專利名稱：一種制備鬼臼毒素和/或黃芪苷的方法及其專用菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備鬼臼毒素和/或黃芪苷的方法及其專用菌株。
背景技術(shù)：
鬼臼毒素(podophyllotoxin)主要存在于小檗科鬼臼屬及其近緣植物中，是一類 具有廣泛生物學(xué)活性的天然化合物，有擬雌激素樣、抗雌激素樣、抗癌、抗病毒、抗真菌、鎮(zhèn) 靜、抑制植物生長和抗氧化等作用。特別是其具有較強(qiáng)的抗癌活性，其作用機(jī)制是抑制微管 蛋白的解聚作用以阻止細(xì)胞分裂以及抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性。鬼臼毒素的糖苷衍生物 etoposide和teniposide的毒性較低，對小細(xì)胞肺癌、淋巴癌等多種腫瘤疾病均具有很好 的療效而成為臨床應(yīng)用的廣譜抗腫瘤藥物。 目前，鬼臼毒素主要是從野生鬼臼類植物的根莖中提取得到，而這類植物在全世 界僅有4屬15種，我國有3屬12種，主要生長在秦嶺、西藏等高海拔地區(qū)，其生長緩慢，且 鬼臼毒素類物質(zhì)的含量較低。由于鬼臼毒素類物質(zhì)在醫(yī)學(xué)和農(nóng)林防治等方面具有廣闊的應(yīng) 用前景，因而其需求量日益增加；對野生鬼臼類植物資源的大量采集，已使其資源遭到嚴(yán)重 破壞，造成生物多樣性和生態(tài)環(huán)境的不可逆的損失，因此解決鬼臼毒素類物質(zhì)的來源問題 具有重要意義。 由于植物生長環(huán)境復(fù)雜，難以模擬，且其生長周期長，很難進(jìn)行大規(guī)模的人工栽 培，而組織培養(yǎng)技術(shù)對于鬼臼類植物也不適用；加之，鬼臼毒素類物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，化學(xué) 合成雖可進(jìn)行，但成本太高，而通過基因工程學(xué)手段構(gòu)建工程菌也由于參與形成該類物質(zhì) 的酶數(shù)量過多而無法進(jìn)行。所以利用內(nèi)生菌具有產(chǎn)生和宿主相同或相似的生物活性物質(zhì)的 性質(zhì)，來解決鬼臼毒素的來源問題，可能是唯一也是最有效的方法。 此外，由于鬼臼類植物中還含有多種黃酮類化合物，因而其內(nèi)生菌也可能產(chǎn)生黃 酮類化合物。許多研究證實，黃酮類化合物在人體中具有多種生物活性，包括抗氧化、抗癌、 防癌、清除自由基、抗病毒、消炎和促進(jìn)血管舒張等。此外，異黃酮(如染料木黃酮和羥基異 黃酮)還具有雌激素特性。黃酮類化合物的多種生理作用，使其在醫(yī)藥、食品等行業(yè)具有廣 泛的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一株可產(chǎn)鬼臼毒素和/或黃芪苷的菌株及其培養(yǎng)方法。
本發(fā)明所提供的菌株為斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE。該菌株已于2009 年11月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址 北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 3401， 分類命名為Penicillium ateckii，菌株名稱為WEQE。本發(fā)明所提供的培養(yǎng)斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE CGMCC No. 3401的方 法，是用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE CGMCCNo. 3401 。
所述培養(yǎng)方法中，所述培養(yǎng)的條件可包括溫度為26-3(TC、振蕩速度為100-150rpm。所述溫度具體可為28°C ;所述振蕩速度具體可為120rpm。 本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備鬼臼毒素和/或黃芪苷的方法。 本發(fā)明所提供的制備鬼臼毒素和/或黃芪苷的方法，包括如下步驟發(fā)酵培養(yǎng)斯
氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE CGMCC No. 3401，得到鬼臼毒素和/或黃芪苷。 所述發(fā)酵培養(yǎng)中用到的培養(yǎng)基可以是馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基。 所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件包括溫度為26-3(TC、振蕩速度為100-150rpm。所述發(fā)酵培 養(yǎng)的時間可為5-9天。所述溫度具體可為28°C ;所述振蕩速度具體可為120rpm ;所述時間 具體可為7天。 所述制備方法中在所述發(fā)酵后，還包括萃取的步驟。
所述萃取劑為氯仿。 斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE CGMCC No. 3401在制備鬼臼毒素和/或黃 芪苷中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。 本發(fā)明的菌株可以用于制備鬼臼毒素和/或黃芪苷。本發(fā)明的制備鬼臼毒素和/ 或黃芪苷的方法具有操作簡單、成本低廉、易操作、生產(chǎn)周期短的優(yōu)點。本發(fā)明方法為制備 鬼臼毒素提供了新途徑，避免了現(xiàn)有技術(shù)中其它各種制備方法的局限性，具有很強(qiáng)的可操 作性，適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，同時又對保護(hù)植物生態(tài)多樣性具有重要意義。


圖1為斯氏青霉的菌落形態(tài). 圖2為斯氏青霉分生孢子頭和孢子形態(tài)。A和B分別為(10X40)和(10X100)時 分生孢子頭形態(tài)，C (10X40)為孢子形態(tài)
圖3為鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC譜圖
圖4為黃芪苷標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC譜圖 圖5為斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE CGMCC N2 3401發(fā)酵液的氯仿提取 物的HPLC譜圖
具體實施例方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。 遺傳資源名稱窩兒七(Diphylleia sinensis L.)(在中國植物志中，是南方山
荷葉；窩兒七是秦嶺植物志中的名稱。)。遺傳資源的獲取途徑I、遺傳資源取自植物，
11、獲取方式自行采集。直接來源獲取時間2007年08月；采集方式，采集地(國家、省
(市))中國陜西省眉縣紅河谷(海拔1560m)，采集者名稱(姓名)趙長琦，采集者聯(lián)系方 式010-58805046。原始來源同直接來源。 鬼臼毒素(podophyllotoxin)的結(jié)構(gòu)式如式I所示，黃芪苷(Astragalin)的結(jié)構(gòu) 式如式II所示
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式I 式II 實施例1、斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE CGMCC N2 3401的分離及鑒定
—、分離 將采集自陜西省眉縣紅河谷(海拔1560m)的植物窩兒七(Diphyllria sinensisL.)的根及根狀莖分別用自來水洗凈，在超凈工作臺中用75%體積百分含量 的乙醇處理5min，然后無菌水沖洗3-5次；而后再用2. 5 %質(zhì)量百分含量的次氯酸鈉處 理10min，再無菌水沖洗3-5次。用滅菌的鑷子和刀片將窩兒七的根的外皮剝?nèi)?，再切?0. 5cmX0. 5cm大小的小片種植于PDA固體培養(yǎng)基上，28。C培養(yǎng)3_7天。同時將同樣滅菌處 理過的窩兒七的根不做剝皮及切割，將窩兒七的根在PDA培養(yǎng)基上滾動一周后，同條件培 養(yǎng)作為對照觀察。 培養(yǎng)幾天后發(fā)現(xiàn)在窩兒七的根的切口處有菌絲長出，取切口處新長出的菌絲，轉(zhuǎn) 接到新鮮的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌落出現(xiàn)后，根據(jù)菌落的形態(tài)、顏色的差異及菌落長出時 間的不同，分別挑取培養(yǎng)基邊緣的菌絲接種于新的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行分離培養(yǎng)，直至篩選 出單一的菌落，將單一菌株進(jìn)行培養(yǎng)，提取產(chǎn)物，對提取的產(chǎn)物進(jìn)行高效液相色譜檢測，得 到產(chǎn)鬼臼毒素和黃芪的菌株，將此菌株命名為WEQE。
二、鑒定 將上述菌株進(jìn)行如下生理生化、菌形態(tài)的鑒定 (1)菌落特征 菌落形態(tài)如圖l所示。 將單菌株WEQE接種至PDA培養(yǎng)基上，當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)生長后期，菌落大小穩(wěn)定 后，觀察菌落形態(tài)。結(jié)果表明，上述分離得到的菌株WEQE在PDA培養(yǎng)基上菌落薄，生長局限， 產(chǎn)孢面暗藍(lán)綠色或灰綠色，絨狀，上泌出多數(shù)無色以至鮮黃色的水滴，背面帶暗黃色。
(2)菌絲形態(tài)特征
菌絲形態(tài)如圖2所示。 分生孢子梗從菌絲垂直生出，無足細(xì)胞，有橫隔膜，頂端生排列成帚狀的間枝，下 部不分枝；間枝長短不一，散開，上生多數(shù)平行排列的小梗，小梗8-10X2微米；分生孢子鏈 常作散開的圓柱狀；分生孢子球形至橢圓形，直徑2-2. 5微米。 綜合上述特征，依據(jù)《真菌鑒定手冊》、《中國真菌志》等資料，上述分離得到的菌株 具有斯氏青霉的基本特征，將其鑒定為斯氏青霉(Penicillium ateckii)，其分類屬于半知 菌綱、叢梗孢目、叢梗孢科、青霉屬。
該菌株斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE已于2009年11月5日保藏于中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中 國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 3401。 實施例2、利用斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE CGMCC漁3401制備鬼臼毒
素和黃芪苷 —、培養(yǎng)菌株 將100ml制備好的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基裝于250ml三角瓶中，滅菌，挑取斯氏 青霉(Penicillium ateckii)WEQE CGMCC N2 3401的單菌落接種于上述滅菌好的馬鈴薯葡 萄糖液體培養(yǎng)基中，28t:， 120r/min搖床培養(yǎng)7天，得到發(fā)酵液。 馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基是按照如下方法配制的稱取馬鈴薯200g(去皮、切成 約2cm2的小塊)，放入水中煮沸30min，然后用雙層紗布過濾，取其濾液加20g葡萄糖，再補(bǔ) 足水至lOOOmL，自然pH。
實驗設(shè)3次重復(fù)。
二、產(chǎn)物的提取 用抽濾器將發(fā)酵液抽濾兩次，分別收集菌絲體與發(fā)酵液上清。將發(fā)酵液上清分別 用等體積的氯仿萃取，隨時取萃取液于紫外檢測儀下檢測，直至萃取液在紫外檢測器下無 熒光，合并萃取液，減壓蒸餾回收。得到發(fā)酵液上清的氯仿提取物，提取物樣品進(jìn)行如下步 驟三的檢測。 實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。
三、產(chǎn)物的高效液相色譜(HPLC)檢測 標(biāo)準(zhǔn)品鬼臼毒素購自中國藥品生物制品檢定所，產(chǎn)品目錄號為111645 ; 標(biāo)準(zhǔn)品黃芪苷按照如下文獻(xiàn)中方法從植物中華山荷葉中分離得到劉暢，藥用植
物中華山荷葉化學(xué)成分的分析研究[碩士畢業(yè)論文]，NMR數(shù)據(jù)參考文獻(xiàn)馮育林，李云秋，
徐麗珍，楊世林，蜀葵花的化學(xué)成分研究(II)——黃酮類成分研究中草藥，2006，37(11):
1622-1624[注黃芪苷和紫云英苷是同一種物質(zhì)]。標(biāo)準(zhǔn)品黃芪苷也可購自中國藥品生物
制品檢定所。 檢測前，取鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)品、黃芪苷標(biāo)準(zhǔn)品、發(fā)酵液上清的氯仿提取物樣品，分別 用甲醇充分溶解，0. 45 ii m微孔濾膜過濾；采用外標(biāo)法對樣品進(jìn)行HPLC分析。每個樣品至 少重復(fù)三次。
具體的檢測方法如下 儀器Aglient 1100型高效液相色譜儀；色i普柱Aglient 1100 Eclipse XDB_C18(5 ii m， 4. 6X 150mm); 檢測器紫外檢測器；檢測波長254nm ; 色譜條件 流動相甲醇水=60 : 40(體積比) 流速0. 5ml/min 進(jìn)樣量5ul 柱溫室溫 標(biāo)準(zhǔn)品鬼臼毒素、黃芪苷。
實驗設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果如圖3-5所示。其中，圖3為鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC譜 圖，圖4為黃芪苷標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC譜圖，圖5為斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE CGMCC N2 3401發(fā)酵液上清的氯仿提取物樣品的HPLC譜圖。鬼臼毒素的保留時間為8. 336 分鐘。黃芪苷的保留時間為4.965分鐘。 將斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE CGMCC N2 3401發(fā)酵液上清的氯仿提取 物樣品的HPLC譜圖分別與鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)品和黃芪苷標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC譜圖進(jìn)行比對。
結(jié)果表明，在保留時間為8. 306分鐘時，發(fā)酵液上清的氯仿提取物樣品的HPLC譜 圖中具有吸收峰，而鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)品在8. 336分鐘時具有吸收峰，說明發(fā)酵液上清的氯仿 提取物樣品中含有鬼臼毒素；發(fā)酵液上清的氯仿提取物樣品的HPLC譜圖中，在保留時間為 4. 960分鐘時具有吸收峰，而黃芪苷標(biāo)準(zhǔn)品在4. 965分鐘時具有吸收峰，說明發(fā)酵液上清的 氯仿提取物中含有黃芪苷。以上結(jié)果表明，發(fā)酵液上清的氯仿提取物中含有鬼臼毒素和黃 芪苷。 四、產(chǎn)物的薄層層析(TLC)檢測 標(biāo)準(zhǔn)品同上述"產(chǎn)物的高效液相色譜(HPLC)檢測"中采用的標(biāo)準(zhǔn)品。 首先，取鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)品、黃芪苷標(biāo)準(zhǔn)品、斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE
CGMCC N2 3401發(fā)酵液上清的氯仿提取物樣品，分別用甲醇充分溶解，然后分別在正相和反
相薄層板上共層析，并在紫外燈下進(jìn)行檢測，并進(jìn)一步用硫酸-乙醇(15 : 85，v/v)顯色，
觀察樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的斑點熒光顏色和顯色后的顏色，并分別計算Rf值。 具體的檢測條件如下 正相薄層層析 氯仿層提取物展開劑氯仿甲醇=80 : 20(v/v)
反相薄層層析 氯仿層提取物展開劑甲醇水=60 : 40(v/v)
紫外檢測波長254nm。 結(jié)果表明，在正相層析板上，鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)品的Rf值為0. 85，而在發(fā)酵液上清的 氯仿提取物樣品中同樣存在一個Rf值為0. 85的斑點，其斑點與鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)品在紫外燈 (254nm)下具有相同的熒光顏色，并且用硫酸_乙醇(15 : 85，v/v)顯色后，也具有相同的 顏色，說明發(fā)酵液上清的氯仿提取物樣品中含有鬼臼毒素；黃芪苷標(biāo)準(zhǔn)品的Rf值為0. 30， 而在發(fā)酵液上清的氯仿提取物樣品中同樣存在一個Rf值為0. 30的斑點，其斑點與鬼臼毒 素標(biāo)準(zhǔn)品在紫外燈(254nm)下具有相同的熒光顏色，并且用硫酸_乙醇(15 : 85， v/v)顯 色后，也具有相同的顏色，說明發(fā)酵液上清的氯仿提取物樣品中含有黃芪苷。
在反相層析板上，鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)品的Rf值為0. 32，而在發(fā)酵液上清的氯仿提取物 樣品中同樣存在一個Rf值為0. 32的斑點，其斑點與鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)品在紫外燈(254nm)下 具有相同的熒光顏色，并且用硫酸-乙醇(15 : 85，v/v)顯色后，也具有相同的顏色，說明 發(fā)酵液上清的氯仿提取物樣品中含有鬼臼毒素；黃芪苷標(biāo)準(zhǔn)品的Rf值為O. 58，而在發(fā)酵液 上清的氯仿提取物樣品中同樣存在一個Rf值為0. 58的斑點，其斑點與鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)品在 紫外燈(254nm)下具有相同的熒光顏色，并且用硫酸_乙醇(15 : 85，v/v)顯色后，也具有 相同的顏色，說明發(fā)酵液上清的氯仿提取物樣品中含有黃芪苷。
權(quán)利要求
斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE，其保藏號為CGMCC No.3401。
2. 培養(yǎng)斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE CGMCC No. 3401的方法，是用馬鈴薯葡 萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE CGMCC No. 3401。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)的條件為26-30°C、100-150rpm振蕩。
4. 一種制備鬼臼毒素和/或黃芪苷的方法，包括如下步驟發(fā)酵培養(yǎng)斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE CGMCC No. 3401，得到鬼臼毒素和/或黃芪苷。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)中用到的培養(yǎng)基是馬鈴薯 葡萄糖培養(yǎng)基。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為26-30°C、 100-150rpm振蕩培養(yǎng)5_9天。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于所述制備方法中在所述發(fā)酵后， 還包括萃取的步驟。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述萃取劑為氯仿。
9. 斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE CGMCC No. 3401在制備鬼臼毒素和/或黃芪 苷中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備鬼臼毒素和/或黃芪苷的方法及其專用菌株。該菌株為斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQE，其保藏號為CGMCC No.3401。本發(fā)明的菌株可以用于制備鬼臼毒素和/或黃芪苷。本發(fā)明的制備鬼臼毒素和/或黃芪苷的方法具有不受植物資源的影響、操作簡單、成本低廉、易操作、生產(chǎn)周期短等優(yōu)點。本發(fā)明方法為制備鬼臼毒素提供了新途徑，避免了現(xiàn)有技術(shù)中其它各種制備方法的局限性，具有很強(qiáng)的可操作性，適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，同時又對保護(hù)植物生態(tài)多樣性具有重要意義。
文檔編號C12P19/60GK101701193SQ200910237790
公開日2010年5月5日 申請日期2009年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月19日
發(fā)明者朱妍妍, 艾嫦, 趙長琦 申請人:北京師范大學(xué)