專利名稱：：一種輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤的試劑盒。
背景技術(shù)：
：多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma,MM)是漿細胞的惡性腫瘤，其特征為骨髓中異常漿細胞惡性增殖，血清或尿中出現(xiàn)過量單克隆免疫球蛋白(IgG，IgA，IgD或IgE)或BenceJones本周蛋白質(zhì)(游離的單克隆性k或Y輕鏈)，常伴有多發(fā)性溶骨性損害，高鈣血癥，貧血，腎臟損害，易引起肺部、泌尿系感染。在我國多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病率占血液系統(tǒng)腫瘤的第二位，中位生存期為35年。目前，多發(fā)性骨髓瘤的治療主要包括常規(guī)化療、干細胞移植以及新型藥物治療，如免疫調(diào)節(jié)藥物、蛋白酶體抑制劑等的應(yīng)用，雖然可以使病情得到有效控制，但很少有患者能夠取得完全緩解甚至治愈。越來越多的證據(jù)表明多發(fā)性骨髓瘤細胞的基因異質(zhì)性很大程度上決定了不同的臨床后果?，F(xiàn)在多發(fā)性骨髓瘤的診斷已經(jīng)從單純細胞形態(tài)學診斷演變?yōu)榧毎飳W和臨床醫(yī)學結(jié)合的綜合診斷模式。常規(guī)診斷技術(shù)有各種電泳、免疫組化、流式細胞術(shù)、PCR檢測免疫球蛋白重鏈或輕鏈基因的克隆性重排等，但一直以來，缺乏多發(fā)性骨髓瘤特異的診斷、預(yù)后分子標記和治療監(jiān)測的分子靶標，使對治療多發(fā)性骨髓瘤的療效難以作出更科學的評估。癌睪丸抗原(Cancertestisantigen,CT抗原)是一種免疫原性蛋白質(zhì)，在過去15年間已鑒定了40多個家族，基于其在腫瘤患者中的特異性表達和免疫原性，CT抗原已被認為是有應(yīng)用前景的人類惡性腫瘤免疫治療的靶標，并有可能成為重要的診斷和預(yù)后標志。新近的研究發(fā)現(xiàn)匪患者中高頻率表達CT抗原，且可誘導抗體介導和T細胞介導的免疫反應(yīng)。異基因干細胞移植的治療效果一部分是由供者來源的T細胞顯示的免疫效應(yīng)的結(jié)果，針對CT抗原的免疫反應(yīng)，提示CT抗原可能是供者來源同種異體免疫甚至是自發(fā)抗骨髓瘤免疫應(yīng)答的天然靶標。骨髓殘留惡性漿細胞的匪患者明顯持續(xù)表達CT抗原，所以CT抗原是針對微小殘留病的有潛力的標志，還可以用于靶向治療后殘存于患者骨髓中的骨髓瘤細胞。通過檢測骨髓漿細胞的數(shù)量和外周血異常蛋白水平，已發(fā)現(xiàn)CT抗原表達水平和骨髓瘤患者的臨床病程間有強相關(guān)性，CT抗原可能不僅是獨立的腫瘤標志，而且是早期復發(fā)和生存率顯著下降的重要指標。MAGECl/CT7(黑色素瘤抗原-Cl/癌睪丸抗原7)是匪中最常見的一種CT抗原表達，檢測陽性率可達65%82%，在腫瘤細胞中高表達，在正常細胞中不表達，MAGEC1/CT7的腫瘤特異性的高頻率且持續(xù)的表達，使其最有可能成為有效的匪診斷、預(yù)后、療效監(jiān)測指標及免疫治療靶標。目前，國際上已報道的用于檢測MAGEC1/CT7表達的方法主要為定性PCR和免疫組織化學方法，這些方法普遍存在靈敏度低、特異性不高、費時費力等缺點，使應(yīng)用受到一定限制。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤的試劑盒。本發(fā)明提供的輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤的試劑盒，包括針對MAGEC1/CT7基因的特異性引物對甲和探針甲；所述特異性引物對甲為序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列組成的引物對；所述探針甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。所述試劑盒還可包括陽性質(zhì)粒；所述陽性質(zhì)粒為含有MAGEC1/CT7基因或其片段的重組質(zhì)粒。所述陽性質(zhì)?？蔀楹行蛄?所示的MAGEC1/CT7基因片段的重組質(zhì)粒。所述陽性質(zhì)粒具體可為將pMD18-T載體與序列表的序列7所示的MAGEC1/CT7基因片段連接得到的重組質(zhì)粒。所述試劑盒可還包括針對內(nèi)參基因的特異性引物對乙和探針乙；所述內(nèi)參基因為ABL基因。所述特異性引物對乙具體可為序列表的序列4和序列表的序列5所示核苷酸序列組成的引物對；所述探針乙的核苷酸序列具體可如序列表的序列6所示。所述試劑盒還可包括內(nèi)參質(zhì)粒；所述內(nèi)參質(zhì)粒為含有ABL基因或其片段的重組質(zhì)粒。所述內(nèi)參質(zhì)?？蔀楹行蛄?所示的ABL基因片段的重組質(zhì)粒。所述內(nèi)參質(zhì)粒具體可為將pMD18-T載體與序列表的序列8所示的ABL基因片段連接得到的重組質(zhì)粒。本發(fā)明還保護針對MAGEC1/CT7基因的特異性引物對甲和探針甲在制備輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤的試劑盒中的應(yīng)用；所述特異性引物對甲為序列表的序列l(wèi)和序列表的序列2所示核苷酸序列組成的引物對；所述探針甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。在多發(fā)性骨髓瘤患者的骨髓或外周血中，MAGEC1/CT7基因表達，而在正常人的骨髓或外周血中，MAGEC1/CT7基因不表達。且處于不同ISS期的多發(fā)性骨髓瘤患者的骨髓或外周血中，MAGEC1/CT7基因的表達水平具有差異性。本發(fā)明的試劑盒，不僅可以應(yīng)用于定性診斷多發(fā)性骨髓瘤，還可以通過內(nèi)參基因，測定患者MAGEC1/CT7基因的表達水平。本發(fā)明為多發(fā)性骨髓瘤的診斷提供了一條快速、可靠、準確的新途徑，為療效觀察、微小殘留病的動態(tài)觀察提供依據(jù)。本發(fā)明將在醫(yī)學檢測領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。圖1為實施例3中陽性對照質(zhì)粒靈敏度檢測的RQ-PCR熒光曲線。圖2為實施例5中陽性對照質(zhì)粒RQ-PCR擴增的標準曲線；顯示Ct值和陽性對照質(zhì)粒不同稀釋度的樣本間呈線性相關(guān)(相關(guān)系數(shù)>0.99)。圖3為實施例5中內(nèi)參對照質(zhì)粒的RQ-PCR擴增的標準曲線；顯示Ct值和內(nèi)參對照質(zhì)粒不同稀釋度的樣本間呈線性相關(guān)(相關(guān)系數(shù)>0.99)。圖4為實施例6中，25位患者的骨髓中漿細胞數(shù)占骨髓有核細胞的百分比和MAGEC1/CT7基因表達水平的關(guān)系。圖5為實施例6中，31位患者的骨髓中0038+/00138+細胞占骨髓有核細胞的百分比和MAGEC1/CT7基因表達水平的關(guān)系。圖6為實施例6中，將31位患者的骨髓中CD38+/CD138+細胞占骨髓有核細胞的百分比按<1%(1組，n=9)、1%-10%(2組，n=14)、>10%(3組，n=8)分為三組時，各組MAGEC1/CT7基因表達水平。具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。實施例1、特異性引物對和探針的設(shè)計針對MAGEC1/CT7基因的特異性引物對甲(擴增產(chǎn)物為79bp)和探針甲上游引物MAG-FP:5'-TTGTCTTCTGGGAACCTTGACTC-3';下游引物MAG-RP:5'-TGAGGGACACATACATCCTAAAAGC-3';探針MAG-T-probe:FAM-ACTGCCTGGGCCTCCTCTGCTGT-BHQ(5'-3，)。針對ABL基因(內(nèi)參基因)的特異性引物對乙和探針乙上游引物ENF1003:5'-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3';下游引物ENR1063:5'-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3，；探針ENPrl043:FAM-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-TAMRA(5，-3，)。針對ABL基因的特異性引物對乙和探針乙按參考文獻合成(GabertJ，BeillardE，vanderVeldenVH，etal.Standardizationandqualitycontrolstudiesof'real-time'quantitativereversetranscriptasepolymerasechainreactionoffusiongenetranscriptsforresidualdiseasedetectioninleukemia—aEuropeAgainstCancerprogram.Leukemia.2003，17:2318-57.)實施例2、相關(guān)質(zhì)粒的制備—、陽性對照質(zhì)粒(含有MAGEC1/CT7基因片段的質(zhì)粒)的制備以MAGEC1/CT7基因表達陽性的多發(fā)性骨髓瘤患者(志愿者)的骨髓的cDNA為模板，進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表的序列7(632bp)所示，擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后，克隆入pMD18-T質(zhì)粒(pMD18-T載體系統(tǒng)，上海皓嘉公司，產(chǎn)品目錄號D101A)，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a(天根生化公司，產(chǎn)品目錄號CD101-02)感受態(tài)，篩選陽性克隆提取質(zhì)粒并純化后進行測序，結(jié)果表明得到了陽性對照質(zhì)粒(骨架質(zhì)粒為pMD18-T質(zhì)粒，在EC0RV位點插入序列7所示cDNA)。PCR擴增所用的引物對如下CT7FP:5'-ACATCCTCACCCTCAGGAGGG-3';CT7RP:5'-GACGAGGATCGTCTCAGGTCAGC-3，。二、內(nèi)參對照質(zhì)粒(含有ABL基因片段的質(zhì)粒)的制備以K562細胞系(上海坤肯生物化工有限公司；中國細胞庫典藏細胞中心細胞目錄QK10269)的cDNA為模板，進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表的序列8所示，擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后，克隆入pMD18-T質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，篩選陽性克隆提取質(zhì)粒并純化后進行測序，結(jié)果表明得到了內(nèi)參對照質(zhì)粒(骨架質(zhì)粒為pMD18-T質(zhì)粒，在EC0RV位點插入序列8所示cDNA)。PCR擴增所用的引物對如下ABL-FP:5'-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3';ABL-RP:5'-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3，。三、陰性對照質(zhì)粒pMD18-T質(zhì)粒?！⒃噭┖械慕M裝試劑盒由如下組件組成實施例1制備的針對MAGEC1/CT7基因的特異性引物對甲和探針甲；實施例2制備的陽性對照質(zhì)粒。二、試劑盒的靈敏度檢測對6位MAGEC1/CT7陽性的多發(fā)性骨髓瘤患者(志愿者)cDNA標本及陽性對照質(zhì)粒進行MAGECl/CT7基因的檢測，患者cDNA標本分別進行IO倍梯度稀釋至10—5，陽性對照質(zhì)粒10倍梯度稀釋為分別含有105、104、103、102、101、10°個拷貝的MAGEC1/CT7基因片段(通過測定吸光度值計算陽性對照質(zhì)粒中MAGEC1/CT7基因片段的拷貝數(shù))。方法如下1、RNA提取用TRIzol試劑盒(購自美國Invitrogen公司)并參照試劑盒說明書在無菌條件下提取各個患者的骨髓標本(北京大學人民醫(yī)院)的RNA(或外周血標本的RNA也可)，方法為用EDTA抗凝，用淋巴細胞分層液(相對密度1.077g/L，上海華精高科技有限公司)分離出單個核細胞，將分離出的單個核細胞用生理鹽水洗滌2次后，加入1000illTRIzol試劑，用加樣槍反復吹打，使細胞破碎，按照TRIzol試劑盒說明進行RNA提取。提取的RNA晾干后，加入適量DEPC處理的去離子水溶解RNA，在DNA/RNA紫外分光光度計上測RNA濃度及純度，結(jié)果A260/A280>1.8，表明所提取的RNA純度較高。2、cDNA合成逆轉(zhuǎn)錄(RT)公共體系(20iiL):5XRT緩沖液4iiL0.1MDTT2iiLd證s(10mM，Promega公司)1iiL隨機六聚體引物(0.1iig/iil，Invitrogen公司)1iiL匪LV逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/iiL，Invitrogen公司)1iiLRNaseOUTRNase抑制劑(40U/iiL，Invitrogen公司)1iiL每19iiLRT公共體系分裝1管，每管加入RNA1yg(RNA首先65°C5min，冰浴5min)。37t:反應(yīng)65min，95t:5min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，4"C保存?zhèn)溆谩?、對6位MAGEC1/CT7陽性的多發(fā)性骨髓瘤患者cDNA標本及陽性對照質(zhì)粒進行靈敏度檢測步驟2得到的每個樣本進行10倍梯度稀釋，在熒光實時定量PCR儀(美國ABI公司7500-FAST型)上進行RQ-PCR。PCR反應(yīng)體系(lOiU):序列1所示的上游引物0.4iiM，序列2所示的下游引物0.4iiM，序列3所示的TaqMan探針0.2iiM，2XTaqMan通用PCR公共體系5ii1(ABI公司，美國)，cDNA(或質(zhì)粒)liil;其余為去離子水。PCR反應(yīng)條件50。C2min，1個循環(huán)；95°C10min，1個循環(huán)；95。C15s，60。Clmin，40個循環(huán)。分析每批RQ-PCR結(jié)果時閾值均固定為0.2。陽性對照質(zhì)粒1()S、l(^、l(f、l(f、l(^、l(^個拷貝的RQ-PCR熒光曲線見圖l，檢測MAGEC1/CT7基因片段的靈敏度可達10°個拷貝(即1個拷貝)。6位MAGEC1/CT7陽性的多發(fā)性骨髓瘤患者cDNA標本10倍系列稀釋的擴增曲線特征見表1。表1多發(fā)性骨髓瘤患者cDNA標本10倍系列稀釋的擴增曲線特征<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結(jié)果表明，應(yīng)用本發(fā)明提供的針對MAGEC1/CT7基因的特異性引物對甲和探針甲通過RQ-PCR檢測6例MAGEC1/CT7基因陽性的多發(fā)性骨髓瘤患者，靈敏度可達10—4或10—5稀釋度。實施例4、試劑盒的應(yīng)用—、試劑盒的組裝試劑盒由如下組件組成實施例1制備的針對MAGEC1/CT7基因的特異性引物對甲和探針甲；實施例2制備的陽性對照質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒。二、試劑盒的應(yīng)用檢測125位多發(fā)性骨髓瘤患者(其中51位為未治或復發(fā)的多發(fā)性骨髓瘤患者)、22例正常供者(志愿者)的骨髓中MAGEC1/CT7基因的表達情況，方法如下1、RNA提取同實施例3的步驟二的1。2、cDNA合成同實施例3的步驟二的2。3、待測樣本的檢測步驟2得到的每個樣本在熒光實時定量PCR儀(美國ABI公司7500-FAST型)上進行RQ-PCR。每批RQ-PCR實驗均設(shè)置陽性對照(用等體積的10倍梯度稀釋的陽性對照質(zhì)粒代替樣本)、陰性對照(用等體積的陰性對照質(zhì)粒代替樣本)和無模板空白對照(用等體積的&0代替樣本)。PCR反應(yīng)體系(lOiU):序列l(wèi)所示的上游引物0.4iiM，序列2所示的下游引物0.4線序歹lj3所示的TaqMan探針0.2iiM，2XTaqMan通用PCR公共體系5ii1(ABI公司，美國)，cDNA(或質(zhì)粒)1ill;其余為去離子水。PCR反應(yīng)條件5(TC2min，1個循環(huán)；95°C10min，l個循環(huán)；95。C15s，60。Clmin，40個循環(huán)。分析每批RQ-PCR結(jié)果時閾值均固定為0.2。定性檢測的結(jié)果見表2。表2實時定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測匪患者中MAGEC1/CT7基因表達陽性率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>結(jié)果表明，本發(fā)明的試劑盒可以用于多發(fā)性骨髓瘤的檢測。對于多發(fā)性骨髓瘤患者中檢測結(jié)果為陰性的樣本，可能是由于該患者的骨髓中存在其它相關(guān)基因的表達，而不存在MAGEC1/CT7基因的表達。實施例5、MAGEC1/CT7的表達量與多發(fā)性骨髓瘤ISS分期的相關(guān)性—、試劑盒的組裝試劑盒由如下組件組成實施例1制備的針對MAGEC1/CT7基因的特異性引物對甲和探針甲；實施例1制備的針對ABL基因的特異性引物對乙和探針乙；實施例2制備的陽性對照質(zhì)粒、陰性對照質(zhì)粒和內(nèi)參對照質(zhì)粒。二、試劑盒的應(yīng)用檢測處于不同ISS分期的多發(fā)性骨髓瘤患者(志愿者)中MAGEC1/CT7的表達量，方法如下1、RNA提取同實施例3的步驟二的1。2、cDNA合成同實施例3的步驟二的2。3、待測樣本的檢測步驟2得到的每個樣本在熒光實時定量PCR儀(美國ABI公司7500-FAST型)上進行RQ-PCR。陽性對照、陰性對照和空白對照的設(shè)置陽性對照(用等體積的IO倍梯度稀釋的陽性對照質(zhì)粒代替樣本；分別含有1()S、10^1(f、l(f、l(^、l(^個拷貝的MAGECl/CT7基因片段)、陰性對照(用等體積的陰性對照質(zhì)粒代替樣本)和無模板空白對照(用等體積的叫代替樣本)。PCR反應(yīng)體系(lOiU):序列l(wèi)所示的上游引物0.4iiM，序列2所示的下游引物0.4iiM，序列3所示的TaqMan探針0.2iiM，2XTaqMan通用PCR公共體系5ii1(ABI公司，美國)，cDNA(或質(zhì)粒)1iil;其余為去離子水。PCR反應(yīng)條件5(TC2min，1個循環(huán)；95°ClOmin，l個循環(huán)；95。C15s，60。Clmin，40個循環(huán)。內(nèi)參對照的設(shè)置用等體積的10倍梯度稀釋的內(nèi)參對照質(zhì)粒代替樣本；分別含有106、105、1()4、103、102、1(^個拷貝的ABL基因片段；PCR反應(yīng)體系(lOiU):序列4所示的上游引物O.3iiM，序列5所示的下游引物0.3iiM，序列6所示的TaqMan探針0.2iiM，2XTaqMan通用PCR公共體系5ii1(ABI公司，美國)，cDNA(或質(zhì)粒)1;其余為去離子水。PCR反應(yīng)條件50。C2min，1個循環(huán)；95。C10min，1個循環(huán)；95。C15s，60。Clmin，40個循環(huán)。分析每批RQ-PCR結(jié)果時，MAGEC1/CT7閾值均固定為0.2，ABL閾值均固定為0.08。陽性對照質(zhì)粒RQ-PCR擴增的標準曲線見圖2，標準曲線方程為1ogMAGECl/CT7=(Ct-31.232)/-3.281(r=0.995)。內(nèi)參對照質(zhì)粒RQ-PCR擴增的標準曲線見圖3，標準曲線方程為logABL=(Ct-38.465)/-3.221(r=0.998)。SDS軟件利用標本的CT值，根據(jù)標準曲線分別計算出各份標本ABL及目的基因MAGEC1/CT7的拷貝數(shù)。MAGEC1/CT7基因mRNA水平(％)=MAGEC1/CT7基因拷貝數(shù)X100%ABL基因拷貝數(shù)結(jié)果表明，MAGEC1/CT7表達量與ISS分期相關(guān)，MAGEC1/CT7表達量隨ISS分期而增加，見表3。表3ISS分期和MAGEC1/CT7基因表達水平間的關(guān)系iss分期樣本數(shù)均數(shù)±標準差1277±95213677±1484392327±2329實施例6、MAGEC1/CT7的表達量與骨髓漿細胞、CD38+/CD138+細胞數(shù)的相關(guān)性—、試劑盒的組裝試劑盒由如下組件組成實施例1制備的針對MAGEC1/CT7基因的特異性引物對甲和探針甲；實施例1制備的針對ABL基因的特異性引物對乙和探針乙；實施例2制備的陽性對照質(zhì)粒、陰性對照質(zhì)粒和內(nèi)參對照質(zhì)粒。二、MAGEC1/CT7基因表達量和骨髓槳細胞數(shù)的相關(guān)性檢測25位多發(fā)性骨髓瘤患者(志愿者)中MAGEC1/CT7的表達量，方法如下1、RNA提取同實施例3的步驟二的1。2、cDNA合成同實施例3的步驟二的2。3、待測樣本的檢測同實施例5的步驟二的3。同時，通過顯微鏡對骨髓樣本涂片進行形態(tài)學檢查，檢測該25位患者的骨髓中槳細胞的數(shù)量。25位患者的骨髓中漿細胞占骨髓有核細胞的數(shù)量百分比和MAGEC1/CT7基因mRNA水平，見圖4。由圖4可見，MAGEC1/CT7表達量與漿細胞數(shù)正相關(guān)(r=0.435，P<0.05)。9三、MAGEC1/CT7基因表達量和CD38+/CD138+細胞數(shù)的相關(guān)性檢測31位多發(fā)性骨髓瘤患者(志愿者)中MAGEC1/CT7的表達量，方法如下1、RNA提取同實施例3的步驟二的1。2、cDNA合成同實施例3的步驟二的2。3、待測樣本的檢測同實施例5的步驟二的3。同時，應(yīng)用流式細胞儀，檢測該31位患者的骨髓中0038+/00138+細胞的數(shù)量。31位患者的骨髓中0038+/00138+細胞占骨髓有核細胞的數(shù)量百分比和區(qū)6￡(:1/07基因111尺脆水平，見圖5。由圖5可見，MAGEC1/CT7表達水平和CD38+/CD138+陽性細胞百分比呈正相關(guān)(r=0.41，P<0.05)。根據(jù)以上檢測結(jié)果，將31位患者的骨髓中0038+/00138+細胞占骨髓有核細胞的百分比按<1%(1組，n=9)、1%-10%(2組，n二14)、>10%(3組，n=8)分為三組，各組區(qū)6￡(:1/07基因表達水平見圖6，隨著序列表0127]〈110〉北京大學人民醫(yī)院0128]〈120〉一種輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤的試劑盒0129]〈130〉CGGNARY926360130]〈160>80131]〈210>10132]〈211>230133]〈212>DNA0134]〈213〉人工序列0135]〈220〉0136]〈223〉0137]〈400>10138]ttgtcttctgggaaccttgaetc0139]〈210>20140]〈211>250141]〈212>DNA0142]〈213〉人工序列0143]〈220〉0144]〈223〉0145]〈400>20146]tg3gggacac3tecatccte3朋gc0147]〈210>310〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>3actgcctgggcctcctctgctgt23〈210>4<211>31〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<223>〈400>4tggagateac3ctct朋gc3teacte朋ggt31〈210>5〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>5gatgtegttgcttgggaccca21〈210>6〈211>28<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉<400>6ccatttttggtttgggcttcacaccatt28〈210>7〈211>632〈212>DNA〈213〉人屬人(Homosapiens)〈400>7gacgaggatcgtctcaggtcagcggagggaggagacttatagacctatccagtcttcaag60gtgctccagaaagcaggagttgaagacctgggtgtgagggacacatacat120ccacagcagaggaggcccaggcagtgccaggagtcaaggttcccagaagaC333CCCCCt1803gg朋g3C3ggcgacctgtgaggccctegagC3CC3CCtt朋g3g朋g朋g3gCtgt朋g240ccggcctttgtcagagccatratgggggacaaggatatgcctactgctgggatgccgagt300cttctccagagttcctctgagagtcctcagagttgtcctgagggggaggactcccagtct360cctctccagattccccagagttctcctgagagcgacgacaccctgtatcctctccagagt420cctcagagtcgttctgagggggaggactcctcggatcctctccagagacctcctgagggg■aaggactcccagtctcctctccagattccccagagttctcctgagggcgacgacacccag540tctcctctccagaattctcagagttctcctgaggggaaggactccctgtctcctctagag600atttctcagagccctcctgagggtg郷atgt632〈210>8〈211>124〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>8tggagateacactctaagcatgaaaagctccgggtcttaggctataatca60c朋tgggg朋tggtgtgaagaaatggccaaggctgggtccc朋gc朋cte120catc權(quán)利要求一種輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤的試劑盒，包括針對MAGEC1/CT7基因的特異性引物對甲和探針甲；所述特異性引物對甲為序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列組成的引物對；所述探針甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。2.如權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括陽性質(zhì)粒；所述陽性質(zhì)粒為含有MAGEC1/CT7基因或其片段的重組質(zhì)粒。3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述陽性質(zhì)粒為含有序列7所示的MAGEC1/CT7基因片段的重組質(zhì)粒。4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述陽性質(zhì)粒為將pMD18-T載體與序列表的序列7所示的MAGEC1/CT7基因片段連接得到的重組質(zhì)粒。5.如權(quán)利要求1至4中任一所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括針對內(nèi)參基因的特異性引物對乙和探針乙；所述內(nèi)參基因為ABL基因。6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述特異性引物對乙為序列表的序列4和序列表的序列5所示核苷酸序列組成的引物對；所述探針乙的核苷酸序列如序列表的序列6所示。7.如權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括內(nèi)參質(zhì)粒；所述內(nèi)參質(zhì)粒為含有ABL基因或其片段的重組質(zhì)粒。8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述內(nèi)參質(zhì)粒為含有序列8所示的ABL基因片段的重組質(zhì)粒。9.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于所述內(nèi)參質(zhì)粒為將pMD18-T載體與序列表的序列8所示的ABL基因片段連接得到的重組質(zhì)粒。10.針對MAGEC1/CT7基因的特異性引物對甲和探針甲在制備輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤的試劑盒中的應(yīng)用；所述特異性引物對甲為序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列組成的引物對；所述探針甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。全文摘要本發(fā)明公開了一種輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤的試劑盒。本發(fā)明提供的輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤的試劑盒，包括針對MAGEC1/CT7基因的特異性引物對甲和探針甲；所述特異性引物對甲為序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列組成的引物對；所述探針甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。本發(fā)明的試劑盒，不僅可以應(yīng)用于定性診斷多發(fā)性骨髓瘤MAGEC1/CT7基因的表達，還可以通過內(nèi)參基因，診斷多發(fā)性骨髓瘤MAGEC1/CT7基因的表達水平。本發(fā)明為多發(fā)性骨髓瘤的診斷提供了一條快速、可靠、準確的新途徑，為療效觀察、微小殘留病的動態(tài)觀察提供依據(jù)。本發(fā)明將在醫(yī)學檢測領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。文檔編號C12Q1/68GK101705302SQ200910237229公開日2010年5月12日申請日期2009年11月5日優(yōu)先權(quán)日2009年11月5日發(fā)明者劉開彥,劉艷榮,史惠琳,張瑤,李玲娣,李金蘭,江濱,牛繼紅,秦亞溱,阮國瑞,陳歡,陳珊珊,鮑立,黃曉軍申請人:北京大學人民醫(yī)院