專利名稱：一種大規(guī)模篩查扇貝snp的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于扇貝DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種大規(guī)模篩查扇貝SNP標(biāo)記 的方法。
背景技術(shù)：
SNP標(biāo)記因其數(shù)目眾多且具有穩(wěn)定遺傳性，在高密度遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建和性狀 相關(guān)功能基因的QTL定位方面有廣泛的應(yīng)用。扇貝作為我國最重要的海水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類之 一，在海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中占有極其重要的地位。大規(guī)模篩查扇貝SNP標(biāo)記對于扇貝高密度遺 傳圖譜的構(gòu)建和經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的QTL精細(xì)定位，并進(jìn)一步進(jìn)行分子設(shè)計(jì)育種至關(guān)重要。目 前大規(guī)模篩查SNP標(biāo)記在基因組信息豐富的人類和模式生物中應(yīng)用較多，然而在基因組信 息相對匱乏的扇貝上尚未見有報(bào)導(dǎo)過高效的、低成本的大規(guī)模篩查方法。隨著新一代測序 技術(shù)通量不斷提高和成本持續(xù)下降，使得利用新一代測序技術(shù)來大規(guī)模篩查扇貝SNP標(biāo)記 成為可能。然而由于扇貝的基因組較大，有1.2G，且含有較多的重復(fù)序列，全基因組測序分 離效率相對較低，因而以扇貝均一化的轉(zhuǎn)錄本為樣品，結(jié)合高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué) 分析軟件來篩查SNP標(biāo)記，一方面避開重復(fù)序列，提高篩查效率；另一方面可同時獲得與功 能基因直接關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，具有通量高、效率高、成本低的特點(diǎn)，大規(guī)模篩查扇貝SNP標(biāo)記 的有效方法正在成為本技術(shù)領(lǐng)域中廣大研發(fā)人員探究的課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于尋求一種大規(guī)模篩查櫛孔扇貝SNP標(biāo)記的方法，該方法利用高 通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析軟件實(shí)現(xiàn)對扇貝進(jìn)行大規(guī)模SNP標(biāo)記的篩選。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明按照以下操作七個步驟完成1、用溶液D和酚氯仿提取不同發(fā)育時期、不同地理群體的多個櫛孔扇貝的多種組 織的RNA，按比例混勻后紫外分光光度計(jì)測定其濃度備用；2、構(gòu)建扇貝全長cDNA樣品參照SMARTTM cDNA Library Construction Kit，但需將 cDNA 合成引物的序列替 換為 5' -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTCGCAGTCGGTACTTTTTTCTTTTTTV-3，。(l)cDNA 第一鏈合成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以lug RNA為模板，補(bǔ)RNase-Free水至4ul，加入lul 10uM cDNA合 成引物、lul 10uM SMART IVTM Oligonucleotide (5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG -3，)，70°C溫育 3min，立即置冰上冷卻 lmin ；再加入 1 XFirst-StrandBuffer、ImM dNTP、 0. 01M DTT、1U Superscript II，混勻后42°C溫育lh，65°C溫育3min終止第一鏈的反應(yīng)；(2)cDNA第二鏈的合成與擴(kuò)增PCR反應(yīng)總體積為30ul，包含lul稀釋5倍的cDNA第一鏈產(chǎn)物，250uM dNTP, 0. 46uM NUP 引物(5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，)，1U Advantage 2Polymerase Mix, IXAdvantage 2 PCR buffer，反應(yīng)條件94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 40s，65°C退火 lmin,72°C延伸6min，進(jìn)行15-19個循環(huán)，平行擴(kuò)增16管，回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物，1 %瓊脂糖凝膠電泳 和紫外分光光度計(jì)檢測；3、全長 cDNA 均一化具體步驟參照TRIMMER-DIRECT cDNA均一化說明書進(jìn)行，均一化后再次擴(kuò)增， PCR反應(yīng)總體積為30ul，包含lul cDNA均一化產(chǎn)物，250uM dNTP，0.46uM NUP引物，1U Advantage 2 Polymerase Mix, 1 XAdvantage 2 PCR buffer ；5min, 94°C變性40s，65°C退火lmin，72°C延伸6min，進(jìn)行15-19個循環(huán)，平行擴(kuò)增16管，回收純化 擴(kuò)增產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測；4、超聲波打斷取200ul cDNA(cDNA濃度為50_100ng/ul)于冰浴的1. 5ml離心管，將超聲波破碎 儀的錐形探頭浸沒液面以下，20W功率破碎約20s，1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測片斷大小，片段 應(yīng)主要集中在10(T800bp之間，經(jīng)過打斷的樣品回收純化后電泳和紫外分光光度計(jì)檢測；5、連接測序接頭(1)末端修復(fù)體系為12. 5ul，包含 50ng 打斷純化后 cDNA，lX NEB2 buffer, IX BSA, 500uMdNTP, 1. 8U T4 DNA polymerase, 12U Klenow fragment of DNA polymerase I,混勻后，室溫下放 置90min，70°C溫浴15min終止反應(yīng)，室溫下冷卻；(2)接頭連接連接體系為25ul，包含上步產(chǎn)物 12. 5ul，加入 IX T4 DNA ligase buffer, 2uM adapt or A (接頭組成為 5，-GCCTCCCTCGCGCCATCAGCCGCGCAGGT-3，和 5，-ACCTGCGCGG-3，)， 2uM adaptor B(接頭組成為 5，-GCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGCGGCCA-3，和 5‘-TGGCCGCTCGT-3‘), 2500U T4 DNA ligase，12°C過夜，加入 100ul 無菌水稀釋 5 倍后 65°C 溫浴lOmin，冷卻至室溫。純化回收連接產(chǎn)物，紫外分光光度計(jì)檢測；(3)樣品擴(kuò)增PCR反應(yīng)總體積為30ul，包含約40ug連接回收產(chǎn)物，250uM dNTP，2uM A引物 (5，-GCCTCCCTCGCGCCATCAG-3，)，2uM B 弓丨物(5，-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG-3，)，0. 005uM A+halfswitch 引物(5， -GCCTCCCTCGCGCCATCAGCCGCGCAGGTACGTATCAACGCAGAGTACGCGG-3’)，0. 005uM A+TrsaC引物(5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGCCGCGCAGGTCGCAGTCGGTACTTTTTTCTT TTTT-3'), lXAdvantage 2 PCR buffer, lUAdvantage 2 Polymerase Mix，反應(yīng)條件94°C 預(yù)變性5min，94°C變性40s，65°C退火lmin，72°C延伸4min，進(jìn)行15-19個循環(huán)，平行擴(kuò)增16 管，反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測，產(chǎn)物應(yīng)為約10(Tl000bp的彌 散帶，切膠回收300-800bp的片段5ug ；454FLX-titanium上機(jī)，由測序公司完成；6、數(shù)據(jù)分析利用生物學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，即可得到大量的SNP標(biāo)記；7、SNP標(biāo)記驗(yàn)證選取了 100個篩查的SNP標(biāo)記，設(shè)計(jì)引物；提取40個扇貝個體的DNA，等量混合作 為模板，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行常規(guī)克隆測序，每個位點(diǎn)擴(kuò)增序列測20個克隆，將單堿基差異出現(xiàn) 頻率在10%及以上的位點(diǎn)定義為SNP標(biāo)記。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其原理安全可靠，工藝步驟簡單易控，大規(guī)模篩選運(yùn)行可靠，效果優(yōu)良，可以大范圍廣泛應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例進(jìn)一步對本發(fā)明進(jìn)行說明。實(shí)施例
本實(shí)施例的具體操作步驟如下1、用異硫氰酸胍、酚、氯仿方法分別提取櫛孔扇貝囊胚、原腸胚、擔(dān)輪幼蟲、D形幼 蟲、成貝全組織多個個體RNA，按比例混勻后紫外分光光度計(jì)測定其濃度備用；2、構(gòu)建櫛孔扇貝全長cDNA樣品參照SMARTTM cDNA Library Construction Kit，但需將 cDNA 合成引物的序列替 換為 5' -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTCGCAGTCGGTACTTTTTTCTTTTTTV-3，。(l)cDNA 第一鏈合成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以lug RNA為模板，補(bǔ)RNase-Free水至4ul，加入Iul IOuM cDNA合 成引物、Iul IOuM SMART IVTM Oligonucleotide (5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG -3，)，70°C溫育 3min，立即置冰上冷卻 Imin ；再加入 IXFirst-StrandBufferUmM dNTP、 0. OlM DTTUU Superscript II，混勻后42°C溫育lh，65°C溫育3min終止第一鏈的反應(yīng)；(2)cDNA第二鏈的合成與擴(kuò)增PCR反應(yīng)總體積為30ul，包含Iul稀釋5倍的cDNA第一鏈產(chǎn)物，250uM dNTP,
0.46uM NUP 引物(5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，)，IU Advantage 2Polymerase Mix, IXAdvantage 2 PCR buffer，反應(yīng)條件94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 40s，65°C退火 lmin， 72°C延伸6min，進(jìn)行15-19個循環(huán)；平行擴(kuò)增16管，回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物，1 %瓊脂糖凝膠電 泳和紫外分光光度計(jì)檢測；3、全長 cDNA 均一化具體步驟參照TRIMMER-DIRECT cDNA均一化說明書進(jìn)行。均一化后再次擴(kuò)增， PCR反應(yīng)總體積為30ul，包含Iul cDNA均一化產(chǎn)物，250uM dNTP，0.46uM NUP引物，IU Advantage 2 Polymerase Mix, 1 XAdvantage 2 PCR buffer ；5min, 94°C變性40s，65°C退火lmin，72°C延伸6min，進(jìn)行15-19個循環(huán)，平行擴(kuò)增16管。回收純 化擴(kuò)增產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測；4、超聲波打斷取200ul cDNA(cDNA濃度為50_100ng/ul)于冰浴的1. 5ml離心管，將超聲波破碎 儀的錐形探頭浸沒液面以下，20W功率破碎約20s，1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測片斷大小，片段 應(yīng)主要集中在100 SOObp之間，經(jīng)過打斷的樣品回收純化后電泳和紫外分光光度計(jì)檢測。5、連接測序接頭(1)末端修復(fù)體系為12. 5ul，包含 50ng 打斷純化后 cDNA，IX NEB2 buffer, IX BSA, 500uMdNTP,
1.8U T4 DNA polymerase, 12U Klenow fragment of DNA polymerase I,混勻后，室溫下放 置90min，70°C溫浴15min終止反應(yīng)，室溫下冷卻；(2)接頭連接連接體系為25ul，包含上步產(chǎn)物 12. 5ul，加入 IX T4 DNA ligase buffer, 2uMadapt or A (接頭組成為 5，-GCCTCCCTCGCGCCATCAGCCGCGCAGGT-3，和 5，-ACCTGCGCGG-3，)， 2uM adaptor B(接頭組成為 5，-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG ACGAGCGGCCA-3，禾口 5，-TGGCCGCTCGT-3，)，2500U T4 DNA Iigase0 12°C過夜。加入 IOOul 無菌水稀釋 5 倍后 65°C溫浴lOmin，冷卻至室溫，純化回收連接產(chǎn)物，紫外分光光度計(jì)檢測；(3)樣品擴(kuò)增PCR反應(yīng)總體積為30ul，包含Ug連接回收產(chǎn)物，250uM dNTP, 2uM A引物 (5，-GCCTCCCTCGCGCCATCAG-3，)，2uM B 弓丨物(5，-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG-3，)，0. 005uM A+halfswitch 引物(5， -GCCTCCCTCGCGCCATCAGCCGCGCAGGTACGTATCAACGCAGAGTACGCGG-3’)，0. 005uM A+TrsaC引物(5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGCCGCGCAGGTCGCAGTCGGTACTTTTTTCTT TTTT-3') ,IXAdvantage 2 PCR buffer, IUAdvantage 2 Polymerase Mix，反應(yīng)條件94°C 預(yù)變性5min，94°C變性40s，65°C退火lmin，72°C延伸4min，進(jìn)行15-19個循環(huán)，平行擴(kuò)增16 管，反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測。產(chǎn)物應(yīng)為約10(Tl000bp的彌 散帶，切膠回收300-800bp的片段5ug ；454 FLX-titanium測序，共兩板，由測序公司完成；6、數(shù)據(jù)分析用QulitySNP軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。參照軟件使用說明，聚類使用CAP3軟件，參數(shù) 為重疊長度(100)，重疊部分相似度(95% )，其他參數(shù)均為缺省值；QulitySNP的參數(shù)設(shè)置 為聚類簇最少序列數(shù)目為4，最少等位基因數(shù)目為2，并控制5’端低質(zhì)量堿基數(shù)、單個多態(tài) 位點(diǎn)序列間的相似度、所有多態(tài)位點(diǎn)的相似度和3’端低質(zhì)量序列比例等參數(shù)，最小的SNP 置信分為2 ；篩查獲得SNP標(biāo)記28，206個。其中，轉(zhuǎn)換(CT、AG) 18，127個，顛換(AT、AC、TG、 CG) 9，321個，三等位形式標(biāo)記738個，四等位形式標(biāo)記20個。7、有效性驗(yàn)證選取了 100個篩查的SNP標(biāo)記，設(shè)計(jì)引物；提取90個櫛孔扇貝個體的DNA，等量混 合作為模板，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行常規(guī)克隆測序，每個位點(diǎn)擴(kuò)增序列測20個克??；將單堿基差異 出現(xiàn)頻率在10%及以上的位點(diǎn)定義為SNP標(biāo)記，本實(shí)施例驗(yàn)證100個標(biāo)記，其中部分標(biāo)記實(shí)
際存在。本實(shí)施例具有通量高、效率高、成本低的特點(diǎn)，適用于大規(guī)模篩查櫛孔扇貝SNP標(biāo) 記，在實(shí)際運(yùn)行中效果安全達(dá)到了發(fā)明目的的要求。表1本發(fā)明涉及的引物序列表
權(quán)利要求
一種大規(guī)模篩查扇貝SNP的方法，其特征在于(1)、用溶液D和酚氯仿提取多個櫛孔扇貝RNA，按比例混勻后紫外分光光度計(jì)測定其濃度備用；(2)、構(gòu)建扇貝全長cDNA樣品參照SMARTTM cDNA Library Construction Kit，將cDNA合成引物的序列替換為5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTCGCAGTCGGTACTTTTTTCTTTTTTV-3’；①、cDNA第一鏈合成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以1ug RNA為模板，補(bǔ)RNase-Free水至4ul，加入1ul 10uM cDNA合成引物、1ul 10uM SMART IVTM Oligonucleotide(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3’)，70C溫育3min，立即置冰上冷卻1min；再加入1×First-Strand Buffer、1mM dNTP、0.01M DTT、1U SuperscriptII，混勻后42℃溫育1h，65℃溫育3min終止第一鏈的反應(yīng)；②、cDNA第二鏈的合成與擴(kuò)增PCR反應(yīng)總體積為30ul，包含1ul稀釋5倍的cDNA 第一鏈產(chǎn)物，250uM dNTP，0.46uM NUP引物(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’)，1U Advantage 2Polymerase Mix，1×Advantage 2PCR buffer，反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5min，94℃變性40s，65℃退火1min，72℃延伸6min，進(jìn)行15-19個循環(huán)，平行擴(kuò)增16管，回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物，1％瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測；(3)、全長cDNA均一化具體步驟參照市售的TRIMMER-DIRECT cDNA均一化說明書進(jìn)行，均一化后再次擴(kuò)增，PCR反應(yīng)總體積為30ul，包含1ul cDNA均一化產(chǎn)物，250uM dNTP，0.46uM NUP引物，1U Advantage 2Polymerase Mix，1×Advantage 2PCRbuffer；反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5min，94℃變性40s，65℃退火1min，72℃延伸6min，進(jìn)行15-19個循環(huán)，平行擴(kuò)增16管，回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物，1％瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測；(4)、超聲波打斷取200ul濃度為50-100ng/ul的cDNA于冰浴的1.5ml離心管，將超聲波破碎儀的錐形探頭浸沒液面以下，20W功率破碎20s，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測片斷大小，片段集中在100～800bp之間，經(jīng)過打斷的樣品回收純化后電泳和紫外分光光度計(jì)檢測；(5)、連接測序接頭①、末端修復(fù)體系為12.5ul，包含50ng打斷純化后cDNA，1X NEB2buffer，1X BSA，500uM dNTP，1.8U T4DNA polymerase，12U Klenow fragment of DNApolymerase I，混勻后，室溫下放置90min，70℃溫浴15min終止反應(yīng)，室溫下冷卻；②、接頭連接連接體系為25ul，包含上步產(chǎn)物12.5ul，加入1X T4DNA ligasebuffer，2uM adaptor A，接頭組成為5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGCCGCGCAGGT-3’和5’-ACCTGCGCGG-3’，2uM adaptor B，接頭組成為5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGCGGCCA-3’和5’-TGGCCGCTCGT-3’，2500U T4DNA ligase，12℃過夜，加入100ul無菌水稀釋5倍后65℃溫浴10min，冷卻至室溫，純化回收連接產(chǎn)物，紫外分光光度計(jì)檢測；③、樣品擴(kuò)增PCR反應(yīng)總體積為30ul，包含約40ug連接回收產(chǎn)物，250uMdNTP，2uM A引物(5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAG-3’)，2uM B引物(5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG-3’)，0.005uM A+halfswitch引物(5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGCCGCGCAGGTACGTATCAACGCAGAGTACGCGG-3’)，0.005uM A+TrsaC引物(5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGCCGCGCAGGTCGCAGTCGGTACTTTTTTCTTTTTT-3’)，1×Advantage 2PCR buffer，1U Advantage 2Polymerase Mix，反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5min，94℃變性40s，65℃退火1min，72℃延伸4min，進(jìn)行15-19個循環(huán)，平行擴(kuò)增16管，反應(yīng)產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測，產(chǎn)物應(yīng)為100～1000bp的彌散帶，切膠回收300-800bp的片段5ug；454FLX-titanium上機(jī)，完成測序；(6)、數(shù)據(jù)分析用市售的生物學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，得到SNP標(biāo)記；(7)、SNP標(biāo)記驗(yàn)證選取100個篩查的SNP標(biāo)記，設(shè)計(jì)引物；提取40個櫛孔扇貝個體的DNA，等量混合作為模板，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行常規(guī)克隆測序，每個位點(diǎn)擴(kuò)增序列測20個克隆，將單堿基差異出現(xiàn)頻率在10％及以上的位點(diǎn)定義為SNP標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明屬于扇貝DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域的一種大規(guī)模篩查扇貝SNP標(biāo)記的方法，先用溶液D和酚氯仿提取多個櫛孔扇貝RNA，按比例混勻后紫外分光光度計(jì)測定其濃度備用；再構(gòu)建扇貝全長cDNA樣品，包括cDNA第一鏈合成和cDNA第二鏈的合成與擴(kuò)增；然后進(jìn)行全長cDNA均一化，再進(jìn)行超聲波打斷；然后連接測序接頭，包括末端修復(fù)、接頭連接和樣品擴(kuò)增；最后用生物學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)得到SNP標(biāo)記；再選取篩查的SNP標(biāo)記，設(shè)計(jì)引物；提取扇貝個體的DNA，等量混合作為模板，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行常規(guī)克隆測序，將單堿基差異出現(xiàn)頻率在10％及以上的位點(diǎn)定義為SNP標(biāo)記；其原理安全可靠，工藝步驟簡單易控，大規(guī)模篩選運(yùn)行可靠，效果優(yōu)良，應(yīng)用性強(qiáng)。
文檔編號C12Q1/68GK101845489SQ20091023157
公開日2010年9月29日 申請日期2009年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月3日
發(fā)明者付曉騰, 侯睿, 包振民, 李紀(jì)勤, 王珊, 胡曉麗, 胡景杰, 陸維 申請人:中國海洋大學(xué)