專利名稱：一種糖酰胺酶的蛋白及其編碼序列與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及糖酰胺酶及其應用，尤其涉及一種具有高穩(wěn)定性、高活性的糖酰胺酶的蛋白及其編碼序列與應用。屬于微生物工程和酶工程領域。
背景技術：
碳水化合物是自然界中最為豐富的有機化合物。細胞內的各種糖綴合物如糖蛋 白、糖脂和糖胺等在生物體內細胞-細胞間的識別、信號傳導、免疫反應、細胞分化和凋亡 等許多生物過程中扮演著極其重要的角色。糖生物學及糖工程研究已成為繼基因工程、蛋 白質工程之后的第三大生物工程，是當今最前沿的生物學科之一。然而，由于細胞表面的糖 成分極其復雜且糖鏈一般與其它大分子形成復合物來發(fā)揮作用而其分離及純化手段的嚴 重不足，對細胞表面糖成分的大規(guī)模分析一直無法順利開展。后來發(fā)現在生理生化反應中，有一類酶可水解N-連接的糖肽或糖蛋白的β _天冬 胺酰葡糖胺鍵，將蛋白和糖鏈完全分開，釋放出完整的寡糖鏈，并生成天冬胺酸殘基。具有 此催化功能的酶被統稱為糖酰胺酶(ρ印tide-N4- (N-acetyl-β -glucosaminyl) -asparagi ne, Peptide N-glycanase, PNGase, EC3. 5. 1.52)。來源于腦膜炎膿桿菌的糖酰胺酶 PNGase F因其具有廣泛的底物專一性，對所有類型的N-連接的糖蛋白都有作用，被廣泛的用做糖 生物學研究中的工具酶。但是，PNGase F的使用具有其局限性。首先PNGase F的價格昂貴，限制了其大規(guī) 模的應用；其次，為了下一步糖鏈檢測方便，一般都是在近中性條件下進行酶切脫糖基化， 而PNGase F的反應的最適pH偏堿性，為pH8. 5，最適反應溫度為37°C，在此條件下，PNGase F的活性不能夠達到最高，反應需要較大的酶量，同時需要較長的反應時間。因此，在糖鏈分 析過程中，糖鏈的獲取首先成為了 一個費時費力的過程，成為制約糖鏈分析的瓶頸。在真核生物中發(fā)現另外一種普遍存在的糖酰胺酶，Pnglp。1998年，Suzuki等首先 在釀酒酵母細胞溶膠中發(fā)現。Pnglp與PNGase F為同工酶，兩者具有相同的酶切功能，但是 它們的基因序列，酶活性質等均不相同。Pnglp最適反應溫度為30°C，最適pH為pH7.0，在 較寬的PH范圍內具有脫糖基化的活性。以上性質較PNGase F具有一定的優(yōu)勢，可以在某 些試驗中替代PNGase F。但是Pnglp的活性較低，并且只能對非天然的高甘露糖型的底物 進行脫糖基化處理，極大的限制了其應用。因此，研究和開發(fā)能夠結合Pnglp和PNGase F的優(yōu)勢，大量得到一種在近中性條 件下，在較低溫度下對糖蛋白具有較高的脫糖基化活性的糖酰胺酶在糖生物學領域必將具 有非常重要的意義和廣泛的應用前景。

發(fā)明內容
針對現有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種具有高穩(wěn)定性、高活性的糖酰 胺酶的蛋白及其編碼序列與應用。本發(fā)明所述糖酰胺酶的蛋白，其特征在于所述蛋白具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的多肽，或具有由SEQ ID NO :1所示核苷酸分子序列所編碼的多肽；且具有如下的理化性質a)理論分子量為38. 6kDa ；b)理論 pi 為 6. 02;c)最適pH為pH6. 5 pH7. 5，但在pH5. 0 pH10. 0均具有良好的pH穩(wěn)定性和活 性；d)最適溫度為30°C，但在20°C 37°C之間均具有較高的活性；e)對變性底物比活在100，000IU/mg以上或對天然底物比活在50，000IU/mg以上。本發(fā)明糖酰胺酶的蛋白的制備方法。本發(fā)明提供的重組蛋白質可以通過常規(guī)的重組蛋白表達技術制備，步驟包括(1)將編碼Pnglp-ΔΗΙ蛋白的核酸序列可操做地連于表達調控序列，構建成 Pnglp-ΔHl蛋白表達載體，其中所述表達載體具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；(2)將步驟(1)中的表達載體轉入宿主細胞，形成表達Pnglp-Δ Hl蛋白的重組細 胞；(3)在合適表達Pnglp-ΔΗΙ蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細胞；由 培養(yǎng)液分離純化出具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的Pnglp-ΔΗΙ蛋白。本發(fā)明所述糖酰胺酶的蛋白作為糖酰胺酶在糖鏈分析中蛋白脫糖基化的應用。本發(fā)明所述糖酰胺酶的蛋白在近中性、且溫度較低條件下，對糖蛋白具有較高的 脫糖基化活性，可以作為一種新的糖酰胺酶。本發(fā)明的新的糖酰胺酶具有以下優(yōu)點近中性的作用ρΗ，較低的作用溫度，良好 的熱穩(wěn)定性，容易發(fā)酵生產。這些優(yōu)點使其在一些PNGase F的作用效果不高的條件下可以 進行較好應用，如較常用的使用PAGE電泳分離蛋白，在膠上進行脫糖基化的方法中。另外， 此糖酰胺酶對天然糖蛋白的活性在糖鏈分析中提供了另外的一種脫糖基化方法的選擇，因 此，本發(fā)明的新的糖酰胺酶將會擁有巨大的應用前景。


圖1. Pnglp-ΔΗΙ原核表達系統質粒構建圖。圖 2.為重組大腸桿菌 BL21 (DE3) /pLysS/pET22b_Pnglp- Δ Hl 發(fā)酵產物 SDS-PAGE
結果圖中M 低分子量蛋白標準1 大腸桿菌 BL21 (DE3) /pLysS 對照2 誘導表達Pnglp- Δ Hl樣品3 誘導表達Pnglp-Δ Hl樣品。圖3.為Pnglp-ΔΗΙ蛋白純化結果圖中M 低分子量蛋白標準1 :Pnglp_AHl 蛋白。圖4.為Pnglp-ΔΗΙ與Pnglp對RNase B的脫糖基化效率的比較圖中1、2、3 底物為熱變性的RNase B4,5,6 底物為天然的的RNase B。
圖5.為Pnglp-Δ Hl與Pnglp對非高甘露糖型糖蛋白的脫糖基化效率比較圖中底物為非高甘露糖型的轉鐵蛋白1 對照2 :Pnglp
3:Pnglp_AHl。圖6. Pnglp-Δ Hl的ρΗ適應性及其與PNGase F的比較。圖7. Pnglp- Δ Hl的溫度適應性及其最適溫度。圖8.凝膠中在線催化作用分離糖鏈的脫糖基化效率的比較。圖中底物為經過PAGE分離純化后的RNase B1、2、3、4 為 Pnglp-ΔΗΙ5、6、7、8 為 PNGase F。
具體實施例方式下面結合附圖，以較佳實施方式對本發(fā)明詳細描述，但本所述內容不限制本發(fā)明。 實施例1 構建原核表達系統pET22b/Pnglp-AHl高效表達Pnglp-Δ Hl。1.菌株和質粒大腸桿菌DH5a (Ε. coli DH5 a LacZ Δ Ml 5 hsdR recA)大腸桿菌BL21 (DE3) (Ε. coli BL21 (DE3))大腸桿菌BL21 (DE3) /pLysS (E. coli BL21 (DE3) /pLys)質粒pET22b以上菌株和質粒均購自Novagen公司。2.分子克隆用酶和試劑限制性內切酶 EcoRI、HindIII ；PfuDNA 聚合酶；T4 連接酶購自 MBI-Fermentas。Agarose Gel DNA Purification Kit, DNA Fragment Purification Kit _ 自 OMEGA Ltd.。核酸分子量標準1Kb Marker購自BioLab。蛋白分子量標準(14. 4-97. OkDa)購自上海生化所。3.方法1)釀酒酵母糖酰胺酶基因(Pnglp-ΔΗΙ)的克隆基本方法是以已知的釀酒酵母糖酰胺酶的基因序列(Genebank[gi :50593503]) 為基礎，利用PCR的方法去除前96個核苷酸序列而得到Pnglp-ΔΗΙ的基因，命名為 Pnglp-Δ Hl ο根據設計得到的Pnglp-ΔΗΙ基因序列，設計引物Pnglp-AHlF 5' TTGTGAATTCGA AAGCTGCACCTGTAGAGAA-3，(酶切位點 EcoRI)Pnglp-AHlR :5，-TGTTTAAGCTT TTTACCATCCTCCCCACGCT-3，(酶切位點 HindIII)以Pnglp-Δ HlF為前引物，Pnglp-Δ HlR為后引物，以釀酒酵母基因組為模板，利 用PCR(聚合酶鏈式反應)體外擴增Pnglp-ΔΗΙ序列。PCR反應條件97°C預變性10分鐘，94 °C變性30秒，56 °C退火30秒，72 °C延伸60 秒，30個循環(huán)后72°C延伸10分鐘，4°C保存。電泳檢測片段的大小。瓊脂糖濃度為0.8%。
2) Pnglp-Δ Hl表達重組質粒的構建將PCR得到片斷和pET22b質粒利用EC0RI、HindIII核酸內切酶進行雙酶切消化。然后利用凝膠產物回收試劑盒(購自OMEGA公司)回收純化酶切的片段。將回收的質粒和基因片段利用T4連接酶連接，連接反應在22°C下進行，反應時間 為4小時，反應體系為10 μ 1。經連接后得到重組表達質粒pET22b-Pnglp-AHl。將含有重組質粒pET22b-Pnglp_ Δ Hl的10 μ 1的連接液加入100 μ 1的DH5 α感 受態(tài)細胞中，混勻；置冰上30分鐘；42°C熱激90s，冰上靜置2分鐘，加入900 μ 1的LB培養(yǎng) 基，37°C，100轉/分鐘，培養(yǎng)1小時。將轉化液涂布于含有質量體積比為1. 5%的瓊脂并加 有終濃度為100微克/毫升的氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基平板上，37°C條件下，靜置培養(yǎng) 16小時，挑取單菌落篩選轉化子。將單菌落挑取轉入含有100微克/毫升的氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C， 225轉/分鐘下培養(yǎng)過夜。利用質粒試劑盒提取重組質粒pET22b-Pnglp- Δ Hl，驗證質粒的 大小。并用EC0RI、HindIII核酸內切酶雙酶切分析，篩選含有Pnglp-Δ Hl基因片段的重組 質粒轉化子。重組質粒構建見圖1。3)Pnglp-AHl基因在大腸桿菌中表達。將重組質粒pET22b-Pnglp_AHl轉化入大腸桿菌BL21 (DE3)pLysS。挑取LB平板 中篩選后的陽性克隆，在無菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于5ml并加有終濃度為50 150 微克/毫升的氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 40°C條件下，150 300轉/分鐘搖床振蕩 培養(yǎng)8 16小時，制得種子液；以 5%的接種量轉接入裝有50ml培養(yǎng)基的300ml三 角瓶中。37°C劇烈振蕩培養(yǎng)3h，使細菌處于對數生長中期，0D_值約為0.8。從50ml對數 生長期菌液中取ImL做對照，向其余菌液中加入lmol/L IPTG溶液，使其最終濃度為lmmol/ L。加入IPTG后菌液繼續(xù)培養(yǎng)1 4h，12000rpm離心lOmin，取上清與沉淀分別保存待用， 最后離心收獲細菌，檢測目的蛋白的表達。目的蛋白檢測取1. 5mL誘導的培養(yǎng)物，12000rpm離心30秒，棄上清；沉淀用PBS洗一次，加50 μ L 滅菌雙蒸水和50 μ L 2 X SDS加樣緩沖液，重懸沉淀，煮沸5-10分鐘，IOOOOrpm離心lOmin，
取上清備用。在濃縮膠進行8V/cm穩(wěn)壓電泳，當溴酚蘭指示劑進入分離膠后改為15V/cm穩(wěn)壓電 泳至溴酚蘭帶遷移至離凝膠底部1cm，取出凝膠用考馬斯亮蘭染色液染色4小時以上，隨后 轉入脫色液中，脫色至背景清晰。SDS-PAGE結果見圖2，Pnglp-Δ Hl含量占菌體總蛋白的25%左右。實施例2 =Pnglp- Δ Hl蛋白的純化1)擴大培養(yǎng)及菌體收集將含有重組表達質粒的大腸桿菌單菌落接種到50ml含相應抗生素的LB培養(yǎng)基， 37 °C培養(yǎng)過夜。取2. 5mL菌液接入250mL含相應抗生素LB培養(yǎng)基，37 °C培養(yǎng)過夜。待0D_ 值達0. 8時，加入IPTG (終濃度為lmmol/L)，誘導培養(yǎng)4h后，5000rpm離心30min集菌。2)菌體超聲破碎收集菌后，用樣品緩沖液溶解。用200W功率，在冰浴中進行超聲波細胞破碎，每破碎10s，間隔10s，反復破碎6次后結束，在顯微鏡下觀察破碎結果，之后12000rpm離心20 分鐘取上清液和沉淀-20°C保存。3)Pnglp-AHl蛋白包涵體的處理包涵體的獲得誘導表達后的菌體沉淀重懸于15mL裂解緩沖液(50mmol/LTris-HCl, pH8. 0 ；0. 05mol/L NaCl ；0. 5mmol/L EDTA)中，加入 50mmol/L PMSF 10yL，力口 溶菌酶至終濃度0. lmg/mL，室溫放置30min。冰浴間歇超聲波破菌，超聲結束后13000rpm， 4°C離心15min，收集包涵體沉淀，分別用緩沖液A(50mM Tris_HCl，pH8. 0 ；2mM EDTA ；IOOmM NaCl ；0. 5 % Triton X-100 (V/V) ；4M 脲素)、緩沖液 B (50M Tris-HCl, pH8. 0 ；2mM EDTA ； IOOmM NaCl ；3% Triton X-100)、緩沖液 C(50mM Tris-HCl,pH8. 0 ；2mM EDTA ；IOOmM NaCl ； 0. 5% Triton X-100 ；2M鹽酸胍)洗滌包涵體。包涵體的變性及復性用5mL含8M脲素，IOmM β -巰基乙醇，IOOmM Tris-HCl (ρΗ8. 0)，2mM EDTA及脫氧膽酸鈉緩沖液充分溶解包涵體沉淀，13000rpm, 4°C離心 30min，收集包涵體溶解上清液。緩慢的加入稀釋復性液中(50mM HEPES pH7. 5,0. 2MNaCl, ImM DTT, 0. 5Μ L-精氨酸)，10°C攪拌2h，透析后經過親和層析柱純化。4)親和層析純化Pnglp- Δ Hl蛋白(1)裝柱將IOmL Ni-NTA倒入2. 5 X IOcm柱中，用3個柱床體積的緩沖液A (50mM 磷酸鈉，ρΗ8· 0 ；0. 3Μ氯化鈉；IOmM咪唑)在4°C進行柱平衡。(2)上樣將表達產物粗提物和復性蛋白分別上樣，用6個柱床體積的緩沖液 (50mM磷酸鈉，pH8. 0 ；20mM咪唑；0. 5M氯化鈉)清洗。(3)洗脫用6個柱床體積的緩沖液(50mM磷酸鈉，pH8. 0 ；250mM咪唑；0. 3M氯化 鈉)洗脫目的蛋白；收集液進行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE分析結果見圖3.實施例3 重組Pnglp- Δ Hl酶活性質的分析
1)重組Pnglp- Δ Hl的活性檢測以核糖核酸酶B (RNase B)作為模式底物。反應體系如下50mM HEPES-NaOH 緩沖液 ρΗ7· 0，0. 5mg/ml RNase B，純化的糖酰胺酶，5mM DTT, 30uL體系，30°C水浴中保溫處理。其中RNase B可為天然的或是經過熱變性的。熱變性條 件為RNase B在100°C水浴處理lOmin，然后迅速冷卻。其中反應完成后，樣品使用15%的SDS-PAGE進行電泳分析，考馬斯亮藍染色后使 用Image J program軟件進行初步定量分析。將等量Pngl-Δ Hl與其野生型酶Pnglp在相同的條件下進行活性比較，反應Ih 后，Pnglp使大約42. 3 %的變性的底物脫糖基化，同時Pngl- Δ Hl可以使95 %變性的底物脫 糖基化。Pngl-ΔΗΙ的對變性的底物脫糖基化活性比Pnglp有明顯的提高。而以天然未經 過變性的核糖核酸酶B(RNase B)為底物來檢測Pnglp和Pngl-ΔΗΙ在pH7. 0，30°C時的脫 糖基化酶活，發(fā)現Pnglp不能使天然的核糖核酸酶B脫糖基化，因此可以被用來卻分正確折 疊的糖蛋白與錯誤折疊的糖蛋白。而Pngl-ΔΗΙ卻可以使天然的核糖核酸酶B脫糖基化。 此外，Pngl-ΔΗ可以使天然的非高甘露糖型糖鏈的糖蛋白(如轉鐵蛋白)脫糖基化。分析結果見圖4，圖5。2)重組Pnglp- Δ Hl的最適ρΗ和ρΗ適應性
在不同pH值條件下，對經過純化的Pngl-ΔΗΙ進行活性分析。pH值對糖酰胺 酶活性影響確定使用以下緩沖液=NaOH-HAc ρΗ4· 0-6. 0 ；Hepes-NaOH pH7. 0 ；Tris-Cl ρΗ7. 5-8. 5 ；Gly-NaOH ρΗ9. 0，ρΗΙΟ. 0 ；Borax pH9. 4。取純化的酶液，分別在 pH4. 0-pH10. 0 進行活性測定。如圖6所示，在pH5.0-pH10.0，Pngl-AHl均表現出了脫糖基化活性。在測 定條件下，Pngl-Δ Hl的最適pH為ρΗ7. 0，ρΗ6. 0-ρΗ10. 0之間時具有較強的脫糖基化活性。 與PNGase F相比較，Pnglp-Δ Hl具有更廣闊的pH適應性，在中性條件如ρΗ7. 0和堿性條 件如ρΗΙΟ. 0具有更好的脫糖基化活性。分析結果見圖6。3)重組Pnglp- Δ Hl的最適反應溫度和溫度適應性將純化的Pngl- Δ Hl按照1)中的方法，分別在20°C，25°C，30°C，37°C，45°C五種溫 度下檢測Pnglp-ΔΗΙ的脫糖基化活性，計算相對酶活，以確定該酶的最適反應溫度。其結 果顯示該酶在20°C _37°C之間均有較好的活性，最適溫度優(yōu)選30°C。分析結果見圖7。4)重組Pnglp-Δ Hl比活的測定為了確定Pngl-ΔΗΙ的比活，首先使用Lowry方法確定了純化的糖酰胺酶 Pnglp-ΔΗΙ的蛋白濃度。重組酶Pnglp-ΔΗΙ的比活在30°C，pH7. 0條件下，通過對RNase B的脫糖基化進行測定。比活單位在10 μ L體系中30°C反應1小時，以將10 μ g RNase B 95%以上脫糖基化所需要的酶量定義為一個單位。通過計算，Pngl-ΔΗΙ的對于經過IOmin 沸水浴處理熱變性的RNase B的比活為100000IU/mg以上，對于天然RNase B的比活為 50000IU/mg 以上。5)重組 Pnglp- Δ Hl 的 pi 的預測經過 http:// www, expasy. ch/tools/protparam. html的protparam軟件進行蛋白 的一級序列參數分析預測，該酶的理論Pl值為PH6. 05實施例4 重組Pnglp-Δ Hl的應用實例Pnglp-ΔΗΙ與Pnglp相比，活性有很大提高，并且具有了對天然底物的脫糖基化 作用。與PNGase F相比較，具有更廣泛的pH和溫度適應性。其具體應用如下以模式糖蛋白RNase B為例，說明Pnglp-Δ Hl在蛋白凝膠在線脫糖基化方法中的應用。1)底物處理(1)底物蛋白RNase B經過SDS-PAGE或2D-PAGE進行分離并使用考馬斯亮藍進行 染色30min，使用脫色液進行脫色至無底色；(2)將目的蛋白條帶切下，用NaHCO3緩沖液(20mM，pH7. 0)清洗兩次，每次30min ；(3)膠條重新加入300 μ L新鮮的NaHCO3緩沖液，然后加入20 μ L 45mM 二硫蘇糖 醇(DTT)，60°C處理 30min ；(4)加入等體積的乙腈室溫處理60min以去除SDS和DTT ；(5)將膠條切碎成Imm3的碎塊。2)脫糖基化處理在50 μ LNaHCO3緩沖液體系中加入切碎的膠條和純化的糖酰胺酶，30°C水浴處理。 PNGase F對照在37 °C水浴處理。
3)樣品脫糖基化檢測脫糖基化處理后的樣品經過超聲處理20min后12000rpm離心lOmin，上清中為脫 下的N-糖鏈，可以直接使用HPLC或質譜等進行分析。剩下的沉淀重新處理，使用SDS-PAGE 分析脫糖基化的效率。SDS-PAGE結果如圖8所示，顯示Pnglp-Δ Hl可以在8小時內對膠中的糖蛋白進行 脫糖基化，而PNGase F需要16-24小時。序列表
<110>山東大學<120> 一種糖酰胺酶的蛋白及其編碼序列與應用<141>2009-11-22<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>996<212>DNA<213>人工序列(釀酒酵母糖酰胺酶改造體Pnglp- Δ Hl基因序列)<400>1aaagctgcac ctgtagagaa tataaggttt cagaatttag tccatacaaa tcaattcgca 60caaggagtcc taggtcagag tcaacatctc tgtacagtct atgacaatcc ttcatggcat 120tctatagtcc tggagacatt ggatctggat ctaatatata aaaatgttga taaggaattt 180gccaaagatg ggcatgcaga gggggaaaat atatacacgg attatctagt aaaggagctg 240cttcgctact tcaaacaaga ttttttcaaa tggtgcaata aaccagattg taatcattgt 300ggccagaaca cttcagaaaa tatgacacct ctgggcagtc aagggcccaa tggagaggaa 360tctaaattca attgcggaac tgttgagatc tataaatgca accgatgcgg aaatatcact 420agatttcctc gttataacga tccaattaag ttgctggaaa ctagaaaggg aagatgcggt 480gaatggtgca atttatttac tttgattttg aagtcgtttg ggttagatgt tcgctacgtc 540tggaatagag aagatcatgt ttggtgtgaa tatttttcaa attttttgaa taggtgggtt 600catgtcgact cctgtgagca atcattcgac caaccatata tctattcaat taactggaac 660aagaaaatga gttactgtat tgcgttcggt aaagatggcg ttgttgacgt tagtaaacgc 720tatatcctcc aaaacgagct gcccagagat caaatcaagg aagaagattt aaaattcctt 780tgtcaattta taacgaagag gttgaggtat tcgttaaatg atgacgagat ataccaactt 840gcatgtcgcg atgagcagga acagatagag ctgattagag gaaagacaca agaaacgaaa 900tccgaaagcg tcagtgccgc ttcgaaatca tctaatcgtg gtagagaaag tggatcggcg 960gattggaaag cacagcgtgg ggaggatggt aaatag<210>2<211>332<212>PRT<213>人工序列<400>2
Met Lys Ala Ala Pro Val Glu Asn lie Arg Phe Gln Asn Leu Val His51015Thr Asn Gln Phe Ala Gln Gly Val Leu Gly Gln Ser Gln His Leu Cys202530Thr Val Tyr Asp Asn Pro Ser Trp His Ser lie Val Leu Glu Thr Leu354045Asp Leu Asp Leu lie Tyr Lys Asn Val Asp Lys Glu Phe Ala Lys Asp505560Gly His Ala Glu Gly Glu Asn lie Tyr Thr Asp Tyr Leu Val Lys Glu65707580Leu Leu Arg Tyr Phe Lys Gln Asp Phe Phe Lys Trp Cys Asn Lys Pro859095Asp Cys Asn His Cys Gly Gln Asn Thr Ser Glu Asn Met Thr Pro Leu100105110Gly Ser Gln Gly Pro Asn Gly Glu Glu Ser Lys Phe Asn Cys Gly Thr115120125Val Glu lie Tyr Lys Cys Asn Arg Cys Gly Asn lie Thr Arg Phe Pro130135140Arg Tyr Asn Asp Pro lie Lys Leu Leu Glu Thr Arg Lys Gly Arg Cys145150155160Gly Glu Trp Cys Asn Leu Phe Thr Leu lie Leu Lys Ser Phe Gly Leu165170175Asp Val Arg Tyr Val Trp Asn Arg Glu Asp His Val Trp Cys Glu Tyr180185190Phe Ser Asn Phe Leu Asn Arg Trp Val His Val Asp Ser Cys Glu Gln195200205Ser Phe Asp Gln Pro Tyr lie Tyr Ser lie Asn Trp Asn Lys Lys Met210215220Ser Tyr Cys lie Ala Phe Gly Lys Asp Gly Val Val Asp Val Ser Lys225230235240Arg Tyr lie Leu Gln Asn Glu Leu Pro Arg Asp Gln lie Lys Glu Glu245250255Asp Leu Lys Phe Leu Cys Gln Phe lie Thr Lys Arg Leu Arg Tyr Ser260265270Leu Asn Asp Asp Glu lie Tyr Gln Leu Ala Cys Arg Asp Glu Gln Glu275280285Gln lie Glu Leu lie Arg Gly Lys Thr Gln Glu Thr Lys Ser Glu Ser290295300
Val Ser Ala Ala Ser Lys Ser Ser Asn Arg Gly Arg Glu Ser Gly Ser
305310315320Ala Asp Trp Lys Ala Gln Arg Gly Glu Asp Gly Lys***325330
權利要求
一種糖酰胺酶的蛋白，其特征在于所述蛋白具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽，或具有由SEQ ID NO1所示核苷酸分子序列所編碼的多肽；且具有如下的理化性質a)理論分子量為38.6kDa；b)理論pI為6.02；c)適宜pH為pH6.5～pH10.0；d)適宜溫度為20℃-37℃；e)對變性底物比活在100,000IU/mg以上或對天然底物比活在50,000IU/mg以上。
2.如權利要求1所述糖酰胺酶的蛋白，其特征在于所述蛋白適宜PH為pH6.5 PH7. 5 ；所述蛋白適宜溫度為30°C。
3.權利要求1所述糖酰胺酶的蛋白作為糖酰胺酶在糖鏈分析中蛋白脫糖基化的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種糖酰胺酶的蛋白及其作為糖酰胺酶在糖鏈分析中蛋白脫糖基化的應用；其中所述蛋白具有SEQ ID No2所示的氨基酸序列的多肽，或具有由SEQ ID No1所示核苷酸分子序列所編碼的多肽。本發(fā)明所述糖酰胺酶的蛋白在近中性，且溫度較低條件下，對糖蛋白具有較高的脫糖基化活性，作為一種新的糖酰胺酶將有巨大的應用前景。
文檔編號C12N15/55GK101824403SQ20091022999
公開日2010年9月8日 申請日期2009年11月30日 優(yōu)先權日2009年11月30日
發(fā)明者王圣鈞, 祁慶生 申請人:山東大學