專利名稱：擬南芥基因AtMPK6在植物抗旱方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼擬南芥AtMPK6的基因At2g43790在植物抗旱作用機(jī)制分析、培育 抗旱轉(zhuǎn)基因植物品種等方面的應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
干旱和旱災(zāi)從古至今都是人類面臨的主要自然災(zāi)害。水資源短缺現(xiàn)象日趨加劇， 嚴(yán)重限制植物生長發(fā)育，威脅世界范圍內(nèi)的糧食安全。隨著分子生物學(xué)和基因工程研究的 深入，國際上很多實(shí)驗(yàn)室也試圖尋找與植物抗旱相關(guān)的基因，擬通過基因工程技術(shù)改良作 物的抗旱性，但這方面的研究進(jìn)展仍然很緩慢。 現(xiàn)有研究表明，當(dāng)遭遇干旱脅迫時(shí)，植物體內(nèi)會產(chǎn)生和積累大量的活性氧 (ReactiveOxygen Species,ROS) 。 AtMPK6是植物體內(nèi)一種調(diào)節(jié)脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要激酶， 活性氧能夠激活A(yù)tMPK6，同時(shí)AtMPK6也能夠調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的ROS的產(chǎn)生，AtMPK6和ROS的 產(chǎn)生存在交叉調(diào)節(jié)作用。但其詳細(xì)機(jī)理還未見報(bào)道。因此，分析植物中MAP激酶功能，并研 究其與植物抗旱的關(guān)系，具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了擬南芥基因At2g43790在植物抗旱方面的應(yīng)用，以拓展 基因At2g43790的應(yīng)用范圍。 同時(shí)，本發(fā)明的目的還在于提供一種擬南芥基因At2g43790在培育抗旱轉(zhuǎn)基因植 物方面的應(yīng)用。 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了擬南芥基因At2g43790突變，研究
突變體在植物抗逆過程中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因在植物抗旱方面作用顯著。所述的基因At2g43790基因的CDS長度為1188bp，編碼395個(gè)氨基酸的蛋白，該蛋
白為一個(gè)MAP激酶，該基因編碼的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位未知。 所述的At2g43790的基因編碼一個(gè)MAP激酶，該基因編碼的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位 未知。所述的At2g43790基因突變體從擬南芥資源中心(ABRC，Ohio State University)獲得。 本發(fā)明的技術(shù)方案涉及擬南芥基因At2g43790在培育抗旱轉(zhuǎn)基因植物方面的應(yīng) 用。 將At2g43790基因突變或沉默獲得忍受干旱脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明利用從擬南芥資源中心獲得的At2g43790基因T-DNA插入突變體
(Atmpk6)，研究發(fā)現(xiàn)突變體對干旱脅迫不敏感。 本發(fā)明編號為At2g43790的基因編碼MAP激酶，該基因的功能缺失突變體對干旱 不敏感，表現(xiàn)出顯著的抗旱現(xiàn)象。 本發(fā)明用激光共聚焦檢測在脅迫激素ABA處理下野生型(WT)和突變體(Atmpk6)原生質(zhì)體內(nèi)ROS產(chǎn)生和積累情況，發(fā)現(xiàn)在脅迫條件下Atmpk6原生質(zhì)體內(nèi)積累大量的R0S。
本發(fā)明用水母發(fā)光蛋白基因轉(zhuǎn)化WT和Atmpk6植株，篩選、檢測在甘露醇滲透脅迫 下植株內(nèi)的Ca2+濃度動力學(xué)變化情況，發(fā)現(xiàn)滲透脅迫下Atmpk6植株Ca2+濃度比WT植株含 量高。本發(fā)明通過對At2g43790基因功能的分析鑒定，確立了 At2g43790在植物抗旱中 的作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制，為培育抗旱的轉(zhuǎn)基因作物新品種奠定了理論和生產(chǎn)實(shí)踐基礎(chǔ)。
本發(fā)明從擬南芥At2g43790基因T-DNA插入得到能夠調(diào)節(jié)植物抗旱的功能缺失突 變體Atmpk6，為獲得抗旱作物新品系提供了遺傳學(xué)材料和基礎(chǔ)。


圖1為同期播種正常生長和正常生長30天后土壤干旱10天的WT和Atmpk6植 株； 圖2為ABA脅迫處理下WT和Atmpk6原生質(zhì)體內(nèi)ROS變化趨勢。 圖3為轉(zhuǎn)化水母發(fā)光蛋白的WT和Atmpk6植株在甘露醇滲透脅迫下體內(nèi)Ca2+動力
學(xué)變化趨勢。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例一 At2g43790基因的抗旱性分析 如圖1所示，幼苗在光/暗周期為8/16h，溫度22°C，黑暗溫度18°C，相對濕度 80%，光照強(qiáng)度90mol *m-2 s_l的條件下生長4周后，A組正常澆水，B組停止?jié)菜?0天。 多次試驗(yàn)結(jié)果顯示在正常生長條件下，WT和Atmpk6植株生長良好，沒有明顯差別(圖A); 而持續(xù)干旱10天后WT和Atmpk6植株生長狀況對比明顯，95%的WT植株被旱死，而98%的 Atmpk6植株仍然存活(圖B)。這些試驗(yàn)結(jié)果表明AtMPK6功能缺失以后，擬南芥獲得了更 強(qiáng)的抗旱性。
實(shí)施例二 脅迫處理下WT和Atmpk6原生質(zhì)體內(nèi)ROS變化檢測 如圖2所示，利用ROS熒光探針H2DCF-DA負(fù)載WT和Atmpk6根原生質(zhì)體，在激光共 聚焦熒光顯微鏡上，488nm， Time-Course掃描，檢測ABA處理后ROS的動態(tài)變化，加入10 y M ABA后，Atmpk6原生質(zhì)體的熒光強(qiáng)度迅速增加，10min左右時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，表明此時(shí) 原生質(zhì)體內(nèi)ROS大量產(chǎn)生并積累，而WT原生質(zhì)體熒光強(qiáng)度變化不大。
實(shí)施例三 滲透脅迫下WT和Atmpk6植株體內(nèi)Ca2+動力學(xué)變化檢測 將水母發(fā)光蛋白基因轉(zhuǎn)化到擬南芥中，得到第一代轉(zhuǎn)基因植株的種子，撒播在于 含有潮霉素(hygromycin B) 30 y g L_l的MS培養(yǎng)基上，篩選出轉(zhuǎn)入水母發(fā)光蛋白基因的 植株進(jìn)行分析。 如圖3所示，在330mM甘露醇模擬干旱處理下，WT和Atmpk6植株體內(nèi)Ca2+的變化 具有明顯差別WT Ca2+濃度的最高峰值為0. 5978 y M(n = 15) ， Atmpk6鈣離子濃度最高峰 值為1. 868647 iiM(n = 12)。
權(quán)利要求
一種擬南芥基因At2g43790在植物抗旱方面的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的擬南芥基因At2g43790在植物抗旱方面的應(yīng)用，其特征在于所述的基因At2g43790為編碼一種擬南芥MAP激酶的基因，該基因的CDS長度為1188bp，編碼395個(gè)氨基酸的蛋白。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的擬南芥基因At2g43790在植物抗旱方面的應(yīng)用，其特征在于所述的At2g43790的基因編碼一個(gè)擬南芥MAP激酶，目前該激酶在細(xì)胞內(nèi)的定位未知。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的擬南芥基因At2g43790在植物抗旱方面的應(yīng)用，其特征在于所述的At2g43790基因從擬南芥資源中心(ABRC，Ohio StateUniversity)獲得。
5. —種擬南芥基因At2g43790在培育抗旱轉(zhuǎn)基因植物方面的應(yīng)用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的擬南芥基因At2g43790在培育抗旱轉(zhuǎn)基因植物方面的應(yīng)用，其特征在于將At2g43790基因突變或沉默獲得抗旱相關(guān)的轉(zhuǎn)基因植物。
全文摘要
水資源短缺現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，干旱化趨勢已成為全球關(guān)注的問題。干旱限制了植物生長發(fā)育，造成農(nóng)作物的減產(chǎn)甚至絕收，威脅我國糧食安全性。編號為AT2g43790的Atmpk6(Arabidopsis thaliana MAP kinase 6)基因編碼的一種MAP激酶，調(diào)節(jié)干旱脅迫引起的植物體內(nèi)的活性氧的產(chǎn)生和積累。在土壤干旱持續(xù)10天的條件下，突變體植株仍然存活，而對照野生型植株已被干旱致死，在脅迫條件下，突變體內(nèi)活性氧和Ca2+水平均比野生型高。我們分析了AtMPK6在植物抗干旱脅迫中的作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制，確立了AtMPK6參與植物脅迫激素ABA誘導(dǎo)的活性氧代謝機(jī)制，為培育抗旱的轉(zhuǎn)基因作物新品種奠定了理論和生產(chǎn)實(shí)踐基礎(chǔ)。
文檔編號C12N9/12GK101748143SQ20091022753
公開日2010年6月23日 申請日期2009年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月18日
發(fā)明者張華 , 江靜, 王文樂, 王淑靜 申請人:河南大學(xué)