專利名稱：一種動物線粒體dna的提取及純化方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學核酸提取純化技術領域，具體是涉及一種動物線粒體DNA 的提取及純化方法。
背景技術：
現(xiàn)有的動物線粒體DNA提取技術主要是堿變性法。該技術采用差速離心法提取線 粒體；SDS堿變性法裂解線粒體；酚抽提法純化mtDNA。該技術的突出特點是簡便快速，因此 該技術在生物學、醫(yī)學及法醫(yī)鑒定等領域得到廣泛應用。 由于應用該技術提取的線粒體DNA電泳時常在點樣孔附近有大分子DNA(殘留的 核DNA)及前端有RNA拖尾(殘留的RNA)等情況，不能滿足要求高的分子生物學研究，如 PCR擴增、酶切及測序等。因此，只有在此技術的基礎上加以改進，提高產(chǎn)品的純度，才能滿 足高水平分子生物學研究的需要，為我國生物學領域的研究與國際接軌提供保障。

發(fā)明內容
針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的是提供一種高純度的動物線粒體DNA提取及 純化方法。 本發(fā)明的技術方案如下一種動物線粒體DNA的提取方法，其創(chuàng)新性在于，在堿變 性法的基礎上增加了 DNasel消化步驟，以消除核DNA的殘留；增加了 RNase消化步驟，以去 除RNA的殘留。具體步驟如下 (1)取動物組織，加5-50mLSE液，勻漿、過濾后，吸入離心管；
(2) 1500r/min離心10-15min，取上清液，(TC條件下，12000r/min離心20_30min， 留沉淀，加STM液(或SE液)懸浮，加溶液D使終濃度為100 ii g/mL， 37。C溫浴30min (以 去除核DNA) ， 12000r/min離心10min，力B SE液(或STM液)懸浮線粒體，然后轉至 1. 5mLEppendorf管； (3) 12000r/min離心8-lOmin棄上清液，加150 y L溶液A混勻，加300 y L新制的 溶液B，混勻，冰浴10min，加225 y L溶液C，混勻，冰浴25-60min，溶液C的溫度為4°C ;
(4) 12000r/min離心6min，取上清液，加入等體積水飽和酚，室溫振蕩15min 后，再加與上清液等體積的酚、氯仿和異戊醇混合液，混勻，酚、氯仿和異戊醇的體積比
25 : 24 : i; (5) 12000r/min離心8-10min，取水相，加2-2. 5倍體積的無水乙醇混勻，12000r/ min離心lOmin，取沉淀，用溫度為(TC的70%乙醇洗滌，12000r/min離心2min，自然干燥；
(6)將所得動物線粒體DNA加Tris-EDTA緩沖液溶解，加溶液E使終濃度為20ug/ mL，-20。C凍存?zhèn)溆谩?所述SE液0. 25mol/L蔗糖，30mmol/LTris-HCl， lOmmol/L Na2EDTA，2. 5mmol/L CaCl2，pH :7. 3-8. 1 ;STM液:0. 25mol/L蔗糖，10,l/LTris-HCl， 0. 5,1/L MgCl2，pH :8. 0 ; 溶液A :10mmol/LTris-HCl， 10mmol/LNa2EDTA，0. 15mol/L NaCl，pH:8.0 ;溶液B :1% SDS含0. 2N NaOH，用時現(xiàn)配；溶液C :KAc溶液，294gKAc， 50mL 90%甲酸，加水至1000mL， pH :5. 5 ; 溶液D :DNaseI溶液，用TE緩沖液配制，濃度5mg/mL ;溶液E :RNaseA溶液，用TE緩沖液溶 解RNaseA，以lmg/mL的濃度配制100mL，煮沸10-15min，分成500 y 1/管，存于_20°C 。
前述的提取及純化方法，優(yōu)選的方案在于，所述步驟(1)取動物組織于SE液中漂 洗、剪碎，加5-50mLSE液，以電動勻漿器1500r/min上下勻漿10-12次，每次5秒，過濾后， 將勻漿吸入離心管中。 前述的提取及純化方法，優(yōu)選的方案在于，所述步驟(1)勻漿時溫度為0°C。
前述的提取及純化方法，優(yōu)選的方案在于，所述步驟(1)中動物組織為動物的新 鮮組織、冰凍組織或甲醛浸泡組織。 前述的提取及純化方法，優(yōu)選的方案在于，所述動物組織為魚的肝臟或性腺組織、 黑斑蛙的肝臟、性腺或肌肉組織。 前述的提取及純化方法，優(yōu)選的方案在于，所述步驟(4)飽和酚pH8. 0。
前述的提取及純化方法，優(yōu)選的方案在于，將步驟(5)所得動物線粒體DNA加溶液 E使終濃度20ug/mL，在37t:溫浴60min，再重復操作步驟(4)和(5)，產(chǎn)品于-2(TC凍存?zhèn)?用(更為有效地去除RNA)。 前述的提取及純化方法，優(yōu)選的方案在于，步驟(5)所得產(chǎn)品也可置于4t:冰箱干 燥，再進行后續(xù)步驟。 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)異效果在于
1、提取得到的線粒體DNA純度高。 2、電泳檢測顯示電泳條帶為清晰、整齊、均勻的一條帶；背景清晰，未見點樣孔 附近有大分子DNA及前端RNA拖尾等情況。 3、0D值分析顯示0D260/0D280值為1. 78-1. 82，能滿足線粒體DNA的酶切及測序 分析等研究的要求。


圖1.實施例1所得線粒體DNA的電泳圖。 圖2.本發(fā)明動物線粒體DNA的提取及純化方法簡易流程示意圖。
具體實施例方式
以下結合實施例和附圖對本發(fā)明的技術方案作進一步的詳細說明。但本發(fā)明不受 這些具體實施例的限制。若大規(guī)模實施，等比例放大即可。 實施例中所用原料(或設備)均為本領域常規(guī)用品，其均可從市場購買。具體 說明如下SE液(勻槳緩沖液)0. 25mol/L蔗糖，30mmol/LTris-HCl， 10mmol/L Na2EDTA， 2. 5,l/LCaCl2， pH :7. 3-8. 1 ;STM液:0. 25mol/L蔗糖，10,1/LTris-HCl， 0. 5mmol/L MgCl2， pH :8. 0 ;溶液A(TEN) :10mmol/LTris-HCl， 10mmol/LNa2EDTA，0. 15mol/L NaCl， pH : 8. 0 ;溶液B :1% SDS含O. 2N NaOH(用時用10% SDS和IN NaOH新配制);溶液C :KAc溶液， 294gKAc，50mL 90%甲酸，加水至1000mL， pH :5. 5 ;溶液D :DNaseI溶液，用TE緩沖液配制， 濃度5mg/mL ;溶液E :RNaseA溶液，用TE緩沖液溶解RNaseA，以lmg/mL的濃度配制lOOmL， 煮沸10-15min，分成500 ii 1/管，存于_20°C 。
其中TE緩沖液艮卩Tris-EDTAbuffer(10mM Tris， ImM EDTA， pH8. 0)，購自上海生 工生物工程技術服務有限公司，配制KAc溶液所用KAc購自上海生工生物工程技術服務有 限公司。 實施例1 :魚線粒體DNA的提取。 (1)取5-6g魚的肝臟組織，于少量SE溶液中漂洗、剪碎，加約50mLSE，以電動勻漿 器1500r/min上下勻槳12次。 (2)將勻槳物以1000r/min離心15min吸取上清液，12000r/min離心20min，沉淀 即為線粒體。加入4mLSTM液懸浮線粒體，加溶液D使終濃度為100 y g/mL (以去除核DNA)， 37。C溫浴，30min， 12000r/min離心10min，棄上清液；加4mLSE液懸浮線粒體，再轉入4個 1. 5mL Eppendorf管中。 (3) 12000r/min離心10min，棄上清液，每管加入150 yl溶液A，將沉淀懸浮后，各 加入300 ii 1新配制的溶液B混勻，冰浴10min后，再各加225 y 1冷溶液C(4°C )，混勻，冰 浴30min。 (4) 12000r/min離心6min，吸取上清液，加入等體積的水飽和酚，室溫振蕩15min 后，加原上清液l倍體積的酚-氯仿-異戊醇(體積比25 : 24 : l)，充分混勻。
(5) 12000r/min離心8min，吸取水相，加入2. 5倍體積無水乙醇混勻冰浴30min。 12000r/min離心10min，用70%冷乙醇(0°C )洗滌沉淀，12000r/min離心2min，自然干燥。
(6)加適量體積Tris-EDTA緩沖液溶解后，加入溶液E (終濃度20 y g/mL) ， _20°C 凍存?zhèn)溆谩?本實施例所得粒體DNA的0D260/0D280值為1. 78，能滿足線粒體DNA的PCR擴增、 酶切及測序分析等研究的要求。 圖1是本實施例所獲得線粒體DNA的電泳圖。通過圖1可見電泳條帶為清晰、整 齊、均勻的一條帶；背景清晰，未見點樣孔附近有大分子DNA及前端RNA拖尾等情況。說明 提取的線粒體DNA中未見核DNA和RNA殘留。
實施例2 :蛙的線粒體DNA提取純化。 (1)勻漿取2 15g黑斑蛙的肝臟或肌肉于少量SE勻漿緩沖液中剪碎，加約 20 30mLSE液，以電動勻漿器1500r/min上下勻漿10次，每次5秒，過濾后，將勻漿吸入離 心管中。 (2)純化線粒體第一次1500r/min離心15min取上清液。第二次12000r/min離 心20min取沉淀，加入2mLSTM液懸浮線粒體，加溶液D使終濃度為100 y g/mL， 37。C溫浴， 30min， 12000r/min離心10min，棄上清液，加4mLSE液懸浮，然后轉至4個1. 5mL Eppendorf 管，每管lmL。 (3) 12000r/min離心8min棄上清液，每管加150 y L溶液A將沉淀吹打均勻后加
300 ii L新制的溶液B，混勻，冰浴10min，各加225 y L冷溶液C，混勻，冰浴60min。 (4) 12000r/min離心6min，取上清液，加入等體積的水飽和酚，室溫振蕩15min后，
再加原上清液等體積的酚-氯仿-異戊醇(體積比25 : 24 : l)充分混勻。 (5) 12000r/min離心8min，取水相，加兩倍體積的無水乙醇混勻，冰浴30min 。
12000r/min離心10min。用70%冷乙醇(0°C )洗滌沉淀。12000r/min離心2min。自然干
燥3 4小時或4t:冰箱中過夜徹底干燥。
(6)加適量體積Tris-EDTA緩沖液溶解后，加溶液E (終濃度20ug/mL) ， 37°C ，溫浴 60min，重復操作步驟(4)和(5)，冰箱凍存?zhèn)溆谩?本實施例所得粒體DNA的0D260/0D280值為1. 80，能滿足線粒體DNA的酶切及測 序分析等研究的要求。 實施例3 :蜜蜂線粒體DNA提取純化。 (1)取新鮮蜜蜂或酒精浸泡標本于少量SE勻槳緩沖液中剪碎，加約2 5mLSE液， 以電動勻漿器1500r/min上下勻漿10次，每次5秒，過濾后，將勻漿吸入離心管中。
(2)第一次1500r/min離心15min取上清液。第二次12000r/min離心20min取 沉淀，加4mLSE液懸浮線粒體，加溶液D使終濃度為100 ii g/mL(以去除核DNA) ，37。C溫 浴，30min， 12000r/min離心10min，棄上清液，加入2mLSTM液懸浮線粒體，然后轉至2個 1. 5mLEppendorf管，每管lmL。 (3) 12000r/min離心8min棄上清液，每管加150 y L溶液A將沉淀吹打均勻后加 300 ii L新制的溶液B，混勻，冰浴10min，各加225 y L冷溶液C，混勻，冰浴60min。
(4) 12000r/min離心6min，取上清液，加入等體積的水飽和酚溶液，室溫振蕩 15min后，再加與原上清液等體積的酚-氯仿-異戊醇(體積比25 : 24 : 1)充分混勻。
(5) 12000r/min離心8min，取水相，加兩倍體積的無水乙醇混勻，冰浴30min 。 12000r/min離心10min。用70%冷乙醇(0°C )洗滌沉淀。12000r/min離心2min。自然干 燥3 4小時或4t:冰箱中過夜徹底干燥。 (6)加適量體積Tris-EDTA緩沖液溶解后，加適量體積Tris-EDTA緩沖液溶解后， 加入溶液E (終濃度20 ii g/mL)。加25 ii LTE溶解，冰箱凍存?zhèn)溆谩?本實施例所得粒體DNA的0D260/0D280值為1. 82，能滿足線粒體DNA的酶切及測 序分析等研究的要求。 實施例4 :魚線粒體DNA的提取。與實施例1所不同的是用魚的性腺組織，步驟(1)
勻漿時溫度為ot:。 實施例5 :蛙的線粒體DNA提取純化。與實施例2所不同的是用黑斑蛙的性腺組 織，步驟(4)飽和酚pH8.0。
權利要求
一種動物線粒體DNA的提取及純化方法，其特征在于，在堿變性法的基礎上增加DNaseI消化步驟，以消除核DNA的殘留；增加RNase消化步驟，以去除RNA的殘留。
2. 權利要求1所述的提取及純化方法，其特征在于，具體步驟如下(1) 取動物組織，加5-50mLSE液，勻漿、過濾后，吸入離心管；(2) 1500r/min離心10-15min，取上清液，0。C條件下，12000r/min離心20-30min，留沉淀，加STM液懸浮，加溶液D使終濃度為100 ii g/mL， 37。C溫浴30min， 12000r/min離心10min，加SE液懸浮，然后轉至1. 5mL E卯endorf管;(3) 12000r/min離心8-10min棄上清液，加150 y L溶液A混勻，加300 y L新制的溶液B，混勻，冰浴10min，加225 y L溶液C，混勻，冰浴25-60min，溶液C的溫度為4°C ;(4) 12000r/min離心6min，取上清液，加入等體積水飽和酚，室溫振蕩15min后，再加與上清液等體積的酚、氯仿和異戊醇混合液混勻，酚、氯仿和異戊醇的體積比25 : 24 : 1;(5) 12000r/min離心8-10min，取水相，加2-2. 5倍體積的無水乙醇混勻，12000r/min離心10min，取沉淀，用溫度為(TC的70%乙醇洗滌，12000r/min離心2min，自然干燥；(6) 將所得動物線粒體DNA加Tris-EDTA緩沖液溶解，加溶液E使終濃度為20ug/mL，-20。C凍存?zhèn)溆?；所述SE液0. 25mol/L蔗糖，30mmol/LTris-HCl， 10mmol/L Na2EDTA，2. 5mmol/L CaCl2， pH :7. 3-8. 1 ;STM液:0. 25mol/L蔗糖，10,1/LTris-HCl， 0. 5mmol/L MgCl2， pH :8. 0 ;溶液A :10mmol/LTris-HCl， 10mmol/LNa2EDTA， 0. 15mol/L NaCl， pH :8. 0 ;溶液B : 1 % SDS含0. 2N NaOH，用時現(xiàn)配；溶液C :KAc溶液，294gKAc，50mL 90%甲酸，加水至1000mL， pH :5. 5 ;溶液D :DNaseI溶液，用TE緩沖液配制，濃度5mg/mL ;溶液E :RNaseA溶液，用TE緩沖液溶解RNaseA，以lmg/mL的濃度配制100mL，煮沸10-15min，分成500 ii 1/管，存于_20°C 。
3. 權利要求2所述的提取及純化方法，其特征在于，所述步驟(1)取動物組織于SE液中漂洗、剪碎，加5-50mLSE液，以電動勻漿器1500r/min上下勻漿10-12次，每次5秒，過濾后，將勻漿吸入離心管中。
4. 權利要求2或3所述的提取及純化方法，其特征在于，所述步驟(1)勻漿時溫度為(TC。
5. 權利要求2所述的提取及純化方法，其特征在于，所述步驟(1)中動物組織為動物的新鮮組織、冰凍組織或甲醛浸泡組織。
6. 權利要求5所述的提取及純化方法，其特征在于，所述動物組織為魚的肝臟或性腺組織、黑斑蛙的肝臟、性腺或肌肉組織。
7. 權利要求2所述的提取及純化方法，其特征在于，所述步驟(4)飽和酚pH8.0。
8. 權利要求2所述的提取及純化方法，其特征在于，將步驟(5)所得動物線粒體DNA加溶液E使終濃度20ug/mL，在37t:溫浴60min，再重復操作步驟(4)和(5)，干燥產(chǎn)品再_20°C凍存?zhèn)溆谩?br> 9. 權利要求2所述的提取方法，其特征在于，步驟(5)所得產(chǎn)品也可置于4t:冰箱干燥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種動物線粒體DNA的提取方法，其創(chuàng)新性在于，在堿變性法的基礎上增加了DNaseI消化步驟，以消除核DNA的殘留；增加了RNase消化步驟，以去除RNA的殘留。該方法提取得到的線粒體DNA純度高。電泳檢測顯示電泳條帶為清晰、整齊、均勻的一條帶；背景清晰，未見點樣孔附近有大分子DNA及前端RNA拖尾等情況。
文檔編號C12N15/10GK101717772SQ20091023127
公開日2010年6月2日 申請日期2009年12月18日 優(yōu)先權日2009年12月18日
發(fā)明者王春明, 賈少波, 閆華超 申請人:聊城大學