專利名稱：利用甘薯淀粉廢水生產有機磷農藥降解菌劑的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種以甘薯淀粉廢水為主要原料，生產有機磷農 藥高效降解菌劑的方法。
背景技術：
有機磷農藥以其品種多、藥效高、防治范圍廣譜等特點，至今仍是農藥中的用量最 多的類別，在農業(yè)生產中起到了舉足輕重的作用，我國有機磷農藥的生產和使用量占農藥 總生產和使用量的一半以上。但是，有機磷農藥具有較強的毒性，長期、大量使用后，其在農 作物上的殘留會引起食品安全問題，也影響了我國農產品出口，而且散落的農藥也會使水 和土壤受到污染。利用微生物降解有機磷農藥殘留的生物修復方法具有低成本、無毒、無二次污染 等優(yōu)點，是最具應用前景的削減農藥污染的方法之一。有機磷農藥降解微生物篩選常用的 方法是從長期遭受農藥污染的土壤或水體中采集樣品，經富集培養(yǎng)、平板劃線等操作，分離 得到單菌落，然后經馴化培養(yǎng)，或紫外化學誘變等方法獲取高效降解菌株，或通過細胞工 程、基因工程等技術手段構建工程菌株。例如中國發(fā)明專利(申請?zhí)?00610090054.7) 公開了一株降解有機磷農藥的施氏假單胞菌，是從農藥廠排污口土壤樣品中分離的；中國 發(fā)明專利(申請?zhí)?00410081019.X)公開了一株降解有機磷農藥的蒼白桿菌，是從長期農 藥污染的土壤中分離獲得。植物的葉際是指植物的地上部分，包括葉、莖、花、果等的表面或內部的小環(huán)境。在 植物的葉際范圍內生活著多種微生物，主要有細菌、真菌、放線菌等，這些在葉際生存的微 生物稱為葉際微生物。對于葉際微生物而言，植物葉際環(huán)境相當惡劣，在強烈的日照下，其 表面干燥，溫度可以達到50°C，紫外線強烈，而夜晚溫度又驟降，還有刮風、下雨等天氣變化 等。對于分離自土壤、污泥等來源的農藥降解微生物，不一定能適應植物葉際的惡劣環(huán)境， 其降解效率往往會受到顯著影響。我們從植物的葉際分離到一株有機磷農藥高效降解菌 株，能夠在葉際長期生存，比較適應多變的葉際環(huán)境，適合原位降解作物表面的農藥殘留。甘薯易腐爛，不宜長期存放。甘薯的深加工，可以解決因貯存鮮薯不當而導致大 量爛薯的現(xiàn)象，甘薯精制淀粉經過不同深度的加工，可生產出數(shù)百種有價值的產品，增值 10-30倍左右。但是，目前的加工工藝，每生產1噸甘薯淀粉大約產出6噸高濃度有機廢水， 這些廢水的COD值高達10000mg/L以上，主要含有溶解性淀粉、蛋白質、果膠、有機酸及少量 的油脂，易腐敗發(fā)酵，使水質發(fā)黑發(fā)臭，排入河流會消耗水中的溶解氧，促進藻類及水生植 物繁殖，量大時河流嚴重缺氧，發(fā)生厭氧腐敗，散發(fā)惡臭，魚、蝦、貝類等水生動物可能會因 此而窒息死亡。而采用一般污水處理工藝將如此高濃度的廢水處理達標，消耗驚人。從另 一個角度考慮，甘薯淀粉廢水中的有機質(包括蛋白質、果膠、糖類等)是微生物生長的良 好營養(yǎng)底物，可以做成微生物培養(yǎng)基，發(fā)酵生產微生物產品。本專利發(fā)明了一種用甘薯淀粉廢水為主要原料，生產有機磷農藥降解菌劑的方 法，采用的菌株是從油菜葉際分離出的一株高效降解有機磷農藥的芽孢桿菌。目前尚未發(fā)現(xiàn)文獻報道用甘薯淀粉廢水生產有機磷農藥降解菌劑的生產方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種利用甘薯淀粉廢水為主要原料，生產高效降解有機磷農 藥的葉際微生物菌劑的方法。本發(fā)明采用的降解有機磷農藥的菌株是由我們實驗室從油菜的葉面上分離篩選 出來的。將其編號為N20，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日 期為2009年12月3日，分類命名為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)。保藏編號為CGMCC No. 3497。該菌株的16S rDNA基因序列已經遞交到了 GenBank數(shù)據庫，登錄號為⑶0864M。 在http //www. ncbi. nlm. nih. gov/網站上用blast程序與已登錄細菌菌株的16S rDNA基 因序列進行比較，結果表明與蠟樣芽孢桿菌的相似性最高，可以達到99%以上。本發(fā)明所述的菌劑的生產方法如下1、培養(yǎng)基配制1)菌種保藏培養(yǎng)基(固體，1L):蛋白胨2g，酵母膏l(xiāng)g，氯化鈉5g，瓊脂20g，加甘 薯淀粉廢水至1L，pH 7. 0-7. 5 ；2)菌種活化培養(yǎng)基(液體，1L):蛋白胨2g，酵母膏2g，氯化鈉5g，加甘薯淀粉廢水 至 1L，pH 7. 0-7. 5 ；3)種子培養(yǎng)基(液體，10L) =MgSO4 1. 0g, KH2PO4 5. 0g, NaCl 5. 0g, K2HPO4 15. Og, 蛋白胨10g，加甘薯淀粉廢水至10L, pH 7. 0-7. 5 ；4)發(fā)酵培養(yǎng)基(液體，200L) =MgSO4 20g，KH2PO4 100g，NaCl 100g，K2HP04300g, (NH4)2SO4 0. 8kg，加甘薯淀粉廢水至 200L, pH 7. 0-7. 5 ；以上培養(yǎng)基均在121°C滅菌15_30min。2、菌種活化挑取有機磷農藥降解菌至菌種保藏培養(yǎng)基，35°C連續(xù)劃線、挑單菌 落培養(yǎng)兩次后，挑取單菌落在菌種活化培養(yǎng)基中，于35°C，150-200r/min搖床振蕩培養(yǎng) 12-24h ；3、液體種子制備向裝有高溫滅菌的種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照5% -10%的接 種量接種有機磷農藥降解菌，于25-37°C，通空氣培養(yǎng)12-24h，得到液體種子。4、液態(tài)發(fā)酵向裝有高溫滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照5% -10%的接種量 接種有機磷農藥降解菌液體種子，于25-37°C，通空氣培養(yǎng)18-60h，得到活菌體培養(yǎng)物。5、菌劑制備培養(yǎng)好的發(fā)酵液經細菌計數(shù)后，超濾濃縮，調節(jié)至 5X109-2X1010CFU/mL,加入甘氨酸(質量分數(shù)0. 3 % -2 % )和甘油(質量分數(shù) 0. 5% -5% )，灌裝保藏。使用時用水稀釋500-1000倍。由本發(fā)明技術方案生產的有機磷農藥降解菌劑能夠有效降解作物表面殘留的有 機磷農藥。以下通過具體實施例詳細說明本發(fā)明的實施，目的在于幫助讀者更好地理解本 發(fā)明的精神實質，但不作為對本發(fā)明實施范圍的限定。實施例1 有機磷農藥降解菌劑生產(1)培養(yǎng)基配制2)菌種保藏培養(yǎng)基(固體，1L):蛋白胨2g，酵母膏l(xiāng)g，氯化鈉5g，瓊脂20g，加甘 薯淀粉廢水至1L，pH 7. 0-7. 5 ；4
5)菌種活化培養(yǎng)基(液體，1L):蛋白胨2g，酵母膏2g，氯化鈉5g，加甘薯淀粉廢水 至 1L，pH 7. 0-7. 5 ；6)種子培養(yǎng)基(液體，10L) =MgSO4 1. 0g, KH2PO4 5. 0g, NaCl 5. 0g, K2HPO4 15. Og, 蛋白胨10g，加甘薯淀粉廢水至10L, PH 7. 0-7. 5 ；7)發(fā)酵培養(yǎng)基(液體，200L) =MgSO4 20g，KH2PO4 100g，NaCl 100g，K2HP04300g, (NH4)2SO4 0. 8kg，加甘薯淀粉廢水至 200L, pH 7. 0-7. 5 ；以上培養(yǎng)基均在121°C滅菌15min。2、菌種活化挑取有機磷農藥降解菌至菌種保藏培養(yǎng)基，30°C連續(xù)劃線挑單菌落 培養(yǎng)兩次后，挑取單菌落在菌種活化培養(yǎng)基中，于30°C，150r/min搖床振蕩培養(yǎng)20h ；3、液體種子制備向裝有高溫滅菌的種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照5%的接種量 接種菊酯農藥降解菌，于30°C，通空氣培養(yǎng)20h，得到液體種子。4、液態(tài)發(fā)酵向裝有高溫滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種有機磷農藥降解菌，于30°C， 通空氣培養(yǎng)30h，得到活菌體培養(yǎng)物。5、菌劑制備培養(yǎng)好的發(fā)酵液經細菌計數(shù)后，超濾濃縮，調節(jié)至101(lCell/mL，加入 甘氨酸(質量分數(shù)0.5%)和甘油(質量分數(shù)1.5%)，灌裝保藏。實施例2 有機磷農藥降解菌劑對油菜葉面敵敵畏農藥殘留的降解效果1)選取兩個完全相同的油菜地塊，各30m2，均勻噴灑1000倍稀釋的80%敵敵畏乳 油農藥；2)噴灑敵敵畏1 后，害蟲已被殺死，均勻噴施農藥降解菌劑(用清水稀釋600 倍)，以噴施清水作對照；3)噴灑菌劑24h后，五點取樣法檢測油菜葉面敵敵畏殘留，發(fā)現(xiàn)噴灑菌劑的處理 組與不噴灑菌劑的對照組相比，敵敵畏殘留量顯著降低，低于蔬菜中敵敵畏殘留國家限量 標準(0. lmg/kg)。實施例3 有機磷農藥降解菌劑對油菜葉面樂果的降解效果1)選取兩個完全相同的油菜地塊，各30m2，均勻噴灑1000倍稀釋的50%樂果乳油 農藥；2) 12h后，均勻噴施農藥降解菌劑(用清水稀釋600倍)，以噴施清水作對照；3)48d后，五點取樣法檢測油菜葉面樂果的殘留，發(fā)現(xiàn)處理組較對照組油菜中樂果 殘留量顯著降低，低于蔬菜中樂果殘留國家限量標準。本發(fā)明所提供的降解有機磷農藥的菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心，保藏日期為2009年12月3日，分類命名為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)。保藏編號為CGMCC No. 3497。
權利要求
1. 一種利用甘薯淀粉廢水生產蠟樣芽孢桿菌有機磷農藥降解菌劑的方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基以甘薯淀粉廢水為主要原料，生產步驟包括(1)培養(yǎng)基配制1)菌種保藏培養(yǎng)基蛋白胨2g，酵母膏l(xiāng)g，氯化鈉5g，瓊脂20g，加甘薯淀粉廢水至1L， pH 7. 0-7. 5 ；2)菌種活化培養(yǎng)基蛋白胨2g，酵母膏2g，氯化鈉5g，加甘薯淀粉廢水至1L，pH 7. 0-7. 5 ；3)種子培養(yǎng)基=MgSO41. 0g, KH2PO4 5. 0g, NaCl 5. 0g, K2HPO4 15. 0g，蛋白胨 10g，加甘 薯淀粉廢水至10L, pH 7. 0-7. 5 ；4)發(fā)酵培養(yǎng)基MgSO420g，KH2PO4 100g，NaCl IOOgjK2HPO4 300g，(NH4) 2S040 . 8kg，加甘 薯淀粉廢水至200L，pH 7. 0-7. 5 ；以上培養(yǎng)基均在121°C滅菌15-30min。(2)菌種活化挑取蠟樣芽孢桿菌CGMCC3497菌株至菌種保藏培養(yǎng)基，35°C連續(xù)劃線、 挑單菌落培養(yǎng)兩次后，挑取單菌落在菌種活化培養(yǎng)基中，于35°C，150-200r/min搖床振蕩 培養(yǎng) 12-24h ；(3)液體種子制備向裝有高溫滅菌的種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照5%-10%的接種 量接種有機磷農藥降解菌，于25-37°C，通空氣培養(yǎng)12-24h，得到液體種子。(4)液態(tài)發(fā)酵向裝有高溫滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照5%-10%的接種量接 種有機磷農藥降解菌液體種子，于25-37°C，通空氣培養(yǎng)18-60h，得到活菌體培養(yǎng)物。(5)菌劑制備培養(yǎng)好的發(fā)酵液經細菌計數(shù)后，超濾濃縮，調節(jié)至5X109-2X101(iCFU/ mL，加入甘氨酸(質量分數(shù)0.3%-2%)和甘油(質量分數(shù)0.5%-5%)，灌裝保藏。使用 時用水稀釋500-1000倍。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用甘薯淀粉廢水生產蠟樣芽孢桿菌有機磷農藥高效降解菌劑的方法，屬于環(huán)境生物技術領域。有機磷農藥降解株菌采用的是一株分離自油菜葉面的蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)，其菌劑的生產方法包括5個步驟培養(yǎng)基配制、菌種活化、液體種子制備、液態(tài)發(fā)酵、菌劑制備，以甘薯淀粉廢水提供發(fā)酵培養(yǎng)基的主要碳源和水。由本發(fā)明技術方案不僅為高濃度甘薯淀粉廢水的資源化利用提供了一條新途徑，而且生產的有機磷農藥降解菌劑能高效原位降解植物葉片上有機磷農藥殘留，保障食品安全，保護生態(tài)環(huán)境。
文檔編號C12N1/20GK102051338SQ20091024135
公開日2011年5月11日 申請日期2009年12月7日 優(yōu)先權日2009年12月7日
發(fā)明者姜丹, 安曉宇, 宿燕明, 彭霞薇, 白志輝, 荊夢 申請人:北京林業(yè)大學