專利名稱：抑制雞肌肉生成抑制素基因表達(dá)的siRNA及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抑制雞肌肉生成抑制素基因表達(dá)的siRNA及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2006年我國禽肉產(chǎn)量1506. 6萬噸，僅次于美國，位居世界第二，比1985年增長了 6. 5倍，而同期世界禽肉產(chǎn)量只增長了 1.4倍。據(jù)FAO統(tǒng)計(jì)，我國肉雞屠宰量從1990年的 21. 29億只增加到2006年的76. 95億只，凈增加55. 66億只。雞肉產(chǎn)量從1990年的266. 32 萬噸增加到2006年的1070. 1萬噸，凈增加803. 78萬噸。目前我國禽肉產(chǎn)量占肉類總量的 18. 7%，人 均占有量1. 5千克，同比世界禽肉產(chǎn)量比例30. 3%還有很大的上升空間。白羽肉雞是快大型商品化選育的雞種，具有生長快，產(chǎn)肉多的特點(diǎn)，但肉質(zhì)較差。 地方優(yōu)質(zhì)雞品種肉質(zhì)鮮嫩，風(fēng)味佳，但是生長緩慢，產(chǎn)肉較少。二戰(zhàn)以后，快大型白羽肉雞的 育種進(jìn)展很快，與1957年相比，快大肉雞達(dá)到上市體重的時(shí)間縮短了 69天，目前只需32天 即可上市。優(yōu)質(zhì)雞在我國有豐富的種質(zhì)資源，粗略統(tǒng)計(jì)約有100多個(gè)地方雞種，如三黃雞， 麻雞，狼山雞，油雞等。這些雞肉質(zhì)鮮嫩，色香味美，其中烏雞還具有很高的藥用價(jià)值。優(yōu)質(zhì) 雞種長期作為我國肉雞生產(chǎn)的特色產(chǎn)業(yè)，具有廣闊的市場(chǎng)空間，深受消費(fèi)者歡迎。雖然價(jià)格 相較于快大型白羽肉雞要貴一倍甚至更多，但是其需求量仍在不斷增長。國外知名的肉雞 育種公司也一直在覬覦這個(gè)龐大市場(chǎng)。但是優(yōu)質(zhì)雞的育種進(jìn)展緩慢，達(dá)到1.5Kg時(shí)日齡不 少于50天。目前優(yōu)質(zhì)雞育種工作遵循世代傳遞清晰的傳統(tǒng)育種方法，父系、母系均采用一 年一個(gè)世代的育種方案，憑經(jīng)驗(yàn)選取質(zhì)量性狀，建立育種群進(jìn)行世代雜交來選育。這樣不僅 世代間隔長，選擇強(qiáng)度低，并且產(chǎn)肉量和肉質(zhì)性狀與其它質(zhì)量性狀雜交亂配，導(dǎo)致育種效率 低下，遺傳進(jìn)展緩慢。因此目前亟需加快我國優(yōu)質(zhì)雞育種技術(shù)體系創(chuàng)新。國家對(duì)此也相當(dāng) 重視，自從1980年國家科委設(shè)立優(yōu)質(zhì)黃羽肉雞選育計(jì)劃以來，其后每個(gè)五年計(jì)劃都有涉及 優(yōu)質(zhì)雞育種攻關(guān)計(jì)劃，以期提高優(yōu)質(zhì)肉雞的產(chǎn)肉量和肉品質(zhì)。1998年Fire等將雙鏈RNA(dsRNA)注入線蟲體內(nèi)，相關(guān)基因的表達(dá)被特異性的 抑制，產(chǎn)生了與基因敲除一樣的缺陷型。他們把這種基因轉(zhuǎn)錄后卻被抑制表達(dá)的現(xiàn)象叫 做 RNAi (RNA interference)。其機(jī)制是生物細(xì)胞內(nèi)的長雙鏈 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)被Dicer酶結(jié)合并切成長度為21_23bp的小干擾RNA分子(small interfering RNA, siRNA)。siRNA識(shí)別并結(jié)合靶基因轉(zhuǎn)錄后的mRNA上的同源序列，引導(dǎo)RNA誘導(dǎo)沉默 復(fù)合物(RNA-induced silencing complex, RISC)將mRNA降解，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后的基因沉默 (posttranscriptional gene silencing, PTGS)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，RNAi 現(xiàn)象廣泛存在 于動(dòng)植物體內(nèi)。除了 siRNA以外，具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA) 在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過加工后也可以變成siRNA，并誘導(dǎo)RNA干擾，而且作用時(shí)間更為持久。這樣使 得針對(duì)一些具有潛在利用價(jià)值的基因構(gòu)建shRNA表達(dá)載體，并導(dǎo)入生物體內(nèi)，特異性的對(duì) 靶基因表達(dá)進(jìn)行干擾，從而使動(dòng)植物相關(guān)基因的表達(dá)被長期沉默成為可能。也預(yù)示著動(dòng)植 物在醫(yī)學(xué)醫(yī)藥，生物科技和畜牧業(yè)生產(chǎn)中潛在的巨大實(shí)用價(jià)值。肌肉生成抑制素基因(Myostatin，MSTN)是1997年McPherron等從小鼠骨骼肌cDNA文庫中篩選出的一種負(fù)性調(diào)控骨骼肌生長的基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一 種抑制雞肌肉生成抑制素基因表達(dá)的SiRNA及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的作用于肌肉生成抑制素基因的小干擾RNA，為如下a)或b)或c)a)由序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列組成的雙鏈RNA ；b)由序列表的序列3和序列表的序列4所示核苷酸序列組成的雙鏈RNA ；c)由序列表的序列5和序列表的序列6所示核苷酸序列組成的雙鏈RNA。本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述小干擾RNA在抑制細(xì)胞的肌肉生成抑制素基因表達(dá) 中的應(yīng)用。所述肌肉生成抑制素基因可為GenBank Accession Number :ΝΜ_001001461 自 5， 末端第1至1128位核苷酸。所述細(xì)胞具體可為雞胚成肌細(xì)胞。本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述小干擾RNA在抑制雞的肌肉生成抑制素基因表達(dá)中 的應(yīng)用。所述肌肉生成抑制素基因可為GenBank Accession Number :ΝΜ_001001461 自 5， 末端第1至1128位核苷酸。以上任一所述方法均可應(yīng)用于雞的育種。本發(fā)明獲得了有效抑制雞MSTN基因表達(dá)的小干擾RNA，在分子生物學(xué)上通過實(shí)時(shí) 熒光定量PCR證明它有效的降低了 MSTN的表達(dá)；在胚胎學(xué)上通過顯微注射試驗(yàn)成功獲得了 骨骼肌明顯增大的雛雞。以上結(jié)果說明，本發(fā)明的小干擾RNA可用于雞的育種，從而提高肉 雞尤其是優(yōu)質(zhì)雞的產(chǎn)肉量。


圖1為實(shí)施例2中SiRNA轉(zhuǎn)染雞胚成肌細(xì)胞(CEM)后MSTN基因熒光定量實(shí)驗(yàn)結(jié)^ ο圖2為實(shí)施例3中注射siRNA-9的實(shí)驗(yàn)組雛雞(a)與對(duì)照組雛雞(b)及相應(yīng)的解 剖照。圖3為實(shí)施例3中實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)雞胚胎期肌肉MSTN基因的表達(dá)量的結(jié)^ ο
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的“ ％ ”，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例1、siRNA的設(shè)計(jì)和合成根據(jù)NCBI公布的肌肉生成抑制素基因(MSTN)設(shè)計(jì)三對(duì)siRNA如下第一對(duì)(siRNA-9):5，-GCUAGCAGUCUAUGUUUAUTT-3，(序列 1)；3，-TTCGAUC⑶CAGAUACAAAUA-5，(序列 2)；
第二對(duì)(siRNA-338):5，-CCACAACCGAGACGAUUAUTT-3，(序列 3)；3，-TTGGUGUUGGCUCUGCUAAUA-5，(序列 4)；第三對(duì)(siRNA-926):5，-GCUCCGGAGAAU⑶GAAUUTT-3，(序列 5)；3，-TTCGAGGCCUCUUACACUUAA-5，(序列 6)；對(duì)照siRNA(siRNA-NC) 5，-UUCUCCGAAC⑶⑶CACGUTT-3，；
3 ’ -TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA-5 ’?；瘜W(xué)合成以上4對(duì)SiRNA，化學(xué)合成的siRNA為減壓離心干燥品，制品干燥于管底， 成干粉狀。分別將3對(duì)siRNA進(jìn)行實(shí)施例2和實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前，分別將siRNA離心 后加入適量DEPC水震蕩器混勻制成濃度為20 μ M溶液。實(shí)施例2、siRNA轉(zhuǎn)染后雞胚成肌細(xì)胞中MSTN基因的表達(dá)量分別用實(shí)施例1制備的三對(duì)siRNA對(duì)雞胚成肌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，具體步驟如 下1、取發(fā)育到9天的白來航種蛋(購自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院試驗(yàn)雞場(chǎng))用滅 菌彎頭鑷撕破雞蛋內(nèi)殼膜、尿囊膜和羊膜，夾出雞胚，放于已加入DPBS的無菌培養(yǎng)皿中漂 洗去血污、雜質(zhì)。2、將胚胎移至解剖鏡下，用眼科鑷去除雞胚胸部皮膚，露出胸肌，從胸腔肋骨處剪 取肌肉。放進(jìn)裝有DPBS溶液的培養(yǎng)皿中。以同樣方式分離另一半胸肌肉組織。3、用眼科剪將肌肉組織剪碎成1立方毫米的肉塊，加入適量DPBS，用去尖頭的移 液器吹打幾次，靜置后去上清。4、向肌肉糜中加入含15% FBS的DMEM培養(yǎng)基，漩渦振蕩器上振蕩30s，靜置后吸 取上清細(xì)胞懸液，重復(fù)該步驟3-5次。5、將收集到的細(xì)胞懸液吹打數(shù)次，使細(xì)胞分散均勻，經(jīng)四層紗布過濾后收集細(xì)胞 濾液。6、將細(xì)胞濾液接種于大的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37°C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)半小時(shí)。使其中 混雜的成纖維細(xì)胞貼壁。7、輕輕拿出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，吸出上層細(xì)胞培養(yǎng)液，適度稀釋后，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù) 其中的活細(xì)胞數(shù)(雞胚成肌細(xì)胞)。按照3X105細(xì)胞/mL的濃度接種到已經(jīng)0.01%多聚 賴氨酸包被的細(xì)胞培養(yǎng)板中。8、六孔板中原代培養(yǎng)雞胚成肌細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到50%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。9、轉(zhuǎn)染前用DPBS洗去原培養(yǎng)基，換為OPTI-MEM培養(yǎng)基(無血清)；轉(zhuǎn)染液(A液 siRNA 100pmol+250 μ L OPTI-MEM 培養(yǎng)基，室溫 5 分鐘；B 液脂質(zhì)體 2000 3 μ L+250 μ L OPTI-MEM培養(yǎng)基，室溫放置5分鐘；將A、B液混合，室溫放置20分鐘)逐滴加入每個(gè)培養(yǎng) 孔中；同時(shí)設(shè)對(duì)照孔(NC)，用等體積的無菌水代替siRNA;繼續(xù)培養(yǎng)，6小時(shí)后換正常完全培 養(yǎng)基。10,36小時(shí)后收集細(xì)胞，提取RNA，實(shí)時(shí)熒光定量進(jìn)行MSTN基因表達(dá)干擾效果檢 測(cè)。結(jié)果見圖1(反應(yīng)設(shè) 立β-actin為內(nèi)對(duì)照基因，目的基因與β-actin基因的起始 拷貝數(shù)之比，作為該基因的相對(duì)表達(dá)量)。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了 3對(duì)siRNA的成肌細(xì)胞的MSTN基因表達(dá)量顯著低于對(duì)照組；siRNA-9，siRNA-338的抑制效果達(dá)到了 70%。在分子水平上 證明了本發(fā)明的siRNA干擾序列可以有效抑制MSTN基因的表達(dá)，間接證明了其促進(jìn)肌肉的 生長的作用，具有活體應(yīng) 用價(jià)值。實(shí)施例3、siRN A轉(zhuǎn)染后活體雞胚中MSTN基因的表達(dá)量分別用實(shí)施例1制備的三對(duì)siRNA和對(duì)照siRNA (siRNA-NC)對(duì)活體雞胚進(jìn)行轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)情況見表1。表1活體雞胚轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)情況
權(quán)利要求
1.作用于肌肉生成抑制素基因的小干擾RNA，為如下a)或b)或c)a)由序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列組成的雙鏈RNA；b)由序列表的序列3和序列表的序列4所示核苷酸序列組成的雙鏈RNA；c)由序列表的序列5和序列表的序列6所示核苷酸序列組成的雙鏈RNA。
2.權(quán)利要求1所述小干擾RNA在抑制細(xì)胞的肌肉生成抑制素基因表達(dá)中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述肌肉生成抑制素基因?yàn)?GenBankAccession Number :ΝΜ_001001461 自 5，末端第 1 至 1128 位核苷酸。
4.如權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于所述細(xì)胞為雞胚成肌細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1所述小干擾RNA在抑制雞的肌肉生成抑制素基因表達(dá)中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述肌肉生成抑制素基因?yàn)?GenBankAccession Number :NM_001001461 自 5，末端第 1 至 1128 位核苷酸。
7.權(quán)利要求2至6中任一所述應(yīng)用在雞的育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制雞肌肉生成抑制素基因表達(dá)的siRNA及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了作用于肌肉生成抑制素基因的小干擾RNA，為如下a)或b)或c)a)由序列表的序列1和序列表的序列2組成的雙鏈RNA；b)由序列表的序列3和序列表的序列4組成的雙鏈RNA；c)由序列表的序列5和序列表的序列6組成的雙鏈RNA。本發(fā)明獲得了有效抑制雞MSTN基因表達(dá)的小干擾RNA，在分子生物學(xué)上通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR證明它有效的降低了MSTN的表達(dá)；在胚胎學(xué)上通過顯微注射試驗(yàn)成功獲得了骨骼肌明顯增大的雛雞。以上結(jié)果說明，本發(fā)明的小干擾RNA可用于雞的育種，從而提高肉雞尤其是優(yōu)質(zhì)雞的產(chǎn)肉量。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102041257SQ20091023540
公開日2011年5月4日 申請(qǐng)日期2009年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月13日
發(fā)明者孫研研, 楊寧, 蔣斌, 鄭江霞, 陳思睿 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)