專(zhuān)利名稱：：一種檢測(cè)安普霉素的方法及其專(zhuān)用酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測(cè)安普霉素的方法及其專(zhuān)用酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術(shù)：
：安普霉素又名阿普拉霉素，是一種黑暗鏈霉菌產(chǎn)生的氨基環(huán)醇類(lèi)新獸用抗生素，對(duì)多種革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、巴氏桿菌)及葡萄球菌和支原體均有較強(qiáng)的殺菌活性，與敏桿菌核糖體30s亞基結(jié)合而抑制細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成。本試劑盒是應(yīng)用ELISA技術(shù)研發(fā)的新一代藥物殘留檢測(cè)產(chǎn)品，與儀器分析技術(shù)相比具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和靈敏度高等特點(diǎn)，操作時(shí)間僅需1小時(shí)，能最大限度地減少操作誤差和工作強(qiáng)度。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)安普霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測(cè)安普霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括安普霉素特異性抗體及包被原和酶標(biāo)記物；所述包被原為安普霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或抗抗體；所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體或酶標(biāo)安普霉素半抗原；當(dāng)所述包被原為安普霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體；當(dāng)所述包被原為抗抗體時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記安普霉素半抗原。為了更方便現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還可包括安普霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液、顯色液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液。其中，所述濃縮洗滌液可為pH7.2-7.6，含有0.8-1.2%吐溫-20和0.05-0.1%0疊氮化鈉防腐劑，O.2-0.3mol/L磷酸鹽緩沖液；濃縮復(fù)溶液為pH7.2-8.O，含有0.5-1%吐溫-20、5-10%卵清蛋白、0.1-0.3mol/L磷酸鹽緩沖液，所述百分含量為重量體積百分含量；當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶時(shí)，所述顯色液由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液可為過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲，顯色液B液可為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，終止液可為l-2mol/L硫酸或鹽酸溶液；當(dāng)標(biāo)記酶為堿性磷酸酯酶時(shí)，顯色劑可為硝基磷酸鹽緩沖液，終止液可為2mol/L氫氧化鈉溶液。所述安普霉素特異性抗體為安普霉素多克隆抗體或安普霉素單克隆抗體；它們均是以安普霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原得到的；所述載體蛋白為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白或纖維蛋白原。安普霉素是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒(méi)有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。安普霉素半抗原與載體蛋白的結(jié)合比例過(guò)低或過(guò)高都對(duì)免疫不利，安普霉素半抗原與所述載體蛋白的摩爾配比為28.5-34.2:1比較合適。所述安普霉素多克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體。所述安普霉素單克隆抗體是由保藏號(hào)為CGMCCNo.3356的對(duì)安普霉素藥物的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株C-4-4分泌產(chǎn)生的抗體。所述酶標(biāo)抗抗體是采用過(guò)碘酸鈉法將所述標(biāo)記酶與所述抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到的；所述過(guò)碘酸鈉方法中，所述標(biāo)記酶與所述抗抗體的摩爾濃度比為2:l;所述標(biāo)記酶為堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶，優(yōu)選為辣根過(guò)氧化物酶。所述濃縮洗滌液具體為pH值為7.2、含有1.0%的吐溫-20和0.08%。的疊氮化鈉防腐劑，0.2mol/L磷酸鹽緩沖液；濃縮復(fù)溶液為pH7.2，含有0.8%吐溫_20、8%卵清蛋白，0.lmol/L磷酸鹽緩沖液；所述百分含量為重量體積百分含量；所述底物顯色液A液為過(guò)氧化脲，所述底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺；所述終止液為2mol/L的鹽酸。在洗滌液中加入一定量吐溫-20和疊氮化鈉的作用在于緩沖液中吐溫-20會(huì)減少抗體的非特異性吸附，還能對(duì)蛋白起到一定的保護(hù)作用，加入疊氮化鈉后，則疊氮化鈉在溶液中抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，對(duì)溶液的穩(wěn)定性起到一個(gè)保護(hù)作用。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)安普霉素的方法。本發(fā)明所提供的檢測(cè)安普霉素的方法，包括以下步驟l)樣品前處理動(dòng)物肌肉、肝臟樣本的前處理方法用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本；稱取2.0±0.05g均質(zhì)組織至50ml聚苯乙烯離心管中，加入0.8-1.2%三氯乙酸-0.08-0.2M磷酸緩沖液4ml，用振蕩器振蕩5-10min;3000g以上，室溫(20_25°C)離心5min;移取200-400y1上清液至2ml聚苯乙烯離心管中，加入800-1000iil復(fù)溶工作液，充分混勻(pH值在67);取50iU用于分析。2)利用上述任一所述的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)1)中所述樣品。3)分析檢測(cè)結(jié)果。由保藏號(hào)為CGMCCNo.3356的對(duì)安普霉素藥物的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞C_4_4分泌產(chǎn)生的安普霉素單克隆抗體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。保藏號(hào)為CGMCCNo.3356的對(duì)安普霉素藥物的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株C_4_4也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明檢測(cè)安普霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法定性或定量檢測(cè)樣品中安普霉素的殘留量；對(duì)樣品的前處理要求低，樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，能同時(shí)快速檢測(cè)大批量樣品；采用高特異性的安普霉素單克隆抗體，主要試劑以工作液的形式提供，檢驗(yàn)方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、使用方便、價(jià)格便宜、攜帶便利、檢測(cè)方法高效、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、適于現(xiàn)場(chǎng)大批量樣品的篩選。本發(fā)明的試劑盒將在安普霉素的檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。圖1為以安普霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為包被原的試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、以安普霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為包被原的試劑盒的制備及檢—、以安普霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為包被原的試劑盒的檢測(cè)原理如下當(dāng)在微孔條上預(yù)包被安普霉素偶聯(lián)抗原時(shí)，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，隨即加入酶標(biāo)二抗，再加入安普霉素特異性抗體溶液，樣本中殘留的安普霉素藥物與酶標(biāo)板上包被的安普霉素偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)安普霉素特異性抗體，加入酶標(biāo)記抗抗體進(jìn)行放大作用，用顯色液顯色，樣本吸光值與安普霉素藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中安普霉素的殘留量。同時(shí)根據(jù)酶標(biāo)板上顏色的深淺，與系列濃度的安普霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中安普霉素殘留量的濃度范圍。二、以安普霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為包被原的試劑盒一般可以包括如下組成1、包被安普霉素偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板；包被原的濃度可以為0.15-0.20iig/ml;2、酶標(biāo)抗抗體工作液用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體；酶標(biāo)二抗的稀釋液為含pH值為7.2-7.6、3-5%卵清蛋白、0.1-0.2mol/L磷酸鹽緩沖液；所述百分比為重量體積百分比；酶標(biāo)抗抗體工作液稀釋度為1:1000。3、安普霉素特異性抗體工作液可以為單克隆抗體工作液或多克隆抗體工作液；抗體稀釋液為pH值為7.2-8.0、含有8-10%小牛血清，0.1-0.2mol/L磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比，抗體工作液稀釋度為1:10000;4、安普霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為0iig/L、0.1yg/L、0.3yg/L、0.9yg/L、2.7iig/L、8.1iig/L;配制標(biāo)準(zhǔn)品的溶液為pH7.2-8.O，含有0.5-1%吐溫-20、5_10%卵清蛋白、0.1-0.3mol/L磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。5、底物顯色液由A液和B液組成，底物顯色液A液為過(guò)氧化脲或過(guò)氧化氫，7m1/瓶，1瓶；底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺或鄰苯二胺；7ml/瓶，1瓶；6、終止液為l-2mol/L硫酸或鹽酸；7ml/瓶，1瓶；7、濃縮洗滌液可為pH7.2-7.6，含有0.8-1.2%吐溫-20和0.05-0.1%。疊氮化鈉防腐劑，O.2-0.3mol/L磷酸鹽緩沖液，所述百分含量為重量體積百分含量。8、濃縮復(fù)溶液pH7.2-8.O，含有0.5-1%吐溫-20、5_10%卵清蛋白、0.1-0.3mo1/L磷酸鹽緩沖液，所述百分含量為重量體積百分含量；三、本實(shí)驗(yàn)以安普霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為包被原的試劑盒具體組成如下1、包被安普霉素偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板；包被原的濃度可以為0.20iig/ml;2、酶標(biāo)二抗的稀釋液為含pH值為7.4、5%卵清蛋白、0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述百分含量為重量體積百分含量；酶標(biāo)抗抗體工作液稀釋度為1:1000。3、安普霉素單克隆抗體工作液安普霉素單克隆抗體是由保藏號(hào)為CGMCC3356的對(duì)安普霉素藥物的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株C-4-4分泌產(chǎn)生的；安普霉素單克隆抗體工作液是按照以下方法制備的用稀釋液將安普霉素單克隆抗體稀釋10000倍，得到單抗工作液，所述稀釋液為PH值為7.6、含有8%小牛血清，0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分含量為重量體積百分含量。4、安普霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液:6瓶，濃度分別為0iig/L、0.1yg/L、0.3yg/L、0.9yg/L、2.7iig/L、8.1iig/L;配制標(biāo)準(zhǔn)品的溶液為pH7.2，含有0.8%吐溫_20、5%卵清蛋白、0.lmol/L磷酸鹽緩沖液，所述百分含量為重量體積百分含量。5、底物顯色液由A液和B液組成，底物顯色液A液為過(guò)氧化脲，7ml/瓶，1瓶；底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺，7ml/瓶，1瓶。6、終止液為2mol/L鹽酸；7ml/瓶，1瓶；7、濃縮洗滌液濃縮洗滌液具體pH值為7.2、含有1.0%的吐溫-20和0.08%。的疊氮化鈉防腐劑，0.2mol/L磷酸鹽緩沖液；所述百分含量為重量體積百分含量；40ml/瓶，1瓶；8、濃縮復(fù)溶液pH7.2，含有0.8%吐溫_20、8%卵清蛋白，0.lmol/L磷酸鹽緩沖液；所述百分含量為重量體積百分含量；200ml/瓶，1瓶。其中，包被有安普霉素半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)物的酶標(biāo)板、安普霉素抗體工作液、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液的制備方法如下所用的包被緩沖液和封閉液如下所用的包被緩沖液可以為pH值9.2-9.6，0.1_0.2mol/L碳酸鹽緩沖液；所用的封閉液為pH值7.2，含有0.03-0.05%。疊氮化鈉防腐劑、1-2%明膠、8-12%小牛血清的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。1、酶標(biāo)板的制備a、包被原的制備將安普霉素半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)得到包被原，具體步驟如下其中安普霉素半抗原與所述牛血清白蛋白的摩爾配比為31:1。包被原制備1)取安普霉素半抗原30mg用2ml去離子水溶解，得到A液；2)取EDC50mg用2ml去離子水充分溶解，得到B液；3)取BSA60mg溶于2ml0.01mol/LPBS(PH=8.0)溶液中得到C液;4)將B液與C夜混合，在磁力攪拌器攪拌下逐滴加入A液；5)室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h，再用三蒸水透析48h，得到包被原。b、酶標(biāo)板的制備用包被緩沖液將安普霉素偶聯(lián)抗原稀釋成0.20iig/ml，每孔加入100iil，4t:過(guò)夜，傾去包被液，用稀釋后的濃縮洗滌液洗滌2次，每次30秒，拍干，然后再每孔中加入150iU封閉液，37t:溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。2、安普霉素單克隆抗體的制備(1)免疫原合成安普霉素是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒(méi)有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。1)取安普霉素半抗原30mg用1.5ml去離子水溶解，再加入10ii150XGA，室溫下攪拌反應(yīng)18h，得到A液；2)取血藍(lán)蛋白30mg用1.5ml去離子水溶解得到B液；3)將B液加入A液，過(guò)夜反應(yīng)，加入24mgNaBH4反應(yīng)3h，再用三蒸水透析48h，即得免疫原。(2)制備單克隆抗體a.動(dòng)物免疫將免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為100yg/只，使其產(chǎn)生多克隆抗體6血清。b.細(xì)胞融合和克隆化小鼠血清測(cè)定結(jié)果較高后，取其脾細(xì)胞，按7:1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽(yáng)性孔。利用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化，直到得到能穩(wěn)定分泌安普霉素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，將該對(duì)安普霉素藥物的單克隆雜交瘤細(xì)胞株命名為C-4-4，該細(xì)胞株已于2009年10月28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCCNo.3356。c.細(xì)胞凍存和復(fù)蘇將安普霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株用凍存液制成lX109個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37t:水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。d.單克隆抗體的生產(chǎn)與純化將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7天后腹腔注射安普霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株5X107個(gè)/只，7天后采集腹水，用辛酸_飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，得到單克隆抗體，-2(TC保存。3、多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，以安普霉素抗原與血藍(lán)蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為1.5mg/kg，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔3-4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫10天后采血，測(cè)定血清抗體效價(jià)，心臟采血，用硫酸銨分級(jí)沉淀得到純化的多克隆抗體。4、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗抗體的制備過(guò)程(1)抗抗體的制備羊抗鼠抗抗體的制備以羊作為免疫動(dòng)物，以鼠源抗體為免疫原對(duì)無(wú)病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。羊抗兔抗抗體的制備以羊作為免疫動(dòng)物，以兔源抗體為免疫原對(duì)無(wú)病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗兔抗抗體。(2)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗抗體的制備將抗抗體與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)采用改良后的過(guò)碘酸鈉法進(jìn)行偶聯(lián)。傳統(tǒng)的過(guò)碘酸鈉法要求反映體系中酶與抗抗體的摩爾濃度比為4:l;由于辣根過(guò)氧化物酶在強(qiáng)氧化的作用下產(chǎn)生許多與抗抗體結(jié)合的位點(diǎn)，這樣活化的辣根過(guò)氧化物酶分子充當(dāng)了連接各分子的橋梁，降低了酶標(biāo)記物的酶活性，使制備的偶聯(lián)物中混有許多聚合體。本發(fā)明利用改良的過(guò)碘酸鈉法進(jìn)行了抗體的酶標(biāo)，其省去了氨基的封閉過(guò)程，因?yàn)槟墚a(chǎn)生自身氨基連接的氨基實(shí)際很少。降低了辣根過(guò)氧化物酶抗抗體的摩爾濃度比率至2:i，改良后的方法比傳統(tǒng)的方法簡(jiǎn)便，對(duì)酶的活性的損失減少。三、樣品中安普霉素的檢測(cè)1、樣品前處理動(dòng)物肌肉樣品的前處理方法用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本；稱取2.0±0.05g均質(zhì)組織至50ml聚苯乙烯離心管中，加入1.0%三氯乙酸-0.1M磷酸緩沖液4ml，用振蕩器振蕩5min;3000g以上，室溫(20_25°C)離心5min;移取200yl上清液至2ml聚苯乙烯離心管中，加入800ii1復(fù)溶工作液，充分混勻(pH值在67);取50iU用于分析。動(dòng)物肝臟樣品的前處理方法用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本；稱取2.0±0.05g均質(zhì)組織至50ml聚苯乙烯離心管中，加入1.0%三氯乙酸-0.18M磷酸緩沖液4ml，用振蕩器振蕩5min;3000g以上，室溫(20_25°C)離心5min;移取200yl上清液至2ml聚苯乙烯離心管中，加入800ii1復(fù)溶工作液，充分混勻(pH值在67);取50iU用于分析。2、用試劑盒檢測(cè)向包被有安普霉素半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)物的酶標(biāo)板微孔中加入安普霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液50ii1/L隨即辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液50iU/孔，然后再加入安普霉素單克隆抗體工作液50iU/孔，用蓋板模封板，25t:避光環(huán)境中反應(yīng)40min，倒出孔內(nèi)液體，每孔加入250y1洗滌液，每次間隔10s后倒出孔內(nèi)液體，用吸水紙拍干，如此重復(fù)操作共洗板5次。每孔加入底物顯色液A液過(guò)氧化脲，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，輕輕振蕩混勻，25t:避光環(huán)境中反應(yīng)15min，每孔加入2mol/L終止液鹽酸，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)定在450nm處，測(cè)定每孔吸光度值(0D值)。3、檢測(cè)結(jié)果分析用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100%，得到百分吸光度值。百分吸光度值(％)二6xioo%B0公式中B為標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液的平均吸光度值，B0為0iig/L標(biāo)準(zhǔn)品溶液的平均吸光度值。以安普霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度(Pg/L)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(圖1)。用同樣的方法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度，則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出安普霉素的殘留量。本發(fā)明中檢測(cè)結(jié)果的分析也可以采用回歸方程法，計(jì)算出樣品溶液濃度。本發(fā)明中檢測(cè)結(jié)果的分析還可以利用計(jì)算機(jī)專(zhuān)業(yè)軟件，此法更便于大量樣品的快速分析，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需1.0小時(shí)可以完成。實(shí)施例2、試劑盒靈敏度、準(zhǔn)確度和保存期試驗(yàn)(—)標(biāo)準(zhǔn)品精密度檢測(cè)從實(shí)施例1中步驟三中不同時(shí)間段制備的不同批次的試劑盒中各抽取10個(gè)試劑盒，從每個(gè)試劑盒的酶聯(lián)板中各抽出20個(gè)微孔，測(cè)定0.9iig/L安普霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度值(OD值)，計(jì)算變異系數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表l所示，表明，所有檢測(cè)中標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值的變異系數(shù)在5.3%-10.2%之間，符合精密度小于或等于20%的規(guī)定。[OO"]表1、標(biāo)準(zhǔn)品可重復(fù)性試驗(yàn)(CV%)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(二)樣本精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)1、樣品精密度檢測(cè)分別向不含安普霉素的空白肌肉、肝臟樣本中添加終濃度為lOilg/kg的安普霉素，再分別按照實(shí)施例1中所述方法進(jìn)行樣品前處理。從實(shí)施例1中步驟三中所述的不同時(shí)間段制備的三個(gè)批次的試劑盒(01批、02批、03批)中各抽取3個(gè)試劑盒，進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，分別計(jì)算變異系數(shù)，結(jié)果如表2-3所示(各表中的數(shù)值為5次重復(fù)的平均值)。結(jié)果表明肌肉、肝臟樣本的變異系數(shù)均在5.7%-12.8%之間，符合了《農(nóng)業(yè)部文件》農(nóng)醫(yī)發(fā)200517號(hào)附件2試劑盒備案參考評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)中精密度標(biāo)準(zhǔn)。表2、肌肉樣本可重復(fù)性試驗(yàn)批號(hào)實(shí)測(cè)值(Pg/U變異系數(shù)CV。/。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表3、肝臟樣本可重復(fù)性試驗(yàn)批號(hào)實(shí)測(cè)值(Mg/L)變異系數(shù)cvy。9.58.47.98.69.27.3018.47.37.97.48.36.47.58.39.87.68.411.18.89.28.08.48.25.7027.98.28.59.79.08.28.47.87.29.78.911.58.29.09.57.38.010.3037.88.49.09.68.57.88.09.38.67.78.07.72、樣本準(zhǔn)確度試驗(yàn)向不含有安普霉素的肌肉、肝臟組織中分別添加安普霉素，使安普霉素的終濃度分別為20iig/kg、40iig/kg，然后按照實(shí)施例1中所述的樣本前處理方法進(jìn)行處理；再用實(shí)施例1中步驟三中所述的試劑盒檢測(cè)組織中的安普霉素，每個(gè)濃度做4個(gè)平行，分別計(jì)算準(zhǔn)確度(準(zhǔn)確度=實(shí)測(cè)值/添加值X100%)。結(jié)果如下表4所示。結(jié)果表明肌肉、肝臟樣本添加回收率在73.5%-96.8%之間。表4、試劑盒的準(zhǔn)確度檢測(cè)結(jié)果樣本肌肉肝臟添加濃度(Pg/kg)20402040準(zhǔn)確度％185.682.575.890,7275.086.792.073.5396.879.088.388.5480.090.580.288.0平均值％84.484.784.185.2(三)交叉反應(yīng)率試驗(yàn)選擇與安普霉素有類(lèi)似結(jié)構(gòu)和類(lèi)似功能的5種藥物測(cè)定交叉反應(yīng)率。通過(guò)各種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別得到其50%抑制濃度。用下式計(jì)算步驟三中試劑盒對(duì)其它藥物的交叉反應(yīng)率。試劑盒對(duì)于安普霉素交叉反應(yīng)率越大，則其對(duì)該藥物檢測(cè)的特異性就越好。重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。交叉反應(yīng)率(％)=(引起50%抑制安普霉素的濃度/引起50%抑制的安普霉素10類(lèi)似物濃度)xioox表5、試劑盒的特異性藥物名稱交叉反應(yīng)率(％)安普霉素100%卡那霉素<0.1%慶大霉素<0.1%新霉素<0.1%鏈霉素<0.1%大觀霉素<0.1%結(jié)果如表7所示，表明本發(fā)明試劑盒對(duì)安普霉素的特異性好，即本發(fā)明試劑盒可以檢測(cè)安普霉素。(四)試劑盒保存期試驗(yàn)試劑盒保存條件為2-8°C，經(jīng)過(guò)6個(gè)月的測(cè)定，步驟三中試劑盒的最大吸光度值(零標(biāo)準(zhǔn))、50%抑制濃度、安普霉素添加實(shí)際測(cè)定值均在正常范圍之內(nèi)?？紤]在運(yùn)輸和使用過(guò)程中，會(huì)有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37t:保存條件下放置6天，進(jìn)行加速老化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全符合要求?？紤]到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入-2(TC冰箱冷凍5天，測(cè)定結(jié)果也表明試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全正常。因此，本發(fā)明試劑盒可以在2-『C至少可以保存6個(gè)月以上。(五)試劑盒的靈敏度用實(shí)施例1步驟三中所制試劑盒對(duì)零標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行20次檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為試劑盒的靈敏度。表6、靈敏度測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)表iig/kg<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表6可知，本發(fā)明所研制的試劑盒最低檢測(cè)限為0.10i！g/kg。權(quán)利要求一種檢測(cè)安普霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括安普霉素特異性抗體及包被原和酶標(biāo)記物；所述包被原為安普霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或抗抗體；所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體或酶標(biāo)安普霉素半抗原；當(dāng)所述包被原為安普霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體；當(dāng)所述包被原為抗抗體時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)安普霉素半抗原；所述安普霉素特異性抗體為安普霉素的單克隆抗體或安普霉素的多克隆抗體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述濃縮洗滌液可為pH7.2-7.6，含有0.8-1.2%吐溫-20和0.05-0.1%。疊氮化鈉防腐劑，0.2-0.3mol/L磷酸鹽緩沖液；所述濃縮復(fù)溶液為pH7.2-8.0，含有0.5-1%吐溫-20、5-10%卵清蛋白、0.1-0.3mol/L磷酸鹽緩沖液；所述百分含量為重量體積百分含量；所述顯色液由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液為過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲，顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺；所述終止液為12mol/L硫酸或鹽酸溶液。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述濃縮洗滌液具體為pH值為7.2、含有1.0%的吐溫-20和0.08%。的疊氮化鈉防腐劑，0.2mol/L磷酸鹽緩沖液；所述濃縮復(fù)溶液為PH7.2，含有0.8%吐溫-20、8%卵清蛋白，0.lmol/L磷酸鹽緩沖液；所述百分含量為重量體積百分含量；所述顯色液由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液為過(guò)氧化脲，顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺；所述終止液為2mol/L鹽酸溶液。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述安普霉素特異性抗體是用所述安普霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原得到的；所述載體蛋白為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白或纖維蛋白原。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述安普霉素特異性抗體為安普霉素單克隆抗體；所述安普霉素單克隆抗體為由保藏號(hào)為CGMCCNo.3356的對(duì)安普霉素藥物的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株C-4-4分泌的抗體。6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)抗抗體是采用過(guò)碘酸鈉法將所述標(biāo)記酶與所述抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到的；所述過(guò)碘酸鈉方法中，所述標(biāo)記酶與所述抗抗體的摩爾濃度比為2:1;所述標(biāo)記酶為堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶，優(yōu)選為辣根過(guò)氧化物酶。7.—種檢測(cè)安普霉素的方法，包括以下步驟1)樣品前處理動(dòng)物肌肉、肝臟樣本的前處理方法用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本；稱取2.0±0.05g均質(zhì)組織至50ml聚苯乙烯離心管中，加入0.8-1.2%三氯乙酸-0.08-0.2M磷酸緩沖液4ml，用振蕩器振蕩5-10min;3000g以上，室溫(20_25°C)離心5min;移取200-400y1上清液至2ml聚苯乙烯離心管中，加入800-1000iil復(fù)溶工作液，充分混勻(pH值在67);取50iU用于分析。2)利用權(quán)利要求1-6中任一所述的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)1)中所述樣品。8.由保藏號(hào)為CGMCCNo.3356的對(duì)安普霉素藥物的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株C-4-4分泌的安普霉素單克隆抗體。9.保藏號(hào)為CGMCCNo.3356的對(duì)安普霉素藥物的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株C_4_4。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)安普霉素藥物的方法及其專(zhuān)用酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括安普霉素特異性抗體及包被原和酶標(biāo)記物；所述安普霉素特異性抗體為安普霉素的單克隆抗體或安普霉素的多克隆抗體。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、使用方便、價(jià)格便宜、攜帶便利、檢測(cè)方法高效、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，能夠進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控且適合大量樣本的定性和定量篩查，將在安普霉素的檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。文檔編號(hào)C12N5/20GK101718788SQ20091023782公開(kāi)日2010年6月2日申請(qǐng)日期2009年11月11日優(yōu)先權(quán)日2009年11月11日發(fā)明者萬(wàn)宇平,何方洋,馮才偉,馮才茂,馮月君,馮靜,扶勝,李勇,杜鋮鋮,汪善良,趙正苗申請(qǐng)人:北京望爾康泰生物技術(shù)有限公司;北京望爾生物技術(shù)有限公司