專利名稱：能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌及發(fā)酵方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程領域，涉及一種能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌
及發(fā)酵方法。
背景技術：
隨著化石能源的日益枯竭，溫室效應的逐步顯現，清潔可替代能源已成為全球的 研究熱點，以木質纖維素為原料發(fā)酵生產燃料乙醇的研發(fā)工作更是備受關注。自然界中可 再生的木質纖維素資源極為豐富，其主要成份之一是半纖維素。半纖維素中的85% 90% 為木糖(Lachke 2002)，因此利用木糖發(fā)酵生產乙醇對木質纖維素的有效利用、解決當前能 源危機有重要意義。 然而，自然界中高效產醇的菌種通常只能利用葡萄糖等六碳糖生產乙醇，不能利 用木糖；而少數能利用木糖產醇的菌株，產醇能力低下，這限制了對自然界中木質纖維素的 有效利用。運動發(fā)酵單胞菌具有產醇量高、生物量形成少、無氧氣需求、乙醇耐受性高、糖濃 度耐受性高等優(yōu)點，但其利用的底物范圍較窄，只能利用葡萄糖、果糖和蔗糖等六碳糖發(fā)酵 (Rogers 2007)。若構建能利用木糖產醇的重組運動發(fā)酵單胞菌，使其能有效利用木質纖維 素各組分，對清潔可替代能源的生產有重要的意義。 運動發(fā)酵單胞菌利用ED(Entner-Doudoroff)途徑實現高效產醇，缺少完整的磷 酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway)，要引入木糖異構酶、木酮糖激酶、轉醛酶和轉 酮酶才能構成完整的代謝途徑，轉換木糖成ED途徑的中間產物，使運動發(fā)酵單胞菌能發(fā)酵 木糖生產乙醇。 欲將外源木糖異構酶、木酮糖激酶、轉醛酶和轉酮酶基因在運動發(fā)酵單胞菌中表 達，須考慮表達載體和外源基因的性質、啟動子和SD序列、宿主菌調控系統(tǒng)等。運用基因 工程改良宿主菌的代謝途徑或運用低拷貝的質粒作表達載體表達目的基因時，可通過改變 目的基因的mRNA穩(wěn)定性來調控基因表達，mRNA穩(wěn)定性的增加將使mRNA的豐度增加，會導 致蛋白表達量按比例的增加(Smolke 2000 ;Pfleger 2006)。提高mRNA穩(wěn)定性可通過改變 目的基因的調控元件來實現，諸如改變非翻譯區(qū)的二級結構，核糖體結合序列等調控元件 (Carrier 1997)。轉錄終止子對外源基因在細菌中的高效表達有重要作用。
大腸桿菌rrnB操縱元T1T2是強而有力的轉錄終止子，可以有效預防轉錄中的通 讀現象并保證表達質粒的穩(wěn)定性，進而提高外源基因在原核細胞中的表達水平，大腸桿菌 的rrnB能增加外源基因在大腸桿菌中、枯草芽孢桿菌中外源基因的表達量(戎2005 ;Wang 1992);然而目前未有將rrnB與木糖代謝相關基因組成操縱子在運動發(fā)酵單胞菌中使用的 報道。J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾，分子克隆實驗指南(上冊)(第三版)，黃培堂等譯，北 京科學出版社，2002 Carrier TA and Keasling 瓜Controlling Messenger RNA Stability in Bacteria :Strategies forengineering Gene Expression. Biotechnol. Prog. 1997，13 : 699-708.
Lachke A.Biofuel from D_xylose_the second most abundant sugar. Resource,2002，50 :50-58. Pfleger BF， Pitera DJ， Smolke CD， Keaslin JD. Combinatorial engineering of intergenic regions inoperons tunes expression of multiple genes. Nature Biotechnology. 2006,24 :1027-1032. Rogers PL，Jeon YJ，Lee KJ，et al. Zymomonas mobilis for Fuel Ethanol and Higher ValueProducts. Adv Biochemical Eng Biotechnology, 2007，108 :263-288.
Smolke CD， Carrier TA， Keasling瓜Coordinated Differential Expression of Two Genes throughDirected mRNA Cleavage and Stabilization by Secondary Structures. Applied and EnvironmentalMicrobiology，2000，66 :5399—5405.
Wang， LF， Doi RH. Heterologous gene expression in Bacillus subtilis. Biotechnology,1992,22 :63-104. 戎晶晶，刁振宇，周國華.大腸桿菌表達系統(tǒng)的研究進展[J].藥物生物技術， 2005,12(006) :416-420.

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是克服現有技術中的不足，提供一種能利用木糖生產乙醇的重組運 動發(fā)酵單胞菌GX1 (Zymomonas mobilis) CGMCC 3438。 本發(fā)明的第二個目的是提供一種獲得能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞 菌的方法。 本發(fā)明的第三個目的是提供能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌的發(fā)酵 方法。 —種能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌GXl (Zymomonas mobilis)在 2009年11月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市 朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏號CGMCC 3438。 獲得一種能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌的方法，包括如下步驟
(1)能在大腸桿菌和運動發(fā)酵單胞菌中復制的穿梭表達載體pZ的構建首先用 SDS堿裂解法(薩姆布魯克，2002)提取Z. mobilis (ATCC NO. 10988)中的質粒，用AvaI酶 切所述質粒后電泳，回收2. 7kb的質粒線形片斷，連接后即得到運動發(fā)酵單胞菌質粒pZM2 ; 提取大腸桿菌質粒pACYC，將所述大腸桿菌質粒pACYC和所述運動發(fā)酵單胞菌質粒pZM2用 Aval酶切，連接后構建成表達載體pZ ; (2)表達木糖代謝基因的穿梭載體pXylose的構建 提取大腸桿菌K12基因組DNA和運動發(fā)酵單胞菌(ATCC NO. 31821)基因組DNA ;
以運動發(fā)酵單胞菌(ATCC NO. 31821)基因組DNA為模板，以序列表SEQ ID NO. 1 和SEQID NO. 2所述序列為PCR引物，擴增運動發(fā)酵單胞菌的啟動子Pgap ;
以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，以序列表SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所述 序列為PCR引物，擴增編碼木糖異構酶XylA基因和木糖激酶XylB基因及非翻譯區(qū)序列，擴 增產物經過Kpn I和Xba I酶切后連接至pUC19質粒中，再經Nsi I和Sma I酶切后，補平 粘末端后連接得到載體pXX ;
以pXX為模板，以序列表SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 4所述序列為PCR引物重新 擴增XylA-XylB，通過重疊延伸PCR將所述Pg即和XylA-XylB連接成一個操縱子，用EcoR I消化后連接到所述載體pZ中，得到質粒PZ-XX ; 以運動發(fā)酵單胞菌(ATCC NO. 31821)基因組DNA為模板，以序列表SEQ ID NO. 5 和SEQID NO. 6所述序列為PCR引物擴增eno基因的啟動子； 以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，以序列表SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8所述
序列為PCR引物擴增得到編碼轉醛酶的Tal基因，通過重疊延伸PCR，形成Peno-Tal的融合 基因片段，構建至TA載體pGMT，得到質粒pTal ; 以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，以序列表SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10所述 序列為PCR引物擴增轉酮酶Tkt基因； 以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，以序列表SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 12所 述序列為PCR引物擴增rrnB，通過重疊延伸PCR獲得Tkt-rrnB的融合DNA片斷；用Xba I 和Sphl雙切質粒pTal和DNA片斷Tkt-rrnB，連接后得到質粒pTT ;所述pTT和質粒PZ-XX 用Ncol酶切消化后連接得到含有代謝木糖所需的外源基因木糖異構酶基因、木酮糖激酶 基因、轉酮酶基因、轉醛酶基因和基因表達調控元件大腸桿菌終止子rrnB、運動發(fā)酵單胞菌 g即和eno啟動子的質粒pXylose ; (3)質粒pXylose向運動發(fā)酵單胞菌的轉化將質粒pXylose轉化到運動發(fā)酵單 胞菌CP4(CICC 10232)中，獲得重組菌株； (4)將所述重組菌株按體積百分含量為2_10%的接種量接種到5ml含木糖的RM 液體培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)至0D600為1. 0后轉接到另一個新的含木糖的RM液體培養(yǎng)基中 繼續(xù)培養(yǎng)，所述轉接的次數為8-12次，獲得一種能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞 菌菌株GX1 (Zymomonas mobilis) CGMCC 3438 ;所述含木糖的RM液體培養(yǎng)基為20g/L木糖、 10g/L酵母提取物和KH2P04 2g/L，余量為水。 所述步驟(3)質粒pXylose向運動發(fā)酵單胞菌的轉化為將運動發(fā)酵單胞菌 CP4(CICC10232)培養(yǎng)物按體積百分含量為0. 5-1. 5%的接種量接種到50ml RM液體培養(yǎng)基 中，3(TC靜止培養(yǎng)至0D6。。 = 0. 5 ;6000rpm離心5min，收集菌體，用冰浴的體積百分含量為 10%的甘油水溶液洗滌2-4次，用2ml體積百分含量為10%的甘油水溶液懸浮混勻，即得 感受態(tài)細胞；取40 iil感受態(tài)細胞，加入1 y g質粒pXylose混合，轉移至無菌預冷的lmm電 擊杯中，1800V電擊，迅速加入450ul RM液體培養(yǎng)基，混勻后轉移到1.5ml無菌離心管中， 3(TC靜置培養(yǎng)12-17小時；將培養(yǎng)物涂布于含20 ii g/ml四環(huán)素的RM固體培養(yǎng)基篩選平板， 倒置放于培養(yǎng)箱3(TC培養(yǎng)2 3天，挑選轉化子；菌落經PCR鑒定后，選取轉化子測定外源 蛋白木糖異構酶、木酮糖激酶、轉酮酶或轉醛酶的酶活，獲得一種能利用木糖生產乙醇的重 組運動發(fā)酵單胞菌菌株，所述RM液體培養(yǎng)基為20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物和KH2P04 2g/L，余量為水，所述RM固體培養(yǎng)基為20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、20g/L瓊脂粉和 KH2P04 2g/L，余量為水。 —種能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌菌株的發(fā)酵方法，包括如下步 驟 將能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌的菌株GX1 (Zymomonas mobilis) CGMCC3438在含木糖的液體RM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌體濃度0D600 = 1. 0_1. 5，離心濃縮菌體，
6接種到含木糖和葡萄糖的M液體培養(yǎng)基中，初始菌體的濃度控制在0D600 = 0. 1-0. 2，在上述菌分別在30°C _341:發(fā)酵48-96小時；所述含木糖和葡萄糖的RM液體培養(yǎng)基為25g/L木糖、25g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物和KH2P04 2g/L，余量為水。
本發(fā)明的創(chuàng)新點 本發(fā)明首次將大腸桿菌rrnB調控元件與木糖代謝相關基因融合，構建帶有人工融合操縱子的質粒，通過電轉化和馴化的方法獲得的能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌菌株，它能高效表達外源基因和利用木糖產醇。天然的運動發(fā)酵單胞菌只能利用葡萄糖、果糖和蔗糖等六碳糖發(fā)酵，而本發(fā)明中的一種能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌能在30_34°C的條件下能高效的利用葡萄糖和木糖共發(fā)酵產醇，并且能利用含有木糖和葡萄糖的玉米芯水解液產醇。自然界中有諸多的廢棄的木質纖維素，其主要成份之一是半纖維素。半纖維素中的85% 90%為木糖(Lachke 2002)，因此本發(fā)明的菌株對有效的利用廢棄的木質纖維素生產清潔能源、解決當前能源危機具有重要意義。


圖1為表達載體PZ的構建過程 圖2為運動發(fā)酵單胞菌和大腸桿菌穿梭載體的構建過程。
圖3是重組菌株在2 %木糖中的生長曲線。 圖4是一種能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌菌株在2%木糖中的生長曲線。 圖5 —種能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌菌株在各溫度條件下共發(fā)酵葡萄糖和木糖產醇。A為在各種溫度條件下發(fā)酵葡萄糖的消耗和乙醇生成；B為在各種溫度條件下發(fā)酵菌株的生長曲線及木糖的消耗情況；C為在各種溫度條件下副產物甘油的生成情況；D為在各種溫度條件下副產物乙酸的生成情況；E為在各種溫度條件下副產物木糖醇的生成情況。 圖6為一種能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌菌株在NBS公司的發(fā)酵罐中發(fā)酵的情況，在30度pH5. 5的25g/L的葡萄糖和木糖的RM培養(yǎng)基中條件下發(fā)酵，菌體的濃度、糖濃度、乙醇產量等。 圖7為一種能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌菌株在30度pH5. 5條件下在玉米芯水解液中的發(fā)酵情況。
具體實施例方式
下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明。 實施例1能在大腸桿菌和運動發(fā)酵單胞菌中復制的穿梭表達載體pZ的構建首先用SDS堿裂解法(薩姆布魯克，2002)提取Z. mobilis (ATCC10988)的質粒，用Ava I酶切質粒后電泳，回收2.7kb的質粒線形片斷，連接后即得到運動發(fā)酵單胞菌的pZM2質粒。用SDS堿裂解法提取大腸桿菌質粒pACYC。以大腸桿菌質粒pACYC和運動發(fā)酵單胞菌的質粒pZM2為基礎，用Aval酶切后連接成質粒pZ。 pZ含有大腸桿菌和運動發(fā)酵單胞菌的復制原點(圖1)，即能在上述兩種宿主菌中復制。 實施例2表達木糖代謝基因的穿梭載體pXylose的構建
用天根公司的細菌基因組提取試劑盒提取大腸桿菌K12基因組DNA和運動發(fā)酵單胞菌(ATCC NO. 31821)基因組DNA ; 以運動發(fā)酵單胞菌(ATCC NO. 31821)的基因組為模板，以序列表SEQ ID NO. 1和SEQ IDNO. 2所述序列為PCR引物，擴增運動發(fā)酵單胞菌的啟動子Pgap ;
以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，以序列表SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所述序列為PCR引物，擴增編碼木糖異構酶XylA基因和木糖激酶XylB基因及非翻譯區(qū)，擴增產物經過Kpn I和Xba I酶切后連接至pUC19質粒中，再經Nsi I和Sma I酶切后，補平粘末端后連接得到載體pXX ; 以pXX為模板，以序列表SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 4所述序列為PCR引物重新擴增XylA-XylB，通過重疊延伸PCR將所述Pg即和XylA-XylB連接成一個操縱子，用EcoRI消化后連接到實施例1中構建的載體pZ中，得到質粒PZ-XX ; 以運動發(fā)酵單胞菌(ATCC NO. 31821)基因組DNA為模板，以序列表SEQ ID NO. 5和SEQIDNO. 6所述序列為PCR引物擴增eno基因的啟動子； 以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，以序列表SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8所述
序列為PCR引物擴增得到編碼轉醛酶的Tal基因，通過重疊延伸PCR，形成Peno-Tal的融合基因片段，構建至TA載體pGMT，得到質粒pTal ; 以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，以序列表SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10所述序列為PCR引物擴增轉酮酶Tkt基因； 以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，以序列表SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 12所述序列為PCR引物擴增rrnB，通過重疊延伸PCR獲得Tkt-rrnB的融合DNA片斷；用Xbal和Sphl雙切質粒pTal和DNA片斷Tkt-rrnB，連接后得到質粒pTT ;所述pTT和質粒PZ-XX用Ncol酶切消化后連接得到含有代謝木糖所需的外源基因木糖異構酶基因、木酮糖激酶基因、轉酮酶基因、轉醛酶基因和基因表達調控元件大腸桿菌終止子rrnB、運動發(fā)酵單胞菌g即和eno啟動子的質粒pXylose(見圖2)。質粒pXylose含有能編碼木糖代謝的木糖異構酶、木糖激酶、轉醛酶及轉酮酶基因，這四種酶能和運動發(fā)酵單胞菌中已有的組份構成新的代謝途徑將木糖有效的轉換成乙醇。SEQIDNO-1 :5' ctcagaattctgtcgatgccgagttggactt3';SEQIDNO.2 :5' aataggcttgcatgtttattctcctaactta3';SEQIDNO-3 :5' ctcggtaccatgcaagcctattttgacca3';SEQIDNO.4 :5' gtttctagagaattctgcctctcgtgtcagcgtg 3';SEQIDNO-13:5' gagaataaacatgcaagcctattttgacca3' sSEQIDNO.5 :5' cccatggctcgagatctccagttactcaata3';SEQIDNO-6 :5' tgtccgtcatatcgaaacctttcttaaaat3';SEQIDNO.75' aggtttcgatatgacggacaaattgacctc3'SEQIDNO-85' cgtctagattacagcagatcgccgatca3'SEQIDNO.9 : 5' cgtctagacgatctggagtcaaaatgtcc3';SEQIDNO-10:5' cgccaaaacagttacagcagttcttttgctttc3';SEQIDNO.11:5' aactgctgtaactgttttggcggatgagaga3';SEQIDNO.12:5' tc朋tgc3tgcc3tgg33g3gtttgteg333cgc朋3'。
實施例3重組菌株的獲得 用promega公司的大提質粒試劑盒提取質粒pXylose 。將運動發(fā)酵單胞菌CP4(CICC10232)培養(yǎng)物按O. 5%或1. 5%接種量接種到裝有50ml RM液體培養(yǎng)基中，3(TC靜止培養(yǎng)至0D6。。 = 0. 5 ;6000rpm離心5min，收集菌體，用冰浴的體積百分含量為10%的甘油水溶液洗滌2次或4次，用2ml體積百分含量為10%的甘油水溶液懸浮混勻，即得感受態(tài)細胞；取40iU感受態(tài)細胞，加入1 y g質粒pXylose混合，轉移至無菌預冷的lmm電擊杯中，1800V電擊，迅速加入450ul RM體培養(yǎng)基，混勻后轉移到1. 5ml無菌離心管中，3(TC靜置14小時(也可以選12小時或17小時)，將培養(yǎng)物涂布含20 ii g/ml四環(huán)素的RM固體培養(yǎng)基篩選平板，倒置放于培養(yǎng)箱3(TC培養(yǎng)2至3天，挑選轉化子；菌落經PCR鑒定后，選取三個轉化子測定外源蛋白木糖異構酶的酶活分別為0. 0471、0. 0552和0. 0676U/mg，即成功的獲得了重組菌株。(也可以測定木酮糖激酶、轉酮酶或轉醛酶的酶活)，RM液體培養(yǎng)基為20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物和2g/L KH2P04，余量為水，RM固體培養(yǎng)基為20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、20g/L瓊脂粉和2g/L K^P(V余量為水。
實施例4重組菌株利用木糖生長觀察 將重組菌株在含有20g/L葡萄糖的RM培養(yǎng)基中于3(TC靜置培養(yǎng)至0D6。。為1. 2左右，菌液離心后，用不含任何糖組分的RM培養(yǎng)基重懸菌體，洗滌一次，將濃縮菌體接種到含20g/L木糖的RM培養(yǎng)基中，接種后初始0D6。。為0. 08，放于3(TC溫箱靜止培養(yǎng)。在0至96小時菌0D600從0. 08-0. 088，無顯著變化;120至192h時，0D600從1. 161增長至1. 359，在312h最大菌體濃度0D6。。在1. 48左右(圖3)。
實施例5重組菌株適應木糖發(fā)酵產醇的馴化培養(yǎng) 為提高重組菌株利用木糖的能力，將重組菌株按體積百分含量為5% (也可以選2%或10% )的接種量接種到5ml含木糖的RM液體培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)至0D600為1. 0后轉接到另一個新的含木糖的M液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，所述轉接的次數為10次(也可以選8次或12次)，獲得一種能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌菌株；所述含木糖的RM液體培養(yǎng)基為20g/L木糖、10g/L酵母提取物和KH2P(^2g/L，余量為水。菌體適應木糖的生長能力增強，菌株起始的培養(yǎng)濃度為0D600 = 0. 114，經過34h后0D600即能達到1. 775，最大菌體濃度0D6。。為1. 915 (圖4)，菌株于-70度保存供后續(xù)的發(fā)酵使用。
實施例6能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌共發(fā)酵葡萄糖和木糖生產乙醇的發(fā)酵溫度優(yōu)化 在含木糖和葡萄糖的RM液體培養(yǎng)基中，將能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌分別在26。C、30。C、34。C、37。C和40。C五個溫度梯度條件下發(fā)酵，通過EChrom98HPLC測得的測定發(fā)酵液中的能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌菌體濃度、糖的消耗及乙醇的生成、木糖醇等副產物含量，優(yōu)化發(fā)酵產醇的溫度。 菌株在上述的溫度條件下發(fā)酵，發(fā)酵溫度越高葡萄糖消耗越快，在24h內完全利用葡萄糖(圖5A)。木糖消耗隨發(fā)酵溫度的不同變化較為明顯在3(TC和3fC的條件下發(fā)酵，木糖利用的最好發(fā)酵96h時，木糖利用率分別達到93. 4%和95. 4%;在37。C和4(TC發(fā)酵，木糖利用率有所降低；在26t:下，木糖利用率最低(圖5B)，即溫度過高和過低都不利于木糖的利用。 隨著葡萄糖及木糖的消耗，乙醇逐漸生成。在3(TC和34t:下，乙醇產量最高，達到23. 0g/L和23. 3g/L，菌體終濃度也最高；而在37。C和4(TC下發(fā)酵，乙醇產量降低，菌體濃度降低(圖5A， B)。而26t:菌體濃度最低，乙醇僅為17. 54g/L(圖5B)。在30°C，34°C，37t:，4(TC條件下發(fā)酵，48小時乙醇產量基本達到最大值，72小時和96小時乙醇產量無顯著增長；即利用GX1在3(TC至34t:發(fā)酵48小時可取得較好的效果。 發(fā)酵溫度越高副產物甘油生成的越多(圖5C)。在3fC和37t:發(fā)酵時，乙酸最大生成量較高，分別為0. 53g/L和0. 52g/L，在4(TC和3(TC下乙酸生成量次之，在26。C最低(圖5D)。木糖醇在3(TC和34t:發(fā)酵時分別為1. 25g/L和1. 06g/L，高于其它溫度條件下發(fā)酵所生成的0. 8g/L左右(圖5E)。 綜上，在3(TC和34t:下發(fā)酵48-96小時，木糖利用率和乙醇生成量高，副產物生成少，是最適發(fā)酵溫度條件。 含木糖和葡萄糖的RM液體培養(yǎng)基為25g/L木糖、25g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物和K^P042g/L，余量為水。 實施例7能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌共發(fā)酵葡萄糖和木糖生產乙醇 取能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌接種至5ml的RM木糖培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)21h，將上述5ml菌液轉接至300ml RM木糖培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)36h后收集菌體，重懸菌體后接種至3-L的BI0FL0 3000發(fā)酵罐(New Brunswick Scientific, Edison， NJ)中發(fā)酵，發(fā)酵罐中培養(yǎng)基為含木糖和葡萄糖的RM液體培養(yǎng)基，菌的初始0D6。。 = 0. 2，工作體積為1. 5L。根據實施例6選擇在30°C 、pH值5. 5和轉速150rpm條件下發(fā)酵。定時取樣分析生物量、糖、乙醇及副產物濃度。 葡萄糖在20h即可完全消耗，木糖濃度在24h時降至0. 45g/L，利用率為98. 2%，此時的乙醇濃度也接近最高值，達到22. 4g/L。在發(fā)酵32h時，乙醇最高產率為22. 54g/L，乙醇得率為87. 8% 。菌體濃度在16h就已達到最大值0D6。。為2. 0，發(fā)酵過程中也伴隨產生副產物木糖醇、乙酸和甘油的產生，分別為0. 9g/L，0. 8g/L和1. 5g/L(圖6)。
實施例8能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌在玉米芯水解液中的發(fā)酵
將能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌接種至含有35.6g/L葡萄糖和12. 9g/L木糖的玉米芯纖維素水解液中，3(TC靜置發(fā)酵。取樣測定糖、乙醇及木糖醇、甘油和乙酸等副產物的濃度。發(fā)酵24h內葡萄糖基本消耗完，僅剩0. 3g/L ;木糖利用率為84. 8%，剩1. 96g/L，最終生成的乙醇濃度分別為20. 26g/L(圖7)，乙醇得率(基于消耗糖計算的乙醇得率)達到理論值的87. 6%，基于總糖計算的乙醇得率為理論值的83. 0%，即重組菌在玉米芯水解液中有較強的產醇能力。水解液自身就存在發(fā)酵副產物木糖醇、乙酸等，發(fā)酵中產生的副產物木糖醇、乙酸的量與同等糖濃度培養(yǎng)基中發(fā)酵產生的量基本一致。本發(fā)明的重組菌株能較好的利用纖維素為原料的水解液進行發(fā)酵，為高效利用木質纖維素各組份生產乙醇奠定了基礎。
權利要求
一種能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌GX1(Zymomonas mobilis)CGMCC3438。
2. 獲得權利要求l的一種能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌的方法，其特征 是包括如下步驟(1) 能在大腸桿菌和運動發(fā)酵單胞菌中復制的穿梭表達載體PZ的構建首先用SDS 堿裂解法提取Z. mobilis (ATCC NO. 10988)中的質粒，用Aval酶切所述質粒后電泳，回 收2. 7kb的質粒線形片斷，連接后即得到運動發(fā)酵單胞菌質粒pZM2 ;提取大腸桿菌質粒 pACYC，將所述大腸桿菌質粒pACYC和所述運動發(fā)酵單胞菌質粒pZM2用Aval酶切，連接后 構建成表達載體pZ ;(2) 表達木糖代謝基因的穿梭載體pXylose的構建提取大腸桿菌K12基因組DNA和運動發(fā)酵單胞菌(ATCC NO. 31821)基因組DNA ;以運動發(fā)酵單胞菌(ATCC NO. 31821)基因組DNA為模板，以序列表SEQ ID NO. 1和 SEQID NO. 2所述序列為PCR引物，擴增運動發(fā)酵單胞菌的啟動子Pgap ;以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，以序列表SEQID NO. 3和SEQ ID NO. 4所述序列為 PCR引物，擴增編碼木糖異構酶XylA基因和木糖激酶XylB基因及非翻譯區(qū)擴增產物經過 Kpn I和Xbal酶切后連接至pUC19質粒中，再經Nsi I和Sma I酶切后，補平粘末端后連接 得到載體PXX ;以PXX為模板，以序列表SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 4所述序列為PCR引物重新擴增 XylA-XylB，通過重疊延伸PCR將所述Pg即和XylA-XylB連接成一個操縱子，用EcoR I消 化后連接到所述載體pZ中，得到質粒PZ-XX ;以運動發(fā)酵單胞菌(ATCC NO. 31821)基因組DNA為模板，以序列表SEQID NO. 5和SEQID NO. 6所述序列為PCR引物擴增eno基因的啟動子；以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，以序列表SEQID NO. 7和SEQID NO. 8所述序列為 PCR引物擴增得到編碼轉醛酶的Tal基因，通過重疊延伸PCR，形成Peno-Tal的融合基因片 段，構建至TA載體pGMT，得到質粒pTal ;以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，以序列表SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10所述序列 為PCR引物擴增轉酮酶Tkt基因；以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，以序列表SEQ ID NO. ll和SEQ ID NO. 12所述序列 為PCR引物擴增rrnB，通過重疊延伸PCR獲得Tkt-rrnB的融合DNA片斷；用Xba I和Sphl 雙切質粒pTal和DNA片斷Tkt-rrnB，連接后得到質粒pTT ;所述pTT和質粒PZ-XX用Ncol 酶切消化后連接得到含有代謝木糖所需的外源基因木糖異構酶基因、木酮糖激酶基因、轉 酮酶基因、轉醛酶基因和基因表達調控元件大腸桿菌終止子rrnB、運動發(fā)酵單胞菌gap和 eno啟動子的質粒pXylose ;(3) 質粒pXylose向運動發(fā)酵單胞菌的轉化將質粒pXylose轉化到運動發(fā)酵單胞菌 CP4(CICC 10232)中，獲得重組菌株；(4) 將所述重組菌株按體積百分含量為2-10%的接種量接種到5ml含木糖的RM液體 培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)至OD600為1.0后轉接到另一個新的含木糖的RM液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培 養(yǎng)，所述轉接的次數為8-12次，獲得一種能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌；所 述含木糖的M液體培養(yǎng)基為20g/L木糖、10g/L酵母提取物和KH2P042g/L，余量為水。
3. 根據權利要求2所述的獲得一種能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌的方 法，其特征是所述步驟(3)質粒pXylose向運動發(fā)酵單胞菌的轉化為將運動發(fā)酵單胞菌 CP4(CICC 10232)培養(yǎng)物按體積百分含量為0. 5% 1. 5%的接種量接種到50ml RM液體 培養(yǎng)基中，3(TC靜止培養(yǎng)至0D6。。 = 0. 5 ;6000rpm離心5min，收集菌體，用冰浴的體積百分含 量為10%的甘油水溶液洗滌2-4次，用2ml體積百分含量為10%的甘油水溶液懸浮混勻， 即得感受態(tài)細胞；取40 iU感受態(tài)細胞，加入1 P g質粒pXylose混合，轉移至無菌預冷的 lmm電擊杯中，1800V電擊，迅速加入450ul RM液體培養(yǎng)基，混勻后轉移到1. 5ml無菌離心 管中，3(TC靜置培養(yǎng)12 17小時；將培養(yǎng)物涂布于含20 ii g/ml四環(huán)素的RM固體培養(yǎng)基篩 選平板，倒置放于培養(yǎng)箱3(TC培養(yǎng)2 3天，挑選轉化子；菌落經PCR鑒定后，選取轉化子 測定外源蛋白木糖異構酶、木酮糖激酶、轉酮酶或轉醛酶的酶活，獲得一種能利用木糖生產 乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌菌株，所述RM液體培養(yǎng)基為20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物 和KH2P042g/L，余量為水，所述RM固體培養(yǎng)基為20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、20g/L瓊 脂粉和K^P042g/L，余量為水。
4. 權利要求1的一種能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌的發(fā)酵方法，其特征 包括如下步驟將能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌的菌株在含木糖的液體RM培養(yǎng)基中培 養(yǎng)至菌體濃度0D600 = 1. 0 1. 5，離心濃縮菌體，接種到含木糖和葡萄糖的RM液體培養(yǎng)基 中，初始菌體的濃度控制在OD600 = 0. 1 0. 2，在上述菌分別在30°C 34。C發(fā)酵48 96 小時；所述含木糖和葡萄糖的RM液體培養(yǎng)基為25g/L木糖、25g/L葡萄糖、10g/L酵母提取 物和KH2P042g/L，余量為水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌及發(fā)酵方法，一種能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌GX1(Zymomonas mobilis)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC 3438，本發(fā)明首次將大腸桿菌rrnB調控元件與木糖代謝相關基因融合，構建帶有人工融合操縱子的質粒，通過電轉化和馴化的方法獲得的能利用木糖生產乙醇的重組運動發(fā)酵單胞菌菌株，它能高效表達外源基因，能在30-34℃高效利用葡萄糖和木糖共發(fā)酵產醇，并且能利用含有木糖和葡萄糖的玉米芯水解液產醇。本發(fā)明的菌株對有效的利用廢棄的木質纖維素生產清潔能源、解決當前能源危機具有重要意義。
文檔編號C12N1/21GK101781634SQ20091022897
公開日2010年7月21日 申請日期2009年12月4日 優(yōu)先權日2009年12月4日
發(fā)明者劉成, 張敏華, 張鯤, 洪解放, 鄒少蘭, 馬媛媛 申請人:天津大學