專利名稱：一種單雙酰脂肪酶、其編碼基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種脂肪酶，編碼該脂肪酶的基因以及該酶 的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及一種異源表達(dá)該單雙酰脂肪酶的方法。
背景技術(shù)：
目前，酶法催化化學(xué)反應(yīng)因?yàn)槠浞磻?yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少而逐漸替代繁瑣、昂貴的
化學(xué)法。脂肪酶(E C3. 1. 1. 3)是一類具有多種催化能力的酶，因?yàn)槠淇梢源呋?、醇解?酯化、轉(zhuǎn)酯化及酯類的逆向合成反應(yīng)等多種化學(xué)反應(yīng)，而成為一種重要的工業(yè)用酶，應(yīng)用在 生產(chǎn)、生活中的很多方面。脂肪酶的應(yīng)用主要包括，在面粉行業(yè)是滿足于各種面粉改良劑功能需求的首選 酶制劑之一；食品增香通過(guò)對(duì)原料中的脂肪酸的分解，轉(zhuǎn)化成具有特殊香氣的物質(zhì)，增加 產(chǎn)品風(fēng)味；魚片加工用堿性脂肪酶脫去了魚片中大量的油脂，使魚片的保鮮、口味及色澤 都有顯著的提高，徹底解決堿法脫脂影響魚片質(zhì)量的難題；在洗衣粉中的應(yīng)用在洗衣粉 配方中加入適量的堿性脂肪酶，并與堿性蛋白酶配伍成復(fù)合酶，不僅可以明顯提高洗衣粉 的去污力，而且對(duì)洗滌織物的保養(yǎng)，抗再污染等方面有顯著效果；在皮革脫脂方面堿性脂 肪酶的專一性確保了脫脂后的皮革質(zhì)量在諸多方面有明顯的提高，是生產(chǎn)高檔皮革的首選 脫脂劑，而且有助于提高皮革的等級(jí)率及解決環(huán)境污染問(wèn)題；在造紙行業(yè)克服馬尾松磨 木漿的樹(shù)脂障礙、漂白助劑、廢紙張漿的油墨脫除、造紙網(wǎng)毯的清洗及紙廠廢水處理等方面 都有顯著功效。目前有越來(lái)越多的微生物來(lái)源的脂肪酶被開(kāi)發(fā)出來(lái)，因?yàn)槠湫再|(zhì)的不同而 在不同領(lǐng)域中發(fā)揮著重大的作用。單雙酰脂肪酶是脂肪酶的一種，它主要以二酰甘油和單酰甘油為底物，在工業(yè)上 也有十分廣泛的應(yīng)用，另外由于其在性質(zhì)上與三酰甘油脂肪酶的互補(bǔ)性，還將它和三酰脂 肪酶組合起來(lái)使用，可以大大提高三酰甘油的水解及轉(zhuǎn)酯化效率。目前，已知的單雙酰脂肪酶數(shù)量極少，酶活普遍不高，限制了其應(yīng)用。因此尋找新 的具有高活性的單雙酰脂肪酶，建立其高效表達(dá)體系是本領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種單雙酰脂肪酶；本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供編碼上述單雙酰脂肪酶的基因；本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種可在巴斯德畢赤酵母中分泌表達(dá)單雙酰脂肪 酶的表達(dá)載體；本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供上述單雙酰脂肪酶的用途。本發(fā)明從圓弧青霉(Penicillium cyclopium)菌株中克隆到一個(gè)新的單雙酰脂肪 酶(mono-and diacylglycerol lipase, MDL)基因 mdl(9)，其核苷酸序列如 SEQ ID No. 1 所 示，該基因全長(zhǎng)為840bp，分析表明，GC含量為56. 1 %，編碼279個(gè)氨基酸組成的蛋白。由
3該基因編碼的單雙酰脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。該蛋白大小約39kD，活性 中心是145位Ser，199位Asp和259位His。實(shí)驗(yàn)表明由該基因編碼的單雙酰脂肪酶具有 較高的酶活。通過(guò)酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定，該酶的最適反應(yīng)溫度為45°C，最適反應(yīng)pH值為6. 0，在中 性偏堿性條件下穩(wěn)定。為便于表述，將該單雙酰脂肪酶命名為Mdl⑼。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的單雙酰脂肪酶的氨基酸序列(SEQ ID No. 2)，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，得到所述蛋 白的突變序列。例如在非活性區(qū)段，將第25位的Asp替換為Ala。因此，本發(fā)明單雙酰脂肪 酶還包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，具有與 Mdl⑼同等活性的由Mdl⑼衍生得到的蛋白質(zhì)。本發(fā)明基因包括編碼所述蛋白的核酸序列。此外，應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性以及不同物種密碼子的偏愛(ài)性，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。因而，本發(fā)明單雙酰脂肪酶基因還包 括由SEQ ID No. 1所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸，得到編碼 Mdl(9)的核苷酸序列?？蓪⒈景l(fā)明基因與表達(dá)載體可操作地連接，得到能夠表達(dá)本發(fā)明蛋白的重組表達(dá) 載體，進(jìn)一步將該重組表達(dá)載體導(dǎo)入恰當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，獲得表達(dá)本發(fā)明Mdl⑼的基因工程 菌。在本發(fā)明實(shí)例中，通過(guò)將單雙酰脂肪酶基因mdl⑼插入到巴斯德畢赤酵母表達(dá)載 體PPIC9K上構(gòu)建得到在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)載體pPIC9K-mdl⑼，其質(zhì)粒圖譜如附圖2 所示。進(jìn)一步，將該表達(dá)載體導(dǎo)入到巴斯德畢赤酵母中獲得表達(dá)Mdl⑼的基因工程菌。本發(fā)明還提供一種制備上述Mdl⑼的方法，其是通過(guò)培養(yǎng)上述基因工程菌，經(jīng)誘導(dǎo) 表達(dá)獲得單雙酰脂肪酶Mdl(9)。所述培養(yǎng)條件為28°C，初始pH為7，200rpm培養(yǎng)120-170 小時(shí)。所述誘導(dǎo)條件為每24小時(shí)補(bǔ)充一次誘導(dǎo)物甲醇，至甲醇終濃度為1.0%。采用該方 法，搖瓶培養(yǎng)148小時(shí)，分泌到胞外的酶量可達(dá)660mg/L，以單硬脂酸甘油酯為底物，酶活為 2700U/ml。本發(fā)明提供的單雙酰脂肪酶，具有較高的酶活性，增加了單雙酰脂肪酶的成員。本 發(fā)明通過(guò)構(gòu)建恰當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，使所述單雙酰脂肪酶基因在巴斯德畢赤酵母中分泌表達(dá)， 表達(dá)的單雙酰脂肪酶大部分分泌到細(xì)胞外，降低了分離純化成本，而且表達(dá)效率較高，在搖 瓶培養(yǎng)的條件下，以甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)，胞外分泌酶量可達(dá)660mg/L，以單硬脂酸甘油酯為底 物，檢測(cè)酶活可達(dá)2700U/ml。本發(fā)明為該酶的工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。


圖1目的基因DNA酶切回收電泳圖，泳道1為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(kb) :4. 5，3. 0，2. 0， 1. 2,0. 8,0. 50. 2 ；泳道2 目的基因DNA酶切回收840bp片段(箭頭所指)；圖2表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-mdl(9)構(gòu)建流程圖；圖3表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-mdl(9)的酶切電泳圖，其中，泳道1為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(kb) 4. 5,3. 0,2. 0,1. 2,0. 8,0. 50. 2 ；2 為質(zhì)粒 pPIC9K_mdl(9)經(jīng) SnaBI 和 Not I 雙酶切后的結(jié)果， 箭頭所指為目的基因。圖4畢赤酵母GS115-pPIC9K-mdl(9)搖瓶培養(yǎng)細(xì)胞密度及胞外酶活檢測(cè)圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。本發(fā)明中涉及到的百分號(hào)“ ％”，若未特別說(shuō)明，是指質(zhì)量百分比；但溶液的百分 比，除另有規(guī)定外，是指溶液100ml中含有溶質(zhì)若干克；液體之間的百分比，是指在20°C時(shí) 容量的比例。所涉及的酶切、連接、回收、轉(zhuǎn)化、PCR擴(kuò)增等常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作步驟詳見(jiàn)《分子克 隆(第三版)》。引物合成及測(cè)序由英駿(Invitrogen)生物公司完成。實(shí)施例1圓弧青霉cDNA的制備1. 1圓弧青霉總RNA的提取(1)取適量的圓弧青霉菌絲，濾紙吸干水分，液氮研磨，加入lmlTrizol試劑 (Invitrogen)，振蕩器振蕩5min，室溫靜置lmin ；(2)加入0. 2ml氯仿，振蕩15秒，靜置2min ；(3) 4°C，12000rpm, 15min ；(4)吸取上清，加入等體積異丙醇，-20°C沉淀30min ；(5)4°C, 12000rpm, 15min ；(6)倒掉上清，用 lml75% 乙醇洗滌沉淀，7500rpm, 4°C，5min ；(7)重復(fù)(6)步驟一次；(8)倒掉上清，干燥lOmin ；(9)加入適量的DEPC水溶解，得到總RNA ；1. 2圓弧青霉cDNA第一鏈的制備反轉(zhuǎn)錄采用TIANGEN生物公司的TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒，具體操作 如下20 u 1反應(yīng)體系可用于1-5 iig總RNA，將以下成分加到一個(gè)無(wú)核酸酶的離心管 中2 ill 隨機(jī)引物(10 iiM)，1-5 u g 總 RNA， 2u 1 (10mM) dNTP 混合物(中性 pH)，補(bǔ)滅菌蒸餾水至14 ill ；70°C加熱5min后迅速在冰上冷卻2min。簡(jiǎn)短離心后收集反應(yīng)液，加入4 yl 5 XFirst-Strand Buffer, 1 u 1 0. 1M DTT,0. 2u 1 Rasin (RNase 抑制劑)；加入1 u 1 (200U)TIANScript M-MLV，輕輕混勻，將離心管置于25°C溫浴lOmin ； 42°C溫浴50min ；95°C加熱5min終止反應(yīng)，冷凍保存。實(shí)施例2圓弧青霉單雙酰脂肪酶基因mdl⑼的引物設(shè)計(jì)2. 1引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中mdl基因的序列(GenBank登錄號(hào)為AF288219)，設(shè)計(jì)合成了以下 一對(duì)引物Fff(Pl) 5，-GACC TACGTA GATGTTTCGACCAGCGAACT-3，
REV (P2) 5，-ATTT GCGGCCGC TTAAACCCTCTTGAATGGCA-3，PI、P2兩端分別設(shè)計(jì)有SnaBI和NotI酶切位點(diǎn)(見(jiàn)上述序列中斜體并有下劃線 的部分)2. 2圓弧青霉單雙酰脂肪酶基因mdl(9)的PCR擴(kuò)增采用PI、P2引物，以圓弧青霉(購(gòu)自中科院微生物所，編號(hào)為3. 4515) cDNA為模 板，PCR反應(yīng)體系為模板 DNA(10ii g/iil)1 u 1
10X Buffer2u 1
dNTP (2. 5mmol/u 1)0. 5u 1
primer(PI)(lOpmol/u1)0. 8u 1
primer(P2)(lOpmol/u1)0. 8u 1
Taq酶0. 1 u 1
ddH2014. 8u 1 _總體積20 ill反應(yīng)條件為95°C5min ；95°C 30s，58°C lmin，72°C lmin，循環(huán) 30 次；72°C lOmin。2. 3從PCR反應(yīng)產(chǎn)物中回收目的片段從PCR產(chǎn)物中純化回收目的基因片段采用切膠過(guò)柱的方法，PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊 脂糖凝膠電泳后，在紫外燈的照射下切下目的基因DNA (目的基因長(zhǎng)度為840bp (圖1)，按照 DNA回收試劑盒說(shuō)明書(購(gòu)自天根公司，產(chǎn)品編號(hào)為DP209-02)的方法進(jìn)行回收。2. 4TA 克隆將PCR回收產(chǎn)物連接到載體pMD18-T-Simple上(購(gòu)自TaKaRa公司)，連接反應(yīng)按 照TaKaRa公司所提供的試劑盒(Code No. D104A)說(shuō)明書操作。2. 5目的基因連接到巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9K (Invitrogen公司)用限制性內(nèi)切酶SnaBI和Not I分別對(duì)pMD18-T-mdl(9)和pKIC9K進(jìn)行雙酶切，然 后對(duì)目的片段進(jìn)行回收，用T4連接酶將其連接，得到表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-mdl⑼，構(gòu)建流程圖 見(jiàn)附圖2。表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-mdl(9)的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附圖3，結(jié)果表明外源片段(840bp)和載體 (9. 3kb)大小均正確。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a (購(gòu)自上海生工生物工程有限公司)。實(shí)施例3單雙酰脂肪酶基因mdl(9)在巴斯德畢赤酵母GS115中的分泌表達(dá)3. 1巴斯德畢赤酵母GS115 (Invitrogen公司)電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備及其電擊 轉(zhuǎn)化(1)挑取新鮮的單菌落于5mlYPD液體培養(yǎng)基中，于30°C，250rpm培養(yǎng)12-14小時(shí)；(2)以0. 的接種量接種到含500ml YPD培養(yǎng)基的2升三角瓶中，于30°C， 250rpm 培養(yǎng) 12-14 小時(shí)，使其 0D600 = 1. 3-1. 5 ；(3)在4°C下1500rpm離心5分鐘，收集細(xì)胞；(4)用500_250ml冰預(yù)冷的無(wú)菌水洗滌細(xì)胞兩次；(5)用20ml冰預(yù)冷的1M山梨醇溶液洗滌細(xì)胞一次；(6)用1ml冰預(yù)冷的1M山梨醇溶液重懸細(xì)胞，至終體積為1. 5ml左右，以80 yl分裝于小離心管；3. 2巴斯德畢赤酵母酵母細(xì)胞的電擊轉(zhuǎn)化(1)將準(zhǔn)備好的約1 ii g/ ill的線性化質(zhì)粒pPIC9K-mdl(9)約10 yl，與80 yl酵母 感受態(tài)細(xì)胞混勻，在冰上放置約5分鐘；(2)把混合了 DNA的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)入冰預(yù)冷的0. 2cm的電轉(zhuǎn)杯；在1. 5千伏的電 壓下轉(zhuǎn)化；(3)然后馬上加入1ml冰預(yù)冷的1M山梨醇溶液于經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，把細(xì)胞混勻，轉(zhuǎn) 入1. 5ml小離心管；(4)馬上涂布于MD平板(YNB 1. 34%，葡萄糖2%，生物素4X 10_5% )，于30°C培 養(yǎng)2至3天觀察結(jié)果。3. 3.巴斯德畢赤酵母高拷貝轉(zhuǎn)化子及單雙酰脂肪酶高產(chǎn)菌株的篩選3. 3. 1采用G418濃度梯度篩選巴斯德畢赤酵母高拷貝轉(zhuǎn)化子取2ml無(wú)菌水將在MD平板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子洗脫并懸浮，輕微的振蕩后稀釋，以 105/ml的細(xì)胞濃度分別在含G418濃度為0. 25，0. 5，1. 0，1. 5，2. 0，3. Omg/ml的YPD平板 (1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%瓊脂)上涂布，挑選在含3. Omg/ml G418的平板上 生長(zhǎng)的菌落，作為巴斯德畢赤酵母高拷貝轉(zhuǎn)化子，并做PCR鑒定。3. 3. 2酵母菌落PCR法鑒定正確整合的轉(zhuǎn)化子在平板上選到陽(yáng)性菌落，以P1、P2為引物，利用酵母菌落PCR的方法進(jìn)一步驗(yàn)證得 到正確整合的轉(zhuǎn)化子。模板的處理方法(1)用無(wú)菌的吸頭挑取菌落少許，溶解到50 ill的D2-Buffer (1L)異硫氰酸胍472. 64g，lmol/L pH8. OTris HC1 緩沖液 50ml, 3 -巰基乙醇 7ml，混勻；
(2)將混合液于100。C沸水浴5分鐘；(3) 12000rpm,離心 30 秒，棄上清；(4)用無(wú)菌水洗滌沉淀2次；(5)將沉淀溶于20 ill的ddH20,95°C作用5分鐘；(6)離心后得到上清液即為模板。PCR反應(yīng)體系模板2 U 1P12 illP22u 1dNTP (2. 5mM)0. 5 u 110 X Buffer2 u 1Taq 酶0. 2 ii 1ddH2011. 3 ill_總體積20 ill 反應(yīng)條件95°C 5分鐘；95°C 30秒，58°C 30秒，72°C 2分鐘，循環(huán)30次；72°C 10分鐘。
分別挑取10個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶誘導(dǎo)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)外源蛋白表達(dá)分泌量基本相同，選 擇其中酶活相對(duì)較高的一株進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。3.4.巴斯德畢赤酵母重組單雙酰脂肪酶的表達(dá)NaOH滴定法測(cè)定單雙酰脂肪酶酶活(1) 0. 05M NaOH的配置先用無(wú)C02水配置5M的NaOH儲(chǔ)液；再準(zhǔn)確稀釋50倍后， 稱取100°C烘至恒重的鄰苯二甲酸氫鉀0. 38g，溶于80ml無(wú)C02水中，標(biāo)定出其準(zhǔn)確濃度， 再推算出儲(chǔ)液濃度；0. 05M的NaOH溶液以無(wú)C02水用儲(chǔ)液現(xiàn)用現(xiàn)配；(2)PVA-單硬脂酸甘油酯乳化液底物的配置將硬脂酸甘油酯12g，100ml 2% PVA1750 (聚乙烯醇)混合，加熱溶化，用超聲波乳化，功率300W，超聲3s，間歇4s，30次，循 環(huán)2次；(3)取5ml乳化液底物，4ml 0. 1M pH6. 0的磷酸鈉緩沖液加入到150ml三角瓶中， 置于恒溫水浴搖床45°C，130rpm溫育5min ；(4)取1ml適當(dāng)稀釋的酶液加入到底物和緩沖液中，45°C 130rpm反應(yīng)lOmin后加 入15ml無(wú)水乙醇終止反應(yīng)；(5)滴加4滴酚酞作指示劑，用0.05M NaOH滴定酶解產(chǎn)生的脂肪酸，至反應(yīng)液變粉 紅色停止；空白操作與上述一致，只是將發(fā)酵液與無(wú)水乙醇混合反應(yīng)lOmin后加入到底物和 緩沖液中。酶活定義為在該測(cè)定條件下，lmin釋放1 y mol脂肪酸的酶量為一個(gè)酶活單位。挑取具有高拷貝數(shù)巴斯德畢赤酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子單菌落，接種于5mlBMGY培養(yǎng)基 (1 %酵母粉，2%蛋白胨，1 %甘油)，于28°C，200rpm搖床培養(yǎng)至0D600為6. 0左右，離心收 集菌體，轉(zhuǎn)接到裝有50mlBMMY培養(yǎng)基(1 %酵母粉，2 %蛋白胨，1. 0%甲醇，100mmol/l磷酸 緩沖液，PH 7.0)的500ml三角瓶中，相同培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)，每24小時(shí)補(bǔ)加100%甲醇于 培養(yǎng)基至終濃度為1.0%，誘導(dǎo)表達(dá)7天。每隔一定的時(shí)間取樣，測(cè)量其細(xì)胞密度(0D600) 和胞外的單雙酰脂肪酶的酶活。檢測(cè)結(jié)果如附圖4所示，在BMMY培養(yǎng)基(初始pH為7，培養(yǎng)溫度為28°C)搖瓶培 養(yǎng)的條件下148小時(shí)酶活達(dá)到最高2700U/ml，而細(xì)胞也不再生長(zhǎng)，0D600達(dá)到36. 8。實(shí)施例4單雙酰脂肪酶的應(yīng)用以0. 2g單硬脂酸甘油酯為底物，與5ml2% PVA混合經(jīng)乳化后，加入1ml 600U/ml 的單雙酰脂肪酶畢赤酵母工程菌發(fā)酵液，在45°C水浴，130轉(zhuǎn)/分振蕩下，反應(yīng)10分鐘，單 硬脂酸甘油酯的水解率可達(dá)51.9%。以1，3-二硬脂酸甘油酯為底物，按照類似的方法處 理，結(jié)果獲得了與水解單硬脂酸甘油酯相近的水解率。
權(quán)利要求
單雙酰脂肪酶Mdl(9)，其氨基酸序列為a)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；b)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列經(jīng)替換、缺失、或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述單雙酰脂肪酶Mdl⑼的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體。
5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其為pPIC9K-mdl(9)。
6.權(quán)利要求4或5所述重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其為巴斯德畢赤酵母。
8.一種制備單雙酰脂肪酶Mdl⑼的方法，其通過(guò)培養(yǎng)權(quán)利要求6或7所述的宿主細(xì)胞， 誘導(dǎo)單雙酰脂肪酶表達(dá)獲得單雙酰脂肪酶。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)條件為28°C，初始pH為7，200rpm 培養(yǎng)120-170小時(shí)；誘導(dǎo)條件為每24小時(shí)補(bǔ)充一次誘導(dǎo)物甲醇，至甲醇終濃度為1. 0%。
10.權(quán)利要求1所述單雙酰脂肪酶Mdl⑼在水解單酰甘油和/或二酰甘油中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一個(gè)新的單雙酰脂肪酶Mdl(9)以及編碼該酶的基因mdl(9)，該酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，編碼該酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。實(shí)驗(yàn)表明，單雙酰脂肪酶Mdl(9)具有較高的水解單酰甘油酯和二酰甘油酯的活力。本發(fā)明還提供其在巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中的分泌表達(dá)載體和高效表達(dá)該酶的方法。采用該方法，表達(dá)的單雙酰脂肪酶能有效地分泌到胞外，不僅降低了分離純化成本，而且表達(dá)效率提高。在搖瓶培養(yǎng)的條件下，以甲醇為誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)，胞外分泌量可達(dá)660mg/L，以單硬脂酸甘油酯為底物，酶活達(dá)到2700U/ml。本發(fā)明為該酶的工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/55GK101875925SQ20091023839
公開(kāi)日2010年11月3日 申請(qǐng)日期2009年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月7日
發(fā)明者關(guān)國(guó)華, 關(guān)菲菲, 李穎, 王珍芳, 王貴利 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)