專利名稱：一種快速分離厭氧微藻的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微藻的分離方法，具體的說是一種快速分離厭氧微藻的方法。
背景技術(shù)：
微藻是一種生物制氫的重要材料，在其生產(chǎn)氫氣的過程中必須給予一個嚴格的厭氧環(huán)境，防止氫氣與氧氣結(jié)合。藍藻細胞主要依靠固氮酶釋放氫氣，只要去除銨離子，氮氣等底物以及氧氣，就可以在厭氧環(huán)境下持續(xù)產(chǎn)氫。對于綠藻，目前常用的技術(shù)方法是"間接生物光解"法，首先正常培養(yǎng)綠藻細胞，使之靠光合作用累積自身所需的碳水化合物；然后將收獲的綠藻細胞培養(yǎng)在缺硫的培養(yǎng)基中，此后PSII活性很快喪失，而線粒體的呼吸作用幾乎不受影響，導致培養(yǎng)基中的02逐漸被呼吸作用消耗掉，氫酶活性達到最大，從而得到了較高的產(chǎn)氫量。一段時間后再將第二階段的細胞轉(zhuǎn)移到正常培養(yǎng)基中，重新進"第一階段"，如此周而復始。然而，不管是藍藻的固氮酶還是綠藻的氫酶，它們對氧氣都是極其敏感的，氧氣的發(fā)生會極大地限制氫氣產(chǎn)量。但是嚴格的厭氧環(huán)境反過來又會抑制微藻細胞的生長，使得操作技術(shù)復雜化。如果能夠找到在厭氧環(huán)境下快速生長的微藻藻種，那么不僅可以大大減少操作技術(shù)的復雜性，而且也能獲得較高的氫氣產(chǎn)量。隨著微藻作為生物制氫的材料越來越受到重視，分離培養(yǎng)這種具有厭氧生長能力的微藻藻種具有重要的潛在應用價值。 厭氧微藻作為一類特殊的生物群體，反應了生物從無氧環(huán)境到有氧環(huán)境的生物進化歷程，因此是生命進化樹上的重要一環(huán)，具有重要的研究價值。 厭氧微生物的分離培養(yǎng)已有許多成熟的技術(shù)，比如亨蓋特滾管技術(shù)，厭氧培養(yǎng)箱操作技術(shù)等等，但是這些方法操作復雜，成本高昂，不適合于快速地分離鑒定厭氧微藻。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種快速分離厭氧微藻的方法。
為實現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案為 —種快速分離厭氧微藻的方法將待分離樣品加入盛有TAP培養(yǎng)基的器皿中，然后用滅菌的液體石蠟密封，置于光照培養(yǎng)箱中以25或3(TC，40iimo1 m—2 s—1條件下培養(yǎng)直至上層液體變成綠色，使待分離樣品充分富集生長，待用；取上述富集培養(yǎng)的待分離樣品lml，稀釋至10—5， 10—6和10—7三個稀釋度，將三個梯度的待分離樣品分別涂于加入1. 5%瓊脂、冷卻的TAP培養(yǎng)基上，然后再鋪一層加入1. 5%瓊脂的TAP培養(yǎng)基，而后再鋪一層低熔點固體石蠟，使其處于密封厭氧狀態(tài)，倒置于光照培養(yǎng)箱中以25或30°C ， 40 ii mol m—2 s一1條件下培養(yǎng)5-10天； 若上述培養(yǎng)基中出現(xiàn)藍色或綠色藻落，即為待分離樣品中存在厭氧微藻；若上述
培養(yǎng)基中沒有出現(xiàn)藍色或綠色藻落，即為待分離樣品中不存在厭氧微藻。 所述培養(yǎng)基中出現(xiàn)藍色或綠色藻落，將培養(yǎng)基上固體石蠟去掉，用巴氏吸管將藍
色或綠色藻落吸出至TAP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待顏色變綠后，將藻落加入盛有TAP培養(yǎng)基的器皿中，然后用滅菌的液體石蠟密封，置于光照培養(yǎng)箱中以25或30°C ， 40 mol m—2 s一1 條件下培養(yǎng)直至上層液體變成綠色，使待分離樣品充分富集生長，待用；取上述富集培養(yǎng) 的待分離樣品lml，稀釋至10—5，10—6和10—7三個稀釋度，將三個梯度的待分離樣品分別涂 于加入1. 5%瓊脂、冷卻的TAP培養(yǎng)基上，然后再鋪一層加入1. 5%瓊脂的TAP培養(yǎng)基，而 后再鋪一層低熔點固體石蠟，使其處于密封厭氧狀態(tài)，倒置于光照培養(yǎng)箱中以25或30°C ， 40 mol *m—2 s—1條件下培養(yǎng)5_10天，為一個周期，如此重復3至4個周期；即獲得純化后 藻液。 所述純化后藻液接種于TAP培養(yǎng)基中，加入終濃度為lmg/L的刃天青作為厭氧指 示劑，另外加入終濃度為O. 1% (m/m)的連二亞硫酸鈉作為除氧劑，而后將其處于厭氧狀 態(tài)，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至培養(yǎng)基變?yōu)樗{色或綠色，取藻落加入連二亞硫酸鈉，若藍色或 綠色不褪去，表明分離到的微藻已經(jīng)生長，屬于厭氧微藻。 所述厭氧狀態(tài)為將培養(yǎng)基密封后迅速充入高純氮氣一分鐘，刃天青由藍色變?yōu)闊o 色，即為厭氧狀態(tài)。所述涂布有待分離樣品的加入1.5X瓊脂的TAP培養(yǎng)基，于12rC滅菌20min，冷 卻后涂布；再涂布有待分離樣品的加入1. 5X瓊脂的TAP培養(yǎng)基上再鋪的加入1. 5%瓊脂的 TAP培養(yǎng)基于12rC滅菌20min，冷卻至45。C，待用；所述低熔點固體石蠟為6(TC石蠟。
本法發(fā)明所具有的優(yōu)點 本發(fā)明可快速分離厭氧微藻，其利用簡單的"三明治"夾層培養(yǎng)法，在短時間內(nèi)獲 得厭氧微藻單克隆，方法簡單，實用性強，同時結(jié)合簡單的厭氧培養(yǎng)方法，可以快速確定所 得微藻是否在厭氧條件下生長。


圖1為本發(fā)明的"三明治"平板(其中1.瓊脂一層；2.瓊脂二層；3.石蠟層；4.培
養(yǎng)皿)。 圖2為采用本發(fā)明方法分離出的微藻藻株GXNN01在厭氧平板上的單克隆藻落。
圖3為基于18S rRNA基因序列的進化樹，以Chlamydomonasreinhardtii CC-1952 為外源對照。 圖4基于ITS(內(nèi)含子間隔區(qū))序列的進化樹，以Chlamydomonasreinhardtii SAG 11-32b為外源對照。 圖5A為采用本發(fā)明方法分離出的微藻藻株GXNN 01的光鏡照片。 圖5B為采用本發(fā)明方法分離出的微藻藻株GXNN 01的掃描電鏡照片。 圖5C為采用本發(fā)明方法分離出的微藻藻株GXNN 01的透射電鏡照片。 圖6為采用本發(fā)明分離出的微藻藻株GXNN 01在添加蘋果酸條件下的混養(yǎng)有氧和
混養(yǎng)厭氧生長曲線，以及自養(yǎng)條件下的生長曲線。
具體實施方式

實施例1 待分離樣品從廣西省南寧市淀粉加工廠的一處污水處理池中，用取樣器取少量底 層污泥和污水，裝入無菌瓶中，蓋緊蓋子，命名為GXNN01，密封后帶回實驗室置于四度保存。
4取少量污泥接種于盛有TAP培養(yǎng)基的三角瓶中，上面覆蓋一層液體石蠟，用丁基橡膠塞蓋 緊，置于光照培養(yǎng)箱中，于3(TC，40i!mo1 m—2 s—1條件下培養(yǎng)直至上層液體變成綠色。取 上層培養(yǎng)基lmL，加入至9mLTAP培養(yǎng)基中，進行十倍梯度稀釋至10—5， 10—6和10—7三個稀釋 度的藻液，而后將3個梯度的澡液分別涂于"三明治"平板(參見圖1)上。所述"三明治" 為澡液涂布于加入1.5X瓊脂的、冷卻的TAP培養(yǎng)基上，然后再鋪一層加入1.5%瓊脂的 TAP培養(yǎng)基，而后再鋪一層低熔點固體石蠟，使其處于密封厭氧狀態(tài)，即為"三明治"平板，而 后將涂好的平板倒置于光照培養(yǎng)箱中30°C ， 40 i！ mol m—2 s—1條件下培養(yǎng)。約5天后平板 中央長出現(xiàn)藍色或綠色單藻落(參見圖2)。即為待分離樣品中不存在厭氧微藻。
在無菌臺中用鑷子輕輕將上述培養(yǎng)基上層的石蠟剝落，并用接種環(huán)扎進瓊脂層挑 取單藻落至TAP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待顏色變綠后，將藻落加入承有TAP培養(yǎng)基的器皿中， 然后用滅菌的液體石蠟密封，置于光照培養(yǎng)箱中以3(TC，40iimo1 m—2 s—1條件下培養(yǎng)直 至上層液體變成綠色，使待分離樣品充分富集生長，待用；取上述富集培養(yǎng)的待分離樣品 lml，稀釋至10—5，10—6和10—7三個稀釋度，將三個梯度的待分離樣品分別涂于加入1. 5%瓊 脂、冷卻的TAP培養(yǎng)基上，然后再鋪一層加入1. 5%瓊脂的TAP培養(yǎng)基，而后再鋪一層低熔點 固體石蠟，使其處于密封厭氧狀態(tài)，倒置于光照培養(yǎng)箱中以3(TC，40iimo1 m—2 s—1條件下 培養(yǎng)約5天，為一個周期，如此重復3周期；即獲得純化后藻液。 取獲得純化后藻液接種于TAP培養(yǎng)基中，加入過濾除菌的10%連二亞硫酸鈉儲液 (終濃度0. 1% )和lmg/mL的刃天青儲液(終濃度lmg/L)，而后將培養(yǎng)基密封后迅速充入 高純氮氣一分鐘，刃天青由藍色變?yōu)闊o色，其處于厭氧狀態(tài)，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天， 培養(yǎng)基變?yōu)樗{色或綠色，取藻落加入連二亞硫酸鈉，若藍色或綠色不褪去，表明分離到的微 藻已經(jīng)生長，屬于厭氧微藻。 利用通用引物進行PCR，擴增了該藻的18S rRNA基因和內(nèi)含子間隔區(qū)(ITS)序列， 并對其進行了測序，經(jīng)Blast比對，做進化樹分析表明該微藻是隸屬于綠藻門的Chlorella sorokiniana GXNN01 (參見圖3、圖4)。 對該藻的細胞結(jié)構(gòu)進行了光鏡，掃描電鏡和透射電鏡分析(參見圖5A、圖5B、圖 5C)，光鏡分析表明該藻是單細胞微藻，呈圓形或橢圓形，細胞大小在2. 1 m到5. 6 m之 間，細胞內(nèi)部被一個杯狀的葉綠體填充，葉綠體內(nèi)有蛋白核和淀粉粒，生殖方式通過似親孢 子生殖， 一個細胞放散四個小孢子。 對該藻的生長曲線(參見圖6)的分析表明，該藻具有在有氧和厭氧條件下快速生 長的能力。在自養(yǎng)條件下，生長周期漫長，在12d之后才進入穩(wěn)定期；在添加蘋果酸并且有 氧氣條件下，該藻能快速生長，僅5d就進入穩(wěn)定期，而且在厭氧條件下保持著相同生長速 度但細胞密度有所降低。同時，該藻還可以利用葡萄糖，乙酸鹽，果糖，琥珀酸，延胡索酸丙 酮酸等進行異養(yǎng)或混養(yǎng)生長。 對該藻的生化成分進行分析表明，在自養(yǎng)條件下蛋白質(zhì)含量可達75%細胞干重， 在以乙酸鹽作為碳源進行異養(yǎng)生長時脂肪含量可達28%細胞干重，因此具有重要的應用價 值，既可作水產(chǎn)餌料又可當作生物制氫和生物柴油的反應器。
實施例2 將待分離樣品加入承有TAP培養(yǎng)基的器皿中，然后用滅菌的液體石蠟密封，置于 光照培養(yǎng)箱中以30°C ， 40 mol *m—2 s—1條件下培養(yǎng)直至上層液體變成綠色，使待分離樣品充分富集生長，待用；取上述富集培養(yǎng)的待分離樣品lml，稀釋至10—5，10—6和10—7三個稀釋
度，將三個梯度的待分離樣品分別涂于加入1.5X瓊脂、冷卻的TAP培養(yǎng)基上，然后再鋪一
層加入1. 5%瓊脂的TAP培養(yǎng)基，而后再鋪一層低熔點固體石蠟，使其處于密封厭氧狀態(tài)，
倒置于光照培養(yǎng)箱中以30°C ， 40 i！ mol m—2 s—1條件下培養(yǎng)6_7天； 上述培養(yǎng)基中沒出現(xiàn)藍色或綠色藻落，即為待分離樣品中不存在厭氧微藻。
權(quán)利要求
一種快速分離厭氧微藻的方法，其特征在于將待分離樣品加入盛有TAP培養(yǎng)基的器皿中，然后用滅菌的液體石蠟密封，置于光照培養(yǎng)箱中以25或30℃，40μmol·m-2·s-1條件下培養(yǎng)直至上層液體變成綠色，使待分離樣品充分富集生長，待用；取上述富集培養(yǎng)的待分離樣品1ml，稀釋至10-5，10-6和10-7三個稀釋度，將三個梯度的待分離樣品分別涂于加入1.5％瓊脂、冷卻的TAP培養(yǎng)基上，然后再鋪一層加入1.5％瓊脂的TAP培養(yǎng)基，而后再鋪一層低熔點固體石蠟，使其處于密封厭氧狀態(tài)，倒置于光照培養(yǎng)箱中以25或30℃，40μmol·m-2·s-1條件下培養(yǎng)5-10天；若上述培養(yǎng)基中出現(xiàn)藍色或綠色藻落，即為待分離樣品中存在厭氧微藻；若上述培養(yǎng)基中沒有出現(xiàn)藍色或綠色藻落，即為待分離樣品中不存在厭氧微藻。
2. 按權(quán)利要求1所述的快速分離厭氧微藻的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基中出現(xiàn)藍 色或綠色藻落，將培養(yǎng)基上固體石蠟去掉，用巴氏吸管將藍色或綠色藻落吸出至TAP液體 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待顏色變綠后，將藻落加入盛有TAP培養(yǎng)基的器皿中，然后用滅菌的液體石 蠟密封，置于光照培養(yǎng)箱中以25或3(TC，40iimo1 m—2 s—1條件下培養(yǎng)直至上層液體變成 綠色，使待分離樣品充分富集生長，待用；取上述富集培養(yǎng)的待分離樣品lml，稀釋至10—5， 10一6和10—7三個稀釋度，將三個梯度的待分離樣品分別涂于加入1.5X瓊脂、冷卻的TAP培 養(yǎng)基上，然后再鋪一層加入1.5X瓊脂的TAP培養(yǎng)基，而后再鋪一層低熔點固體石蠟，使其 處于密封厭氧狀態(tài)，倒置于光照培養(yǎng)箱中以25或30°C ， 40 mol m—2 s—1條件下培養(yǎng)5_10 天，為一個周期，如此重復3至4個周期；即獲得純化后藻液。
3. 按權(quán)利要求2所述的快速分離厭氧微藻的方法，其特征在于所述純化后藻液接種 于TAP培養(yǎng)基中，加入終濃度為lmg/L的刃天青作為厭氧指示劑，另外加入終濃度為0. 1% (m/m)的連二亞硫酸鈉作為除氧劑，而后將其處于厭氧狀態(tài)，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至培養(yǎng) 基變?yōu)樗{色或綠色，取藻落加入連二亞硫酸鈉，若藍色或綠色不褪去，表明分離到的微藻已 經(jīng)生長，屬于厭氧微藻。
4. 按權(quán)利要求3所述的快速分離厭氧微藻的方法，其特征在于所述厭氧狀態(tài)為將培 養(yǎng)基密封后迅速充入高純氮氣一分鐘，刃天青由藍色變?yōu)闊o色，即為厭氧狀態(tài)。
5. 按權(quán)利要求1所述的快速分離生長厭氧微藻的方法，其特征在于所述涂布有待分 離樣品的加入1. 5%瓊脂的TAP培養(yǎng)基，于12rC滅菌20min，冷卻后涂布；再涂布有待分離 樣品的加入1.5X瓊脂的TAP培養(yǎng)基上再鋪的加入1.5X瓊脂的TAP培養(yǎng)基于12rC滅菌 20min，冷卻至45t:，待用；所述低熔點固體石蠟為6(TC石蠟。
全文摘要
本發(fā)明涉及微藻的分離方法，具體的說是一種快速分離厭氧微藻的方法。將待分離樣品加入盛有TAP培養(yǎng)基的器皿中，然后用滅菌的液體石蠟密封，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至上層液體變成綠色，使待分離樣品充分富集生長，待用；取上述富集培養(yǎng)的待分離樣品1ml，稀釋至10-5，10-6和10-7三個稀釋度，將三個梯度的待分離樣品分別涂于加入1.5％瓊脂、冷卻的TAP培養(yǎng)基上，然后再鋪一層加入1.5％瓊脂的TAP培養(yǎng)基，而后再鋪一層低熔點固體石蠟，使其處于密封厭氧狀態(tài)，倒置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-10天；若出現(xiàn)藍色或綠色藻落，即為存在厭氧微藻；若沒有出現(xiàn)藍色或綠色藻落，即為不存在厭氧微藻。本發(fā)明可在短時間內(nèi)獲得厭氧微藻，方法簡單，實用性強。
文檔編號C12R1/89GK101709267SQ20091023054
公開日2010年5月19日 申請日期2009年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月27日
發(fā)明者喬洪金, 張曉娟, 朱大玲, 潘光華, 王廣策 申請人:中國科學院海洋研究所