專利名稱：基于新型dna結(jié)合染料的實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種PCR檢測(cè)方法及其應(yīng)用，特別是涉及一種基于新型DNA結(jié)合染料 的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法及其在制備實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1996年，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)由美國(guó)Applied Biosystems公司首先推出。所謂 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè) 熒光信號(hào)出現(xiàn)的先后順序以及信號(hào)強(qiáng)弱的變化來(lái)即時(shí)分析目的基因的拷貝數(shù)目，通過(guò)與加 入已知量的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了 PCR從 定性到定量的飛躍，它以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng) 等優(yōu)點(diǎn)成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具。 目前，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)物質(zhì)的不同，熒光定量PCR技術(shù)主 要分兩類，熒光染料和熒光探針。其中熒光探針包括T叫man探針、分子信標(biāo)、FRET探針、蝎 式探針等。熒光染料主要包括Y0-PR0-1、 SYBR Green 1、BEB0和LC Green等。熒光染料 定量PCR的優(yōu)勢(shì)在于它使用方便，不需要設(shè)計(jì)復(fù)雜的熒光，使檢測(cè)方法變得簡(jiǎn)便，同時(shí)也降 低了檢測(cè)的成本。而且，它能監(jiān)測(cè)任何雙鏈DNA序列的擴(kuò)增，沒(méi)有引物特異性，可以用于不 同的模板。然而，正是由于熒光染料能和任何雙鏈DNA結(jié)合，因此它也能與非特異的雙鏈 DNA(如引物二聚體)結(jié)合，使實(shí)驗(yàn)容易產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)。引物二聚體的問(wèn)題目前可以用熔 解曲線(melting curve)加以解決，來(lái)區(qū)分特異性和非特異性擴(kuò)增。因此，作為一種方便快 捷的定量PCR方法，熒光染料定量PCR應(yīng)用非常廣泛。 SYBR Green I因?yàn)槠涠拘缘?、價(jià)格便宜，成為最常使用的一種定量PCR熒光染料。 但是，SYBR Green I也存在一些明顯的不足。例如，在未進(jìn)行優(yōu)化之前不能用于普通PCR緩 沖液中，并且需要額外的試劑(如DMSO、 BSA等)來(lái)增加反應(yīng)的效率。盡管通過(guò)提高M(jìn)gCl2 的濃度可以在一定程度上減小其抑制效應(yīng)，但SYBR Green I仍可以濃度依賴的方式抑制 PCR反應(yīng)。這種抑制效應(yīng)可能是由于染料的分解產(chǎn)物所致。目前，SYBRGreen I已被廣泛應(yīng) 用于病原的檢測(cè)。但是，利用該染料所做的熔解曲線(Tm)可受到染料和DNA濃度的影響。 例如，3倍濃度的起始DNA的差異，就可能引起1度的Tm值的變化。SYBR Green I的另一 個(gè)缺點(diǎn)是在多重PCR中應(yīng)用有限。研究發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增時(shí)，熔解曲線只能檢測(cè)到一 個(gè)產(chǎn)物，而電泳分析可以明顯觀察到兩個(gè)產(chǎn)物。這個(gè)可能與擴(kuò)增DNA和染料的相對(duì)濃度有 關(guān)。盡管SYBR Green I的應(yīng)用范圍較廣，但是存在染料可用濃度范圍小、序列結(jié)合偏性大 等缺點(diǎn)。 SYTO家族的染料是一種比較常見的DNA結(jié)合染料，它具有很多特性，包括膜通透 性、低細(xì)胞毒性、結(jié)合DNA后熒光增強(qiáng)等，這些特性使得它們適合于標(biāo)記活細(xì)胞。但是它們 對(duì)雙鏈與單鏈DNA的特異性結(jié)合能力不清，或者說(shuō)它們作為定量PCR的染料是否合適仍不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種對(duì)PCR反應(yīng)的抑制效應(yīng)小、可用濃度范圍大、序列結(jié)合偏性小、敏感性高的新型DNA結(jié)合染料，并建立了基于該染料的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案一種基于新型DNA結(jié)合染料的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，是以SYTO為熒光染料進(jìn)行的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。
所述SYTO熒光染料優(yōu)選為SYT082 。
所述SYTO熒光染料的濃度優(yōu)選為2 ii M。 所述PCR反應(yīng)體系優(yōu)選為10XPCR緩沖液2. 5iU， dNTP(2. 5mM)2ii1，MgCl2(25mM)2iil，上游引物(lOyM) :0. 5iU，下游引物(10iiM) :0. 5iU， rTaq酶(5U/ii 1) :0. 125 ii 1，模板DNA :1 ill (含1. OX 101 109拷貝)，染料1 y 1，加水補(bǔ)齊至終體積25ii 1。所述實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR反應(yīng)條件優(yōu)選為預(yù)變性94°C 3min ;擴(kuò)增95°C 30s，
52°C 30s，72。C 30s，共40個(gè)循環(huán)；72。C lOmin。 所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法可包括以下步驟 1)將SYTO為熒光染料加入上述PCR反應(yīng)體系中； 2)按上述反應(yīng)條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒。
本發(fā)明所提供實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，包括10XPCR緩沖液2. 5iU、dNTP(2. 5mM)2ii 1、 MgCl2 (25mM) 2 ii 1、 rTaq酶(5U/ii 1)0. 125 ii 1和熒光染料，所述熒光染料為SYTO熒光染料。 所述SYTO熒光染料優(yōu)選為SYT082 。
所述SYTO熒光染料的濃度優(yōu)選為2 ii M。 本發(fā)明提供了一種基于新型DNA結(jié)合染料的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。以SYT082為例，探討了 SYTO染料結(jié)合DNA的特性及其在定量PCR中應(yīng)用的可行性。結(jié)果顯示，SYTO家族的染料比SYBR Green I更適用于熒光染料實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，染料可以在一個(gè)很寬的濃度范圍內(nèi)使用，DNA熔解曲線不受DNA濃度影響。這是因?yàn)閘)SYTO染料的PCR抑制效應(yīng)小。2)比較不同濃度的染料對(duì)熔解曲線的影響，結(jié)果SG染料只有3個(gè)濃度下的擴(kuò)增產(chǎn)物有熔解曲線，而SYTO染料除了一個(gè)最低的濃度外，其余都能分析出熔解曲線。Tm值是分析擴(kuò)增產(chǎn)物特異性的一個(gè)關(guān)鍵步驟，SG的結(jié)果顯示，在不同染料濃度下，產(chǎn)物的Tm值有1度的差別，而SYTO染料則保持不變，說(shuō)明不同濃度的SYTO染料對(duì)Tm值沒(méi)有影響。另外，SG熔解曲線的寬度較SYTO的寬，說(shuō)明SYTO結(jié)合到DNA隨溫度變化明顯，特別是在產(chǎn)物解鏈的過(guò)程中，染料可迅速?gòu)碾p鏈中解離下來(lái)。3)選擇SG染料的濃度為0. 25 ii M， SYTO染料的濃度為2uM，在該條件下擴(kuò)增系列稀釋模板，PCR結(jié)果顯示，隨著模板量的減少，擴(kuò)增產(chǎn)物也減少，對(duì)應(yīng)的熒光值也降低，表明SYTO的熒光值能夠反映產(chǎn)物量的變化。從結(jié)果中我們觀察到，在產(chǎn)物量的變化相同的情況下，SYTO熒光值的變化較SG大，這可能是因?yàn)镾YTO結(jié)合DNA后熒光強(qiáng)度本身就要強(qiáng)一些，因此，相同的DNA變化程度將會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生更大的熒光值變化。從這一點(diǎn)可以推測(cè)，SYTO能夠更為準(zhǔn)確的對(duì)起始模板進(jìn)行定量。4)線性范圍是衡量定量PCR方法的一個(gè)指標(biāo)。通過(guò)對(duì)系列稀釋的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)合擴(kuò)增曲線和Ct值
4的變化，確定了 SG和SYTO的線性定量范圍，結(jié)果顯示，它們具有相同的定量范圍，即103 108拷貝，這與報(bào)道的其它熒光染料定量PCR的線性范圍一致。5)利用染料法定量PCR進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，需要通過(guò)最后的熔解曲線來(lái)鑒別多重PCR擴(kuò)增的效果。結(jié)果顯示通過(guò)熔解曲線的分析可以區(qū)分多個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，雖然SYTO染料也存在一定的偏性，但是這種偏性遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于SG。據(jù)此推測(cè)，利用SYTO染料進(jìn)行多重PCR將具有較好的效果。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法明顯優(yōu)于現(xiàn)有的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，具有對(duì)PCR反應(yīng)的抑制效應(yīng)小、可用濃度范圍大、序列結(jié)合偏性小、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)，適合大面積推廣和應(yīng)用。 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。


圖1為染料濃度對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的抑制效應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果 圖2為不同染料濃度下實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖 圖3為不同染料濃度擴(kuò)增下的實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物的熔解曲線 圖4為不同染料濃度擴(kuò)增下的實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度變化 圖5為不同DNA濃度對(duì)染料影響的檢測(cè)結(jié)果 圖6為低模板濃度時(shí)熒光值隨模板DNA量的變化 圖7為SG和S82的多重PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果 圖8為SG和S82的單重和多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。 實(shí)施例1、 SYTO染料結(jié)合DNA的特性及其在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中應(yīng)用的可行性檢 以SYT082(S82)染料為例，檢測(cè)SYTO染料結(jié)合DNA的特性及其在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中應(yīng)用的可行性，以熒光染料SYBR Green I (SG)為對(duì)照，具體實(shí)驗(yàn)方法如下
—、實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增
1、引物與質(zhì)粒 針對(duì)甲型H1N1流感特有的序列，人工合成一段序列(序列表中序列l(wèi))。根據(jù)該序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的引物，引物序列如下
上游引物CCCAAAGTGAGGGATCAAGA
下游引物CCAGCATTTCTTTCCATTGC 。 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到載體pMD-18T (購(gòu)自TaKaRa)上，作為陽(yáng)性質(zhì)粒。
2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增 目的基因的熒光定量PCR擴(kuò)增采用Bio-Rad IQ5熒光定量PCR儀。熒光染料分別采用SYBR Green I和SYT082 (均購(gòu)自Invitrogen公司)。PCR反應(yīng)體系(25 ii 1) : 10 X PCR緩沖液2. 5iU， dNTP(2. 5mM)2ii1， MgCl2 (25mM) 2 yl，上游引物(10iiM) :0. 5iU，下游引物(10iiM) :0. 5ii l，rTaq酶(5U/ii l，TAKARA) :0. 125 ii l，模板DNA(陽(yáng)性質(zhì)粒)ly l(含1. 0 X 101 109拷貝)，染料1 ii 1 (終濃度為20、 10、5、 1、0. 5、0. 25、0. 1、0. 05 ii M)，加水補(bǔ)齊至終體積25iU。反應(yīng)條件預(yù)變性94。C 3min;擴(kuò)增95。C 30s，52。C 30s，72。C 30s，共40個(gè)循環(huán)；72。C 10min。溶解曲線95。C lmin，55。C lmin，55。C 20s (溫度變化速率為0. 5°C /s)。 二、染料濃度對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的抑制效應(yīng) 染料濃度對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的抑制效應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果如圖1所示(A :SG， B :S82) ， SYBR Green I (SG)染料對(duì)PCR反應(yīng)具有很強(qiáng)的抑制效應(yīng)，因此其可用濃度范圍很小。為了分析SG和SYT082(S82)對(duì)PCR反應(yīng)的影B向，在反應(yīng)體系中加入了不同濃度(0.05到20iiM)的染料，觀察其對(duì)PCR結(jié)果的影響。從結(jié)果可以看出，SG只有在濃度為0.05、0. 1、0. 25 ii M時(shí)才有擴(kuò)增曲線，而S82在所有濃度下均顯示了較好的擴(kuò)增曲線。從擴(kuò)增曲線可以看出，兩種熒光染料均呈現(xiàn)隨染料濃度增加熒光值增加的趨勢(shì)。在相同染料濃度下，S82的熒光值大約是SG的6倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于SG。為進(jìn)一步確定染料濃度對(duì)PCR反應(yīng)的抑制效應(yīng)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行2X瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示(A :SG，B :S82，M :DNA marker,1-8 :20、10、5、1、0. 5、0. 25、0. 1、0. 05 y M)，從電泳圖可以看出，S82在所有濃度下均有擴(kuò)增產(chǎn)物，而SG只有能觀察到擴(kuò)增曲線(圖l)的那三個(gè)濃度才有擴(kuò)增產(chǎn)物。電泳結(jié)果顯示，這些染料濃度下的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的量幾乎沒(méi)有差異。上述檢測(cè)結(jié)果表明SYTO染料對(duì)PCR反應(yīng)基本上沒(méi)有抑制作用，SYTO家族的染料比SYBR Green I更適用于熒光染料實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。 四、不同染料濃度對(duì)熔解曲線的影響 對(duì)不同染料濃度擴(kuò)增下的PCR產(chǎn)物做熔解曲線，結(jié)果如圖3所示(A， B:SG;C， D:S82)，從圖3中可以看出，SG染料只有在最低的3個(gè)濃度下的擴(kuò)增產(chǎn)物才能觀察到熔解曲線，與擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)果一致(圖3A和圖3B)。相反，對(duì)于S82染料來(lái)說(shuō)，除最低一個(gè)濃度外，所有濃度下都可觀察到熔解曲線(圖3C和圖3D)。從熔解曲線上可以看出，SG在3個(gè)能夠擴(kuò)增的濃度下的Tm值分別為81. 5和82. 5， S82在大部分濃度下的Tm值為82. 0，只有最高濃度(20 ii M)時(shí)的Tm值發(fā)生了偏移，為82. 5。由于SG的使用濃度低于S82，因此說(shuō)明S82對(duì)產(chǎn)物Tm值的影響更小。從熔解曲線的寬度看，S82的溫度跨度為80 84，而SG的溫度跨度為79. 5 85. 0 (表1)。從溫度變化與熒光值的變化相關(guān)性看，S82隨溫度變化的強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于SG(圖4)。上述檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證明SYTO家族的染料比SYBR Green I更適用于熒光染料實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。 表1SG和S82不同濃度下熔解曲線的特性
6嫁度 Tm值 峰値 起始溫度 結(jié)束溫度 溫度跨度
(|iM)rc)rc)rc)rc)
S82-202082,54516,679,584.55.0
S82-101082.04293.776.084.08,0
S82-5582,02914.078,0歸6,0
S82-2282.01TO9.478.083.55,5
S 82-0,50,582.02肌478,584.05,5
S82-0.250,2582.0183.179,583.54.0
S82-0.10,182.047.979.583.54,0
S82-0,050,0582,010.981 ，583.01.5
SG-202062.046,755,063,08,0
SG-101059.078,056,079,523.5
SG-5556.5固56.080,024,0
SG-2255,562.455.076,521,5
SG-0.50.555.525 355,072.017,0
SG-0.250.2582.0220,479.085,56.5
SG-0,10,1§1.5126,179,585.56.0
SG-()-050.0581.561,779,084.05.0 五、檢測(cè)不同DNA濃度對(duì)染料的影響 為了分析DNA濃度對(duì)染料的影B向，選取兩種染料各自的最佳濃度。根據(jù)上面的 分析可以看出，SG在濃度為0. 25iiM時(shí)，擴(kuò)增效率高，熒光信號(hào)強(qiáng)，因此，SG的最佳濃度為 0. 25iiM。 S82在所有濃度下均有較高的擴(kuò)增效率，其熒光強(qiáng)度隨染料濃度增加。但是，在染 料濃度為2 ii M時(shí)，其熒光值從0. 5 ii M時(shí)的280. 4提高到1709. 4，是0. 5 y M時(shí)的6倍，盡管 繼續(xù)增加染料濃度熒光值還會(huì)增加，但考慮到染料的強(qiáng)度和濃度，2 M是一個(gè)較為合適的 濃度。然后，將模板系列稀釋(稀釋度依次為101 108拷貝)后分別以SG和S82最佳染 料濃度進(jìn)行擴(kuò)增，比較擴(kuò)增效果的差異，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件不變。 不同DNA濃度對(duì)染料影響的檢測(cè)結(jié)果如圖5所示(A， C， E :SG ;B， D， F :S82)，從圖 5中可以看出，SG和S82均能對(duì)系列稀釋模板進(jìn)行擴(kuò)增。從整體上看，隨著模板濃度的增 加，Ct值降低。熔解曲線分析結(jié)果顯示，兩個(gè)染料均顯示了單一的熔解曲線，表明擴(kuò)增都是 特異的(圖5A和D)。將熔解曲線進(jìn)行放大，結(jié)果顯示，SG的峰的寬度較S82大，并且不同 濃度模板擴(kuò)增得到的峰型差異較大，而S82的除了最高的模板濃度發(fā)生了峰型的偏移外， 其它的都相對(duì)較整齊(B和E)。從擴(kuò)增的熒光值可以看出(C和F)，相同濃度的模板在兩種 染料擴(kuò)增時(shí)，Ct值相差不大，但是隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，SG(C)的熒光值很快就達(dá)到了平臺(tái)，而 S82(F)則一直呈上升趨勢(shì)，沒(méi)有達(dá)到飽和，表明S82能夠結(jié)合的DNA濃度范圍更大。有趣的 是，如圖6所示(A:SG;B:S82)， SG在模板濃度較低時(shí)，沒(méi)有出現(xiàn)熒光值隨DNA量的增加而增加的趨勢(shì)，特別是在低濃度時(shí)，雖然也有一定的熒光值，但是基本沒(méi)有變化，相反，S82則
隨模板濃度的變化在變化。 六、線性擴(kuò)增范圍 線性擴(kuò)增范圍是定量PCR實(shí)用性的一個(gè)重要指標(biāo)，是指能夠檢測(cè)到標(biāo)本中病原的 濃度范圍。檢測(cè)方法為將模板進(jìn)行系列稀釋后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，通過(guò)分析擴(kuò)增 曲線和熔解曲線，決定SG和S82的線性范圍。線性擴(kuò)增范圍的選取為，曲線呈現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增， 并且具有隨著模板濃度降低，Ct值增大的趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SG和S82具有相同的線性 擴(kuò)增范圍，均為6個(gè)數(shù)量級(jí)，即103 108拷貝，在這個(gè)線性范圍內(nèi)能夠?qū)δ０錎NA進(jìn)行準(zhǔn)確 定量。低于上述線性范圍，則需要通過(guò)熔解曲線來(lái)觀察是否有擴(kuò)增產(chǎn)物，判定標(biāo)準(zhǔn)為，擴(kuò)增 產(chǎn)物的熔解曲線峰值高于二聚體的峰值。根據(jù)這個(gè)原則，這兩種染料擴(kuò)增的敏感性均能達(dá) 到1 10個(gè)拷貝。
七、多重PCR擴(kuò)增 有資料顯示，用SG染料進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，在進(jìn)行熔解曲線分析時(shí)容易引起染料 的再結(jié)合。為了分析S82在多重?cái)U(kuò)增方面的表現(xiàn)，分別用SG和S82進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增并結(jié) 合溶解曲線和凝膠電泳分析其擴(kuò)增差異。單重PCR反應(yīng)時(shí)，分別以A型流感(FluA，序列表 中序列2，擴(kuò)增引物序列為FluA的上游引物ATGGAGTGGCTAAAGACAAGAC，F(xiàn)luA的下游引物 AATGCTGATTCGGTGGTCAC)和B型流感(FluB，序列表中序列3，擴(kuò)增引物序列為FluB的上游 引物TGATACCTAGTGCGGCTACTC， FluB的下游引物TCAATGAAGAAGGAACGGCATC)為模板進(jìn)行 擴(kuò)增。反應(yīng)體系為:10XPCR緩沖液2. 5ii 1， dNTP(2. 5mM) 2 y 1， MgCl2 (25mM) 2 y l，上游引 物(lOiiM)O. 5ii l，下游引物(lOiiM)O. 5ii 1， rTaq酶(5U/ii 1)0. 125 ii 1，模板DNA(20ng/ y l)liil，染料(2iiM)liil，加水補(bǔ)齊至終體積25ii1。反應(yīng)條件為94。C 3min ;95。C 30s， 52。C 30s，72。C 30s，共40個(gè)循環(huán)；72。C 10min。雙重PCR反應(yīng)時(shí)，以FluA和FluB的混 合物為模板，反應(yīng)體系為:10XPCR緩沖液2. 5iU， dNTP(2. 5mM)2ii1， MgCl2 (25mM) 2 yl， FluA的上游引物(lOiiM)l. 25iU， FluA的下游引物(lOiiM)l. 25iU， FluB的上游引 物(10iiM)0. 5iU， FluB的下游引物(10iiM)0. 5iU， rTaq酶(5U/iU)0. 125 iU，模板 DNA(20ng/iU)A和B各liil，染料(2 y M) 1 iU，加水補(bǔ)齊至終體積25 yl。反應(yīng)條件不變。 結(jié)果如圖7(A，C，E :SG ;B，D，F(xiàn) :S82)和圖8(1， Marker ;2，3為SG單重PCR ;4， SG多重PCR ; 5， 6為S82單重PCR ;7， S82多重PCR)所示，從圖7中可以看出，單重?cái)U(kuò)增時(shí)兩個(gè)產(chǎn)物的熔解 曲線均較好，能夠觀察到兩個(gè)產(chǎn)物的Tm值差異，形成兩個(gè)獨(dú)立的峰，且峰值相近(A和B)。但 是，當(dāng)在同一個(gè)反應(yīng)體系中擴(kuò)增兩個(gè)產(chǎn)物時(shí)，則出現(xiàn)了熔解曲線的差異。用SG作為染料時(shí)， 雖然也形成兩個(gè)峰，但是溫度低的峰顯著低于溫度高的峰(C);相反，以S82作為染料時(shí)，熔 解曲線形成兩個(gè)獨(dú)立的峰圖，兩個(gè)峰雖然有差異，但這種差異遠(yuǎn)小于SG組，說(shuō)明S82也存在 一定的偏性，但其偏性遠(yuǎn)小于SG組。 在上述實(shí)施例中，分析了一類新型的熒光染料SYTO應(yīng)用于實(shí)時(shí)定量PCR的可行 性，并與傳統(tǒng)的熒光染料SYBR Green I進(jìn)行了比較。以SYT082為例，通過(guò)熒光染料對(duì)PCR 反應(yīng)的抑制效應(yīng)，染料濃度對(duì)熔解曲線的影響等的分析得出結(jié)論，SYTO家族的染料比SYBR Green I更適用于熒光染料實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。 SG染料的一個(gè)嚴(yán)重缺點(diǎn)是可使用的濃度范圍低，因此，在利用該染料建立定量 PCR方法時(shí)，往往需要對(duì)染料的濃度進(jìn)行摸索和優(yōu)化。此外，由于該染料穩(wěn)定性的原因，使用中往往因?yàn)槿玖戏纸舛鴮?dǎo)致檢測(cè)信號(hào)的變化，從而影響定量PCR的定量特性。因此，在本 研究中，首先分析了 SYT0染料對(duì)PCR反應(yīng)的抑制效應(yīng)。將反應(yīng)中染料的濃度調(diào)整為0. 05 到20uM的范圍，濃度相差了 400倍，結(jié)果顯示，這些不同濃度的染料加入到反應(yīng)體系中，并 沒(méi)有抑制PCR反應(yīng)。電泳結(jié)果顯示，這些染料濃度下的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的量幾乎沒(méi)有差異，表 明SYTO染料對(duì)PCR基本上沒(méi)有抑制作用。SYTO的PCR抑制效應(yīng)小，對(duì)于該染料用于定量 PCR方法的建立具有一個(gè)很大的優(yōu)勢(shì)，即不需要花時(shí)間摸索染料的使用濃度，只需要選擇其 中一個(gè)合適的濃度即可。相對(duì)于SG來(lái)說(shuō)，SYTO的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，相同濃度下SYTO結(jié)合DNA 后的熒光值較SG高，這種結(jié)合DNA后熒光值增強(qiáng)是染料是否適合于定量PCR分析的一個(gè)要 求。 然后，本發(fā)明比較了不同濃度的染料對(duì)熔解曲線的影B向，SG染料只有3個(gè)濃度下 的擴(kuò)增產(chǎn)物有熔解曲線，而SYTO染料除了一個(gè)最低的濃度外，其余都能分析出熔解曲線。 Tm值是分析擴(kuò)增產(chǎn)物特異性的一個(gè)關(guān)鍵步驟，SG的結(jié)果顯示，在不同染料濃度下，產(chǎn)物的 Tm值有1度的差別，而SYTO染料則保持不變，說(shuō)明不同濃度的SYTO染料對(duì)Tm值沒(méi)有影響。 另外，SG熔解曲線的寬度較SYTO的寬，說(shuō)明SYTO結(jié)合到DNA隨溫度變化明顯，特別是在產(chǎn) 物解鏈的過(guò)程中，染料可迅速?gòu)碾p鏈中解離下來(lái)。這種雙鏈DNA結(jié)合的特性，有利于熔解曲 線的分析，以及多重?cái)U(kuò)增時(shí)不同產(chǎn)物的解析，這在后面的多重PCR分析中也得到了證實(shí)。
要對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量，所用的染料必須要隨產(chǎn)物的量的增加熒光強(qiáng)度也增加。為了 比較分析SYTO染料這種特性，選擇了 SG染料的濃度為0. 25uM，SYT0染料的濃度為2uM，在 該條件下擴(kuò)增系列稀釋模板，PCR結(jié)果顯示，隨著模板量的減少，擴(kuò)增產(chǎn)物也減少，對(duì)應(yīng)的熒 光值也降低，表明SYTO的熒光值能夠反映產(chǎn)物量的變化。從結(jié)果中我們觀察到，在產(chǎn)物量 的變化相同的情況下，SYTO熒光值的變化較SG大，這可能是因?yàn)镾YTO結(jié)合DNA后熒光強(qiáng) 度本身就要強(qiáng)一些，因此，相同的DNA變化程度將會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生更大的熒光值變化。從這一點(diǎn) 可以推測(cè)，SYTO能夠更為準(zhǔn)確的對(duì)起始模板進(jìn)行定量。 線性范圍是衡量定量PCR方法的一個(gè)指標(biāo)。通過(guò)對(duì)系列稀釋的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 結(jié)合擴(kuò)增曲線和Ct值的變化，確定了SG和SYTO的線性定量范圍，結(jié)果顯示，它們具有相同 的定量范圍，即103 108拷貝，這與報(bào)道的其它熒光染料定量PCR的線性范圍一致。
利用染料法定量PCR進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，需要通過(guò)最后的熔解曲線來(lái)鑒別多重PCR 擴(kuò)增的效果。過(guò)去的研究發(fā)現(xiàn)，以SG作為染料進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，在做熔解曲線時(shí)會(huì)發(fā)生染 料結(jié)合偏移的情況，即染料從Tm值低的產(chǎn)物上解離下來(lái)之后，會(huì)再結(jié)合到Tm值高的產(chǎn)物， 導(dǎo)致Tm值高的產(chǎn)物的峰值很高，而Tm值低的很低，這樣，就無(wú)法準(zhǔn)確得知兩個(gè)產(chǎn)物的量的 多少，甚至是有和無(wú)的判斷。從本實(shí)施例的比較結(jié)果看，SYTO染料也存在一定的偏性，但是 這種偏性遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于SG。據(jù)此推測(cè)，利用SYTO染料進(jìn)行多重PCR將具有較好的效果。
實(shí)施例2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的制備 將10 X PCR緩沖液2. 5 ii 1 、 dNTP (2. 5mM) 2 ii 1 、 MgCl2 (25mM) 2 ii 1 、 rTaq酶(5U/ iil)O. 125iU、SYT082染料(2 y M) 1 共同包裝，得到實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒。使
用時(shí)用戶根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加入引物及模板即可。
序列表
〈160>3
〈210>1
9
〈211>134〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>1CCC3朋gtg3gggatc朋gaaactettectggacactegt卿gCCggg360gac朋朋teacattcgaagcctegtggteccgagatetgcattcgcaatg120g朋3ga朋tgctgg134〈210>2〈211>463〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>2C3g3g3Cttgaagatgtctttgctgg腿gaacaccgatcttgaggctctcatggagtgg60cte朋gac朋gaccgatcctgtcacctctg3cteaggggatttteggatttgtgttcacg120ctcaccgtgcccagtgagcg3gg3CtgC3gcgtegacgctttgtccaaaatgccctteat180ggg朋tggggtetggac3gagcagtte皿ctgtetcga皿gctte卿gg240gagateacattccatggggcgcactcagttattctgctggtgcacttgcc300agttgtetgggactcateteC皿C3gg3tgggggctgtgaccaccgaatcagcatttggc360ctgatetgcgcaacctgtgaacagattgccgactcccagcateagtctcateggca朋tg420gteac朋c朋ccaatccatttgg463〈210>3〈211>396〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>3tccatecatgtctcttcatcttttgcatte3g朋g3ttgC60agtccatcccacaagtettctttgtttccaatgtttttgatecctegtgcggctectccc120agcacggtegategcatettaaacattcccatcatcatccC3ggCg3C朋agatgccgtt180ccttcttcattg皿g皿tggtttcagctttttteattttgcccttgtttcttcattetet240ctttcteatggtetgcte皿caaggtetttgtgccttcagtctttttgtt300ttecttgttetcateaatccttttcccaatctggctettttettggag朋C朋g3CCggt360gctetectecgggctg39權(quán)利要求
一種基于新型DNA結(jié)合染料的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，是以SYTO為熒光染料進(jìn)行的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR檢測(cè)方法，其特征在于所述SYTO熒光染料為SYT082。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR檢測(cè)方法，其特征在于所述SYTO熒光染料的濃度為 2iiM。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR檢測(cè)方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)體系為IOXPCR 緩沖液2. 5iU， dNTP(2. 5mM)2ii1， MgCl2 (25mM) 2 yl，上游引物(10 y M) 0. 5 yl，下游引物 (10iiM)0. 5ii l，rTaq酶(5U/ii 1)0. 125 ii l，模板DNA(含1. 0X101 109拷貝)1 ii l，染料 1 iil ，加水補(bǔ)齊至終體積25 iil 。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的PCR檢測(cè)方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)條件 為預(yù)變性94。C 3min ;擴(kuò)增95°C 30s，52。C 30s，72。C 30s，共40個(gè)循環(huán)；72。C 10min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的PCR檢測(cè)方法，其特征在于所述檢測(cè)方法包括以下步驟1) 將SYTO為熒光染料加入權(quán)利要求4所述的PCR反應(yīng)體系中；2) 按權(quán)利要求5所述的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。
7. —種實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，包括10XPCR緩沖液2. 5iU、 dNTP(2. 5mM)2ii 1、 MgCl2 (25mM) 2 ii 1、rTaq酶(5U/ii 1)0. 125 ii 1和熒光染料，其特征在于， 所述熒光染料為SYTO熒光染料。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述SYTO熒光染料為SYT082。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于所述SYT0熒光染料的濃度為2iiM。
10. SYTO熒光染料作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)熒光染料的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于新型DNA結(jié)合染料的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法及其應(yīng)用。該方法是以SYTO為熒光染料進(jìn)行的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SYTO家族的染料比SYBR Green I更適用于熒光染料實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，染料可以在一個(gè)很寬的濃度范圍內(nèi)使用，DNA熔解曲線不受DNA濃度影響。表明本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法明顯優(yōu)于現(xiàn)有的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，具有對(duì)PCR反應(yīng)的抑制效應(yīng)小、可用濃度范圍大、序列結(jié)合偏性小、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)，適合大面積推廣和應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101696451SQ20091023649
公開日2010年4月21日 申請(qǐng)日期2009年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月23日
發(fā)明者孫巖松, 徐杰, 杜昕穎, 汪舟佳, 王玉飛, 鐘志軍, 陳澤良, 黃留玉 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍疾病預(yù)防控制所;