專(zhuān)利名稱(chēng):焦磷酸測(cè)序技術(shù)鑒別禽流感病毒亞型的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于動(dòng)物病原檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域,涉及一種采用焦磷酸測(cè)序(Pyrosequencing) 技術(shù)鑒別禽流感病毒亞型的方法。
背景技術(shù):
禽流感(avian influenza, AI)是目前嚴(yán)重危害畜牧業(yè)和人類(lèi)健康的烈性傳染性 疾病,該病的傳播均可導(dǎo)致禽類(lèi)的呼吸系統(tǒng)疾病以及全身性敗血癥,幾乎所有的野生及家 養(yǎng)禽類(lèi)都可感染?,F(xiàn)在,高致病性禽流感已被國(guó)際獸疫局(0IE)列為A類(lèi)傳染病,我國(guó)農(nóng) 業(yè)部也把它們定為一類(lèi)動(dòng)物疫病。禽流感病毒屬于正粘病毒科流感病毒屬,病毒顆粒直徑 80nm-120nm,呈球形桿狀或長(zhǎng)絲狀。病毒基因組由8條負(fù)鏈單股RNA組成,每條RNA都以不 同的核糖核酸蛋白復(fù)合體形式存在?;蚪M共編碼10種蛋白(PA、PB1、PB2、HA、NA、NP、M1、 12、賂1、賂2),其中賂1和吧2為非結(jié)構(gòu)蛋白,其余均為結(jié)構(gòu)蛋白。HA亞型根據(jù)病毒表面粘 蛋白血凝素的不同分為HI H16共16個(gè),NA亞型是根據(jù)表面糖蛋白神經(jīng)氨酸酶的不同分 為附 N9共9個(gè)。目前研究較為集中的是HA和NA,它同時(shí)也是區(qū)分禽流感亞型的重要依 據(jù)。禽流感病毒亞型及毒力的診斷主要是血清學(xué)試驗(yàn)和雞胚接種實(shí)驗(yàn)。近年來(lái)又陸續(xù)開(kāi)發(fā) 了實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法以及基因芯片等技術(shù)鑒定亞型。傳統(tǒng)的病原分離及血清學(xué)診斷方 法操作繁瑣,無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)不同亞型的同步檢測(cè),RT-PCR方法也無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)該病毒進(jìn)行快速、 準(zhǔn)確、高通量檢測(cè)分型的目的,研究一種能夠?qū)α鞲胁《具M(jìn)行高通量快速排查、準(zhǔn)確鑒別亞 型的集成化診斷技術(shù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。焦磷酸測(cè)序技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的新技術(shù),是 目前唯一得到定量序列結(jié)果的檢測(cè)技術(shù),具有極高的準(zhǔn)確性,且重現(xiàn)性極佳,是一種通用型 技術(shù)平臺(tái),功能多樣,應(yīng)用領(lǐng)域廣泛,具有高通量、低成本的特點(diǎn),聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物即可 直接用于測(cè)序,不需進(jìn)行產(chǎn)物純化等二次處理,操作極為簡(jiǎn)便,所需樣品量小,符合出入境 檢驗(yàn)檢疫的要求。鑒于禽流感病毒危害的嚴(yán)重性,加強(qiáng)流感疫情的監(jiān)控,提高檢測(cè)方法的準(zhǔn) 確度和檢測(cè)效率,對(duì)有效控制流感病毒的傳播在現(xiàn)階段具有重要的實(shí)際意義。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn),尋求提供一種禽流感病毒亞型的焦 磷酸測(cè)序技術(shù)鑒別方法,為禽類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)、肉食品加工和出口商以及國(guó)際肉類(lèi)食品貿(mào)易等方 面提供一種快速、簡(jiǎn)便、高效、實(shí)用的鑒別方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明的主要原理是利用焦磷酸測(cè)序技術(shù),通過(guò)測(cè)序引物和 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增單鏈脫氧核糖核酸模板雜交,與脫氧核糖核酸聚合酶、腺嘌呤核苷三 磷酸(ATP)硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶和底物(APS)、熒光素孵育,逐一加入 四種三磷酸堿基脫氧核苷酸(dNTPs)(三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸dATP ;三磷酸胸腺嘧啶脫 氧核苷酸dTTP ;三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸dCTP ;三磷酸鳥(niǎo)嘌呤脫氧核苷酸dGTP),如與模板 配對(duì),此三磷酸堿基脫氧核苷酸與引物的末端形成共價(jià)鍵,釋放焦磷酸基團(tuán)(PPi);腺嘌呤 核苷三磷酸(ATP)硫酸化酶在底物(APS)存在的情況下催化焦磷酸形成ATP,ATP驅(qū)動(dòng)熒光素酶介導(dǎo)的熒光素向氧化熒光素轉(zhuǎn)化,氧化熒光素發(fā)出與腺嘌呤核苷三磷酸量成正比的可 見(jiàn)光信號(hào);光信號(hào)由電荷耦合器件(CCD)收集并由軟件轉(zhuǎn)化為峰;每個(gè)光信號(hào)的峰高與反 應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比,腺嘌呤核苷三磷酸和未摻入的三磷酸堿基脫氧核苷酸由三 磷酸腺苷雙磷酸酶降解,淬滅光信號(hào),并再生反應(yīng)體系,利用光信號(hào)轉(zhuǎn)化得到的峰圖,對(duì)樣 品中的禽流感病毒亞型進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒別。本發(fā)明的實(shí)現(xiàn),首先設(shè)計(jì)禽流感病毒H5、H7、H9、m和N2特異性引物及焦磷酸測(cè)序 引物;再提取待測(cè)樣品的核糖核酸(RNA),然后分別用各亞型的引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈 式反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增;用進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè),若H5、H7、H9、N1和N2引 物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為127bp、222bp、174bp、269bp、101bp,則制備焦磷酸測(cè)序單鏈模板,再 進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng),最后根據(jù)RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果和焦磷酸測(cè)序結(jié)果判定樣品中禽流感病 毒的亞型。本發(fā)明所述的引物設(shè)計(jì)根據(jù)DNASTAR軟件的同源性分析結(jié)果,選取禽流感病毒 H5、H7、H9、N1和N2各個(gè)亞型中的保守序列設(shè)計(jì)上游引物、下游引物和測(cè)序引物,并選取包 含該指紋區(qū)域的保守核苷酸序列,作為特征序列;禽流感病毒H5、H7、H9、m和N2特異性引 物及測(cè)序引物、特征序列分別為 本發(fā)明所述的RT-PCR反應(yīng)將提取的待測(cè)樣品RNA分別在5個(gè)管中進(jìn)行禽流 感病毒各亞型的反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)體系包含3yL RNA模板,2iiL 25mmol/L氯化鎂(MgC12),luL 10 X RNAPCR 緩沖液,luL 2. 5mmol/L 三磷酸堿基脫氧核苷酸(dNTP) ,0. 25u L 40U/ U L RNA 酶抑制齊[J,0. 5ii L 5U/u L AMV RNA 反轉(zhuǎn)錄酶,0. 5 ii L 20pmol/ii L 禽流感病 毒各亞型上游引物和下游引物,用焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate,DEPC)水補(bǔ)足 體積至10 iiL,瞬時(shí)離心混合,反轉(zhuǎn)錄條件為42°C 30min,98°C lmin,4°C ;在反轉(zhuǎn)錄后的 10 u L cDNA(complementary DNA)溶液中加入10倍聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液(10XPCR buffer) 5 u L, 5U/ u L Taq DNA聚合酶0. 25 u L,20pmol/ u L禽流感病毒各亞型上游引物和 下游引物0.5iiL,DEPC水補(bǔ)足體積至50 iiL,PCR循環(huán)條件為94°C預(yù)變性5min后,進(jìn)入 94°C變性30s,54°C退火,72°C延伸30s,共循環(huán)50次;然后72°C再延伸lOmin。本發(fā)明所述的制備焦磷酸測(cè)序單鏈模板使用50ul標(biāo)記有生物素的PCR產(chǎn)物與 200ug鏈霉親和素包被的磁珠,在室溫條件下孵育20分鐘;用vacuum prep tool將與磁珠 結(jié)合后的PCR產(chǎn)物吸起,然后在70%乙醇中清洗5s ;變性緩沖液(denatureation buffer) 洗5s ;最后移到?jīng)_洗緩沖液(washing buffer)中清洗10s ;vaccum prep tool放入含有測(cè) 序引物的板中,搖動(dòng),釋放磁珠。將樣品放入80°C烘箱2分鐘,再冷卻到室溫。本發(fā)明所述的焦磷酸測(cè)序反應(yīng)在28°C下自動(dòng)在PYR0MARK ID儀器上檢測(cè),加樣 使用600毫巴/8毫秒的加樣壓力和時(shí)間,每輪反應(yīng)時(shí)間65 ;引物鏈隨著不同三磷酸堿基脫 氧核苷酸(dNTP)的加入而延伸;隨著核酸的結(jié)合,CCD攝像機(jī)檢測(cè)到發(fā)出的光信號(hào)。本發(fā)明所述的根據(jù)RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果和焦磷酸測(cè)序結(jié)果判定樣品中禽流感病毒亞 型利用H5、H7、H9、m和N2上游引物和下游引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,若RT-PCR反應(yīng)結(jié)果為 陰性,則判定樣品不含有禽流感H5、H7、H9、m和N2亞型;若RT-PCR反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性,再利 用相應(yīng)亞型的測(cè)序引物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序分析,測(cè)序片段與目標(biāo)片段完全相同的,確定為含 有禽流感病毒的相應(yīng)亞型,若測(cè)序片段與目標(biāo)片段有一個(gè)以上堿基不同,則判定樣品不含 有禽流感H5、H7、H9、N1和N2亞型。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比,吸收了 RT-PCR和DNA測(cè)序技術(shù)兩方面的優(yōu)勢(shì),應(yīng)用很短 的一段特異序列的測(cè)定滿足對(duì)分子診斷的需要,使得亞型鑒定結(jié)果更加可靠,方法更快捷。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實(shí)施例1 鑒別出口的雞肉產(chǎn)品中是否含有禽流感病毒亞型1、設(shè)計(jì)特異性引物序列通過(guò)Internet登陸美國(guó)國(guó)立生物信息技術(shù)中心(NCBI),查詢(xún)檢索已公布的禽流 感病毒各亞型的的核苷酸序列,不包含不明堿基成分序列,對(duì)同源性較近的同年份同地點(diǎn) 的毒株只選取一株,用DNAStar 7. 1軟件包中的Editseq和MegAlign軟件對(duì)所選樣本的 HA、NA基因核苷酸序列進(jìn)行編輯,逐一比對(duì),用Clustal ff Method(軟件)默認(rèn)參數(shù)對(duì)所選 的HA、NA核苷酸序列進(jìn)行同源性比較,找到代表各個(gè)亞型的保守序列區(qū)域,以及表征該區(qū) 域的特異核苷酸序列(目標(biāo)檢測(cè)序列)。PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)和測(cè)序引物設(shè)計(jì)均通過(guò)Assay Design SW軟件進(jìn)行,使用得分較 高的一組引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn),根據(jù)DNASTAR的同源性分析結(jié)果,選取樣本基因中較保守的序列 區(qū)域,設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,以便于擴(kuò)增出特異性單一條帶,為后續(xù)測(cè)序奠定基礎(chǔ);同時(shí)為各個(gè)擴(kuò) 增區(qū)域中包含的特異核苷酸序列(特征序列)設(shè)計(jì)測(cè)序引物,H5、H7、H9、m和N2引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為 127bp、222bp、174bp、269bp、101bp。禽流感病毒H5、H7、H9、m和N2特異性引物及測(cè)序引物、特征序列分別為
H5亞型上游引物5'-ACATTTCCGTTGGAACATCAACA-3‘
H5亞型下游引物5'-ATGGCATCATTCGGCTTTAAAA-3,,5,進(jìn)行生物素標(biāo)記;
H5亞型測(cè)序引物5'-CAACACTGAACCAGAGATT-3,,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 127bp ;
H5亞型特征序列5'-GGTACCGAAAATA-3’
H7亞型上游引物5'-AAACAATGGGATTCACATACAGC-3,,5,進(jìn)行生物素標(biāo)記;
H7亞型下游引物5'-ATTTGGTCTGTTCTGTGGTTGATC-3‘
H7亞型測(cè)序引物5'-GCATAGAATGAAGATCCTG,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 222bp ;
H7亞型特征序列5'-AGAT-3,
H9亞型上游引物 5' -TGTGTCTTACAATGGGACAAGC-3,,5,進(jìn)行生物素標(biāo)記;
H9亞型下游引物5'-CGGTGGGTGGGTGATTTA-3‘
H9亞型測(cè)序引物5'-TGATTTATGCCCCAC-3,,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 174bp ;
H9亞型特征序列5'-TCTTTTCAT
N1亞型上游引物5'-GGTTCCAAGGGGGATGTGT-3,,
N1亞型下游引物5'-GGGCCAGAAATTCCAATTGT-3,,5,進(jìn)行生物素標(biāo)記
N1亞型測(cè)序引物5'-CCTGCTATAGCTCCAAA-3,,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 269bp
N1亞型特征序列5'-AACTCAAGG-3,
N2亞型上游引物5'-AGGCTCTCTGCAAGTGGAGATA-3,,5,進(jìn)行生物素標(biāo)記
N2亞型下游引物5'-AAGGTAGTCCCCTGCCCAAGT-3‘
N2亞型測(cè)序引物5'-GACCGCATGATACATAAGT-3,,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 lOlbp
N2亞型特征序列5'-ACAAGAGAA-3,。
2、提取待測(cè)樣品的RNA
利用TRIZ0L裂解液法提取待測(cè)樣品的RNA,具體步驟為取滅菌的1. 5mL離心管,加
入600ii L TRIZ0L裂解液,加入待測(cè)豬肉樣品各200mg,再加入200ii L氯仿,研磨,混勻器上 振蕩混勻30s,于4°C 12000r/min離心15min,吸取上清液500 u L轉(zhuǎn)移到新的1. 5mL離心管 中,再加入-20°C預(yù)冷500 ii L異丙醇,室溫沉淀30min后,于4°C 12000r/min離心15min, 小心倒去上清,加入600 uL 70%乙醇,顛倒洗滌,于4°C 12000r/min離心lOmin,再倒去上 清,將離心管倒置于吸水紙上,室溫干燥;最后加入10 y L超純水,輕輕混勻,溶解管壁上的 RNA, 2000r/min離心5s,即得到樣本的RNA。提取的RNA須在2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增;若需 長(zhǎng)期保存須放置冰箱。3、以禽流感病毒各亞型引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增將提取的待測(cè)樣品RNA分別在5個(gè)管中進(jìn)行禽流感病毒各亞型的反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)體 系包含3 ii L RNA 模板,2 ii L 25mmol/L 氯化鎂(MgC12) ,luL 10 X RNA PCR 緩沖液,1 u L 2. 5mmol/LdNTP (三磷酸堿基脫氧核苷酸),0. 25iiL 40U/ u L RNA酶抑制劑,0. 5 y L 5U/ UL AMV RNA反轉(zhuǎn)錄酶,0.5 iiL 20pmol/y L禽流感病毒各亞型上游引物和下游引物,用 DEPCWiethypyrocarbonate,焦碳酸二乙酯)水補(bǔ)足體積至10 y L,瞬時(shí)離心混合,反轉(zhuǎn)錄 條件為 42 °C 30min,98°C lmin,4°C ;在反轉(zhuǎn)錄后的 10 ii L cDNA(complementary DNA)溶 液中加入10XPCR 13吐€61~(10倍聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液)51^,5"1^ Taq DNA聚合酶0. 25 u L,20pmol/ u L禽流感病毒各亞型上游引物和下游引物0. 5 y L,DEPC水補(bǔ)足體積至 50 uL, PCR循環(huán)條件為94°C預(yù)變性5min后,進(jìn)入94°C變性30s,54°C退火,72°C延伸30s, 共循環(huán)50次;然后72°C再延伸lOmin。4、進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,取2g瓊脂糖,于lOOmL電泳緩沖液中加熱,充分 溶化,加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0. 5 y g/mL,制膠。在電泳槽中加入電泳緩沖液,使液 面剛剛沒(méi)過(guò)凝膠;將3 y L 6 y L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合,點(diǎn)樣;9V/cm 恒壓電泳,直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠中部;紫外檢測(cè)儀下觀察電泳結(jié)果,待檢禽肉樣品 能夠擴(kuò)增出特異性條帶,H5亞型為127bp,N1亞型為269bp,其他各亞型H7、H9、N2沒(méi)有產(chǎn) 生擴(kuò)增條帶。5、制備焦磷酸測(cè)序單鏈模板使用50 u 1標(biāo)記有生物素的PCR產(chǎn)物與200 u g鏈霉親和素包被的磁珠,在室溫 25°C下孵育20分鐘,用vacuum prep tool將與磁珠結(jié)合后的PCR產(chǎn)物吸起,然后在70%乙 醇中$青;denatureation buffer ^ 5s ;washing buffer 中i青 1 10s ;vaccum prep tool放入含有H5基因、附基因測(cè)序引物的板中,搖動(dòng),釋放磁珠;將樣品放入80°C烘 箱2分鐘,再冷卻到室溫。6、焦磷酸測(cè)序在焦磷酸測(cè)序儀(PYR0MARK ID)上進(jìn)行反應(yīng),28 °C條件下,加樣使用600毫巴 /8毫秒的加樣壓力和時(shí)間,每輪反應(yīng)時(shí)間65秒,引物鏈隨著不同dNTP的加入而延伸; 隨著核酸的結(jié)合,CCD攝像機(jī)檢測(cè)到發(fā)出的光信號(hào),H5基因、m焦磷酸測(cè)序結(jié)果分別為 GGTACCGAAAATA、AACTCAAGG。7、結(jié)果判定禽肉樣品的HI基因擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為127bp,N1基因擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為269bp,與已 知擴(kuò)增序列長(zhǎng)度一致;經(jīng)過(guò)焦磷酸測(cè)序,測(cè)定的H5序列與禽流感病毒H5特征序列一致,為 GGTACCGAAAATA ;測(cè)定的附序列與禽流感病毒附特征序列一致,為AACTCAAGG,因此判定禽 肉樣品中含有的禽流感病毒為H5W亞型。實(shí)施例2 鑒別山東某養(yǎng)殖廠的雞群中是否感染禽流感病毒亞型1、設(shè)計(jì)特異性引物序列同實(shí)施例1。2、提取待測(cè)樣品的RNA 取養(yǎng)殖場(chǎng)雞群的鼻腔拭子樣品在混合器上充分混合后,用高壓滅菌鑷子將拭子中 的液體擠出,室溫放置30min,取上清液,采用RNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit Ver 3. 0),按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行 RNA 的提取。3、以禽流感病毒各亞型引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增同實(shí)施例1。4、進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,取2g瓊脂糖,于100mL電泳緩沖液中加熱,充分 溶化,加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0. g/mL,制;在電泳槽中加入電泳緩沖液,使液 面剛剛沒(méi)過(guò)凝膠;將3 y L 6 y L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合,點(diǎn)樣;9V/cm恒壓電泳,直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠中部;紫外檢測(cè)儀下觀察電泳結(jié)果,待檢樣品能夠 擴(kuò)增出特異性條帶,H7亞型為222bp,N2亞型為lOlbp,其他各亞型H5、H9、N1沒(méi)有產(chǎn)生擴(kuò) 增條帶。5、制備焦磷酸測(cè)序單鏈模板使用50 u 1標(biāo)記有生物素的PCR產(chǎn)物與200 u g鏈霉親和素包被的磁珠,在室溫 25°C下孵育20分鐘,用vacuum prep tool將與磁珠結(jié)合后的PCR產(chǎn)物吸起,然后在70%乙 醇中$青;denatureation buffer ^ 5s ;washing buffer 中i青 1 10s ;vaccum prep tool放入含有H7基因、N2基因測(cè)序引物的板中,搖動(dòng),釋放磁珠;將樣品放入80°C烘 箱2分鐘,再冷卻到室溫。6、焦磷酸測(cè)序在焦磷酸測(cè)序儀(PYR0MARK ID)上進(jìn)行反應(yīng),28°C條件下,加樣使用600毫巴/8 毫秒的加樣壓力和時(shí)間,每輪反應(yīng)時(shí)間65秒,引物鏈隨著不同dNTP的加入而延伸;隨著 核酸的結(jié)合,CCD攝像機(jī)檢測(cè)到發(fā)出的光信號(hào),H7基因、N2焦磷酸測(cè)序結(jié)果分別為AGAT、 ACAAGAGAA。7、結(jié)果判定雞群樣品的H7基因擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為222bp,N2基因擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為lOlbp,與已 知擴(kuò)增序列長(zhǎng)度一致;經(jīng)過(guò)焦磷酸測(cè)序,測(cè)定的H7序列與禽流感病毒H7特征序列一致,為 AGAT ;測(cè)定的N2序列與禽流感病毒N2特征序列一致,為ACAAGAGAA,因此判定禽肉樣品中 含有的禽流感病毒為H7N2亞型。核苷酸序列表<110>山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心<120>焦磷酸測(cè)序技術(shù)鑒別禽流感病毒亞型的方法<160>15<170>PatentIn version 3. 5<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>(1). . (23)<223>用于禽流感病毒擴(kuò)增H5亞型基因的上游引物<400>1acatttccgt tggaacatca aca 23<210>2
<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>0106]<221>primer_bind
0107]<222>(1). . (22)
0108]<223>用于禽流感病毒擴(kuò)增H5亞型基因的下游引物
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0123]<212>DNA
0124]<213>人工序列
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0128]<223>用于禽流感病毒擴(kuò)增H7亞型基因的上游引物
0129]<400>4
0130]aaacaatggg attcacatac age 23
0131]<210>5
0132]<211>24
0133]<212>DNA
0134]<213>人工序列
0135]<220>
0136]<221>primer_bind
0137]<222>(1). . (24)
0138]<223>用于禽流感病毒擴(kuò)增H7亞型基因的下游引物
0139]<400>5
0140]atttggtctg ttctgtggtt gate 24
0141]<210>6
0142]<211>19
0143]<212>DNA
0144]<213>人工序列0145]<220>
0146]<221>primer_bind
0147]<222>(1). . (19)
0148]<223>用于禽流感病毒擴(kuò)增H7亞型基因的測(cè)序引物
0149]<400>6
0150]gcatagaatg aagatcctg 19
0151]<210>7
0152]<211>22
0153]<212>DNA
0154]<213>人工序列
0155]<220>
0156]<221>primer_bind
0157]<222>(1). . (22)
0158]<223>用于禽流感病毒擴(kuò)增H9亞型基因的上游引物
0159]<400>7
0160]tgtgtcttac aatgggacaa gc 22
0161]<210>8 0162]<211>18
0163]<212>DNA
0164]<213>人工序列
0165]<220>
0166]<221>primer_bind
0167]<222>(1). . (18)
0168]<223>用于禽流感病毒擴(kuò)增H9亞型基因的下游引物
0169]<400>8
0170]cggtgggtgg gtgattta 18
0171]<210>9
0172]<211>15
0173]<212>DNA
0174]<213>人工序列
0175]<220>
0176]<221>primer_bind
0177]<222>(1). . (15)
0178]<223>用于禽流感病毒擴(kuò)增H9亞型基因的測(cè)序引物
0179]<400>9
0180]tgatttatgc cccac 15
0181]<210>10
0182]<211>19
0183]<212>DNA<213>人工序列 <220>
<221>primer_bind <222>(1). . (19)
<223>用于禽流感病毒擴(kuò)增m亞型基因的上游引物 <400>10
ggttccaagg gggatgtgt 19
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind <222>(1). . (20)
<223>用于禽流感病毒擴(kuò)增m亞型基因的下游引物 <400>11
gggccagaaa ttccaattgt 20
<210>12
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind <222>(1). . (17)
<223>用于禽流感病毒擴(kuò)增m亞型基因的測(cè)序引物 <400>12
cctgctatag ctccaaa 17 <210>13 <211>22 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<221>primer_bind <222>(1). . (22)
<223>用于禽流感病毒擴(kuò)增N2亞型基因的上游引物 <400>13
aggctctctg caagtggaga ta 22
<210>14
<211>21
12
<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>(1). . (21)<223>用于禽流感病毒擴(kuò)增N2亞型基因的下游引物<400>14aaggtagtcc cctgcccaag t 21<210>15<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>(1). . (19)<223>用于禽流感病毒擴(kuò)增N2亞型基因的測(cè)序引物<400>15gaccgcatga tacataagt 19
1權(quán)利要求
一種焦磷酸測(cè)序技術(shù)鑒別禽流感病毒亞型的方法,其特征在于首先設(shè)計(jì)禽流感病毒H5、H7、H9、N1和N2特異性引物及焦磷酸測(cè)序引物;再提取待測(cè)樣品的核糖核酸或稱(chēng)RNA,然后分別用各亞型的引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或稱(chēng)RT PCR擴(kuò)增;用進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè),若H5、H7、H9、N1和N2引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為127bp、222bp、174bp、269bp、101bp,則制備焦磷酸測(cè)序單鏈模板,再進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng),最后根據(jù)RT PCR擴(kuò)增結(jié)果和焦磷酸測(cè)序結(jié)果判定樣品中禽流感病毒的亞型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的焦磷酸測(cè)序技術(shù)鑒別禽流感病毒亞型的方法,其特征在于所 述的引物設(shè)計(jì)是根據(jù)DNASTAR軟件的同源性分析結(jié)果,選取禽流感病毒H5、H7、H9、m和N2 各個(gè)亞型中的保守序列設(shè)計(jì)上游引物、下游引物和測(cè)序引物,并選取包含該指紋區(qū)域的保 守核苷酸序列,作為特征序列;禽流感病毒H5、H7、H9、N1和N2特異性引物及測(cè)序引物、特 征序列分別為H5 亞型上游引物5,-ACATTTCCGTTGGAACATCAACA-3, H5亞型下游引物5,-ATGGCATCATTCGGCTTTAAAA-3’,5’進(jìn)行生物素標(biāo)記; H5亞型測(cè)序引物5,-CAACACTGAACCAGAGATT-3,,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為127bp ; H5 亞型特征序列5,-GGTACCGAAAATA-3’H7亞型上游引物5,-AAACAATGGGATTCACATACAGC-3’,5’進(jìn)行生物素標(biāo)記; H7 亞型下游引物5,-ATTTGGTCTGTTCTGTGGTTGATC-3, H7亞型測(cè)序引物5,-GCATAGAATGAAGATCCTG-3,,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為222bp ; H7亞型特征序列5,-AGAT-3,H9亞型上游引物5,-TGTGTCTTACAATGGGACAAGC-3,,5,進(jìn)行生物素標(biāo)記;H9 亞型下游引物5,-CGGTGGGTGGGTGATTTA-3,H9亞型測(cè)序引物5,-TGATTTATGCCCCAC-3,,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為174bp ;H9亞型特征序列5,-TCTTTTCAT-3’N1 亞型上游引物5,-GGTTCCAAGGGGGATGTGT-3,,N1亞型下游引物5,-GGGCCAGAAATTCCAATTGT-3,,5,進(jìn)行生物素標(biāo)記N1亞型測(cè)序引物5,-CCTGCTATAGCTCCAAA-3,,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為269bpN1亞型特征序列5,-AACTCAAGG-3,N2亞型上游引物5,-AGGCTCTCTGCAAGTGGAGATA-3,,5,進(jìn)行生物素標(biāo)記 N2 亞型下游引物5,-AAGGTAGTCCCCTGCCCAAGT-3, N2亞型測(cè)序引物5,-GACCGCATGATACATAAGT-3,,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為lOlbp N2 亞型特征序列5,-ACAAGAGAA-3,。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的焦磷酸測(cè)序技術(shù)鑒別禽流感病毒亞型的方法,其特征在于所 述的提取待測(cè)樣品的RNA是利用TRIZOL LS RNA抽提試劑處理禽病毒待測(cè)樣品,氯仿抽提 蛋白質(zhì),異丙醇沉淀得到RNA ;或用商業(yè)化的RNA提取試劑盒提取。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的焦磷酸測(cè)序技術(shù)鑒別禽流感病毒亞型的方法,其特征在于所 述的RT-PCR反應(yīng)是將提取的待測(cè)樣品RNA分別在5個(gè)管中進(jìn)行禽流感病毒各亞型的反轉(zhuǎn) 錄,反應(yīng)體系包含3 ii L RNA模板,2 ii L 25mmol/L氯化鎂,1 y L 10 X RNAPCR緩沖液,1 u L 2. 5mmol/L三磷酸堿基脫氧核苷酸,0. 25iiL 40U/ u L RNA酶抑制劑,0. 5 y L 5U/u L AMV RNA反轉(zhuǎn)錄酶,0. L ZOpmol/y L禽流感病毒各亞型上游引物和下游引物,用焦碳酸二乙酯或稱(chēng)DEPC水補(bǔ)足體積至10 u L,瞬時(shí)離心混合,反轉(zhuǎn)錄條件為42°C 30min,98°C lmin,4°C; 在反轉(zhuǎn)錄后的10 y L cDNA溶液中加入10倍聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液5 ii L,5U/ ii L Taq DNA 聚合酶0. 25 u L,20pmol/ u L禽流感病毒各亞型上游引物和下游引物0. 5 y L,DEPC水補(bǔ)足 體積至50ii L,PCR循環(huán)條件為94°C預(yù)變性5min后,進(jìn)入94°C變性30s,54°C退火,72°C延 伸30s,共循環(huán)50次;然后72°C再延伸lOmin。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的焦磷酸測(cè)序技術(shù)鑒別禽流感病毒亞型的方法,其特征在于所 述的制備焦磷酸測(cè)序單鏈模板使用50ul標(biāo)記有生物素的PCR產(chǎn)物與200ug鏈霉親和素包 被的磁珠,在室溫條件下孵育20分鐘;用vacuum prep tool將與磁珠結(jié)合后的PCR產(chǎn)物吸 起,然后在70%乙醇中清洗5s ;變性緩沖液洗5s ;最后移到?jīng)_洗緩沖液中清洗10s ;vaccum prep tool放入含有測(cè)序引物的板中,搖動(dòng),釋放磁珠;將樣品放入80°C烘箱2分鐘,再冷卻 到室溫。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的焦磷酸測(cè)序技術(shù)鑒別禽流感病毒亞型的方法,其特征在于所 述的焦磷酸測(cè)序反應(yīng)是在28 °C下自動(dòng)在PYR0MARK ID儀器上檢測(cè),加樣使用600毫巴/8毫 秒的加樣壓力和時(shí)間,每輪反應(yīng)時(shí)間65 ;引物鏈隨著不同三磷酸堿基脫氧核苷酸的加入而 延伸;隨著核酸的結(jié)合,CCD攝像機(jī)檢測(cè)到發(fā)出的光信號(hào)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的焦磷酸測(cè)序技術(shù)鑒別禽流感病毒亞型的方法,其特征在于所 述的根據(jù)RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果和焦磷酸測(cè)序結(jié)果判定樣品中禽流感病毒亞型是利用H5、H7、 H9.N1和N2上游引物和下游引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,若RT-PCR反應(yīng)結(jié)果為陰性,則判定樣品 不含有禽流感H5、H7、H9、N1和N2亞型;若RT-PCR反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性,再利用相應(yīng)亞型的測(cè) 序引物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序分析,測(cè)序片段與目標(biāo)片段完全相同的,確定為含有禽流感病毒的 相應(yīng)亞型,若測(cè)序片段與目標(biāo)片段有一個(gè)以上堿基不同,則判定樣品不含有禽流感H5、H7、 H9、N1禾口 N2亞型。
全文摘要
本發(fā)明屬于動(dòng)物病原檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域,涉及一種采用焦磷酸測(cè)序技術(shù)鑒別禽流感病毒亞型的方法,先設(shè)計(jì)禽流感病毒H5、H7、H9、N1和N2特異性引物及焦磷酸測(cè)序引物;再提取待測(cè)樣品的核糖核酸,然后分別用各亞型的引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增;用進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè),若H5、H7、H9、N1和N2引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為127bp、222bp、174bp、269bp、101bp,則制備焦磷酸測(cè)序單鏈模板,再進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng),最后根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果和焦磷酸測(cè)序結(jié)果判定樣品中禽流感病毒的亞型;本發(fā)明吸收了RT-PCR和DNA測(cè)序技術(shù)的優(yōu)勢(shì),應(yīng)用特異序列的測(cè)定滿足對(duì)分子診斷的需要,使得亞型鑒定結(jié)果可靠,方法快捷。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101921868SQ20091023153
公開(kāi)日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2009年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月4日
發(fā)明者凌宗帥, 孫濤, 岳志芹, 張?zhí)? 徐彪, 梁成珠, 趙玉然 申請(qǐng)人:山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心