin的反應(yīng)條件PCR擴(kuò)增四環(huán)素耐藥基因tetM。三、試驗(yàn)結(jié)果從本發(fā)明菌株中擴(kuò)增到大小約171bp的特異性基因片段tetM。具體擴(kuò)張結(jié)果見圖 2.實(shí)施例4本發(fā)明菌株四環(huán)素耐藥基因的接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)一、試驗(yàn)材料1供體菌株本發(fā)明實(shí)施例1所分離的D38菌株；2受體菌株耐受紅霉素的豬鏈球菌(B22)由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。3引物四環(huán)素耐藥基因tetM、紅霉素耐藥基因ermB、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌特異性基因hlyf及豬鏈球菌特異性基因cps的引物均由金思特科技(南京)有限公司合成。 引物序列分別如下tetm-U 5' -ACAGAAAGCTTATTATATAAC-3‘tetm-L 5' -TGGCGTGTCTATGATGTTCAC-3‘ermB-U 5' -GCGGATCCATGAACAAAAATATAAAAT-3‘ermB-L 5' -GCGTCGACTTTCCTCCCGTTAAATAAT-3‘hlyf-u 5' -CGCAACAAACTGAAGCAAAGG-3‘ -3'hlyf-L 5' -TTGGCGGCACATTTGTCAC-3-3‘
CPS-U 5' -ATGTTTGGAATACGCAGAGCAAAGAT-3‘CPS-L 5' -CAACAAGGGCTATTAAAGATACCGC-3‘二、試驗(yàn)方法1.從新鮮培養(yǎng)D 38、B22的TSA-YE平板上挑取單菌落分別接種到含四環(huán)素(濃 度20 μ g/mL)和紅霉素(濃度5 μ g/mL)的TSB-YE液體培養(yǎng)基中，37°C 200rpm培養(yǎng)過夜。2.分別將過夜培養(yǎng)的D38、B22菌液以的接種量轉(zhuǎn)接到四環(huán)素(濃度20 μ g/ mL)和紅霉素(濃度5 μ g/mL)的TSB-YE液體培養(yǎng)基中，37°C 200rpm培養(yǎng)2_3h。當(dāng)兩種菌 液的OD6tltl為0. 4-0. 5時(shí)，停止培養(yǎng)。3.將兩種菌液分別取ImL 6000rpm離心5min，用相應(yīng)無抗的液體培養(yǎng)基漂洗3_5 次。將兩種菌液以1 1比例混合(各取100 μ L)，常溫下6000rpm，離心5min。4.徹底去上清，加入100 μ L新鮮的TSB-YE液體培養(yǎng)基重懸細(xì)菌沉淀。5.將細(xì)菌重懸液50 μ L點(diǎn)種于不加抗生素的TSA-YE固體培養(yǎng)基平板上的硝酸纖 維素膜上，37°C接合反應(yīng)24h。6.用1. 5mL新鮮的TSB-YE液體培養(yǎng)基把硝酸纖維素膜上接合好的菌重新收集， 6000rpm離心3min，用200 μ L TSB-YE液體培養(yǎng)基懸起，分別取100 μ L菌懸液涂布于含四 環(huán)素(濃度20 μ g/mL)和紅霉素(濃度5 μ g/mL)的篩選培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)24h。7.挑選長(zhǎng)出的單菌落在不含四環(huán)素和紅霉素的TSA-YE培養(yǎng)基平板上進(jìn)行3次傳 代培養(yǎng)，37°C過夜培養(yǎng)。8.挑取傳代3次的單菌落，在含四環(huán)素(濃度20 μ g/mL)和紅霉素(濃度5 μ g/ mL)的TSB-YE液體培養(yǎng)基中37°C過夜培養(yǎng)。9. PCR鑒定前樣品處理取ImL菌液與1. 5mL EP管中，12000rpm離心3min，棄去 培養(yǎng)基。用ImL水將菌懸起，12000rpm離心3min，棄上清，如此反復(fù)洗3次。用50 μ L水將 菌懸起，沸水煮樣6min后迅速冰浴lOmin。12000rpm離心3min，取上清。將此上清做為模 板進(jìn)行PCR鑒定。10.采用PCR方法分別對(duì)供體菌株、受體菌株及接合菌株的紅霉素耐藥基因ermB、 四環(huán)素耐藥基因TetM、豬鏈球菌特異性基因Cps及單核細(xì)胞增生利斯特氏菌特異性基因 Hlyf進(jìn)行擴(kuò)增。其中tetM基因和hlyf基因的PCR反應(yīng)條件如前所述。ermB基因的反應(yīng)條 件為:95°C預(yù)變性5min，94°變性lmin，50°退火lmin，72°延伸lmin，30個(gè)循環(huán)，72終延 伸lOmin。cps反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min，94°變性30s，50°退火30s，72°延伸lmin， 30個(gè)循環(huán)，72°終延伸IOmin0三、試驗(yàn)結(jié)果1.本發(fā)明菌株D38與豬鏈球菌B22接合共得到接合菌株19株，接合轉(zhuǎn)移率為 4X10"。2.接合菌株經(jīng)PCR鑒定結(jié)果如下接合菌株均擴(kuò)增到大小約751bp的紅霉素耐藥 基因ermB(圖3)、大小約171bp的四環(huán)素耐藥基因tetM(圖4)及大小約351bp的豬鏈球菌 B22特異性片段cps(圖5)，未擴(kuò)增到單核細(xì)胞增生利斯特氏菌特異性基因hlyf (圖6)。上述試驗(yàn)結(jié)果說明本發(fā)明菌株D38中的四環(huán)素耐藥基因通過接合作用轉(zhuǎn)移到了 豬鏈球菌B22中。
權(quán)利要求
一株四重耐藥且攜帶可以轉(zhuǎn)移的四環(huán)素耐藥基因的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株(Listeria monocytogenes)，其微生物保藏號(hào)是CGMCC No.3342。
2.權(quán)利要求1所述的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株在作為研究單核細(xì)胞增生利斯特 氏菌耐藥機(jī)制的試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株中的用途。
3.權(quán)利要求1所述的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株在作為研究單核細(xì)胞增生利斯特 氏菌耐藥基因水平傳播的試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株及其用途。本發(fā)明單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株(Listeria monocytogenes)的微生物保藏號(hào)是CGMCCNo.3342。本發(fā)明菌株同時(shí)對(duì)磷霉素、四環(huán)素、諾氟沙星及頭孢噻肟四種抗生素耐受，為四重耐藥菌株，可用于單一耐藥機(jī)制和多重耐藥機(jī)制的研究，同時(shí)也可用于耐藥性消除試驗(yàn)的研究。本發(fā)明菌株是一株攜帶可轉(zhuǎn)移的tetM基因的特殊菌株，可用于tetM耐藥基因水平傳播機(jī)制的研究，同時(shí)也為研究四環(huán)素耐藥性擴(kuò)散的防控手段提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101812417SQ20091022419
公開日2010年8月25日 申請(qǐng)日期2009年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月27日
發(fā)明者劉思國, 劉慧芳, 尹錄, 王春來, 邵紅, 邵美麗 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)