專利名稱：一種陣列式微聚合酶鏈式反應芯片的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及脫氧核糖核酸(DNA)擴增技術領域，主要內(nèi)容是利用聚合酶鏈式反應 技術實現(xiàn)特定脫氧核糖核酸(DNA)片段的體外快速擴增。
背景技術：
聚合酶鏈式反應技術可以實現(xiàn)特脫氧核糖核酸(DNA)片段的體外快速擴增，在生 命科學、生物醫(yī)學、法醫(yī)鑒定等眾多領域中的應用十分廣泛。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，聚合酶鏈式反應(PCR)技術已經(jīng)日趨成熟。現(xiàn)在市場上銷售 的臺式聚合酶鏈式反應(PCR)擴增儀也是種類繁多，功能各異。但它們一般都有體積大、質(zhì) 量重、升降溫速率慢、所需試劑量多等缺點。利用微電子機械系統(tǒng)(MEMQ技術把傳統(tǒng)聚合 酶鏈式反應(PCR)擴增實驗從臺式擴增儀移到微小的生物芯片上實現(xiàn)，即制作成芯片上的 實驗室(Lab-on-Chip)，可以很好的彌補臺式儀的缺陷，具有小、輕、快、省等等諸多優(yōu)點。但不可否認的是，基于微電子機械系統(tǒng)(MEMS)技術的聚合酶鏈式反應(PCR)芯 片在使用和推廣的過程中，也面臨著諸多困難和挑戰(zhàn)。譬如，微電子機械系統(tǒng)(MEMS)工藝 材料(如硅、玻璃等)和聚合酶鏈式反應(PCR)試劑的生物兼容性問題、聚合酶鏈式反應 (PCR)的污染問題等。這些問題的存在嚴重制約了微型化聚合酶鏈式反應(PCR)的發(fā)展和 應用，綜上所述，研制一種新型的聚合酶鏈式反應(PCR)擴增方法，使其既能克服傳統(tǒng) 臺式擴增儀的缺點，又能避免微電子機械系統(tǒng)(MEMQ工藝帶來的新問題，有著重要的理論 意義和實用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開一種陣列式微聚合酶鏈式反應(PCR)芯片，以克服傳統(tǒng)臺式 擴增儀的缺點以及解決微型化聚合酶鏈式反應(PCR)面臨的問題，該芯片性能穩(wěn)定、價格 低廉、體積小，把微加熱芯片和微反應腔陣列相分離，做擴增反應簡單快捷。為達到上述目的，本發(fā)明的技術解決方案是一種陣列式微聚合酶鏈式反應芯片，包括溫控系統(tǒng)、加熱芯片和反應腔；其加熱芯 片和反應腔是分離設置；加熱芯片與溫控系統(tǒng)電連接，加熱芯片包括絕緣基片、加熱電極和溫度傳感器，其 中，在絕緣基片上表面濺射有加熱電極和溫度傳感器；加熱電極為環(huán)形圓盤狀，環(huán)形圓盤的 中間徑向、在絕緣基片上表面有一條溝道，溫度傳感器探頭嵌入在溝道中；絕緣基片下表 面，相對于加熱電極和溫度傳感器設有凹槽，使絕緣基片側(cè)剖面為倒凹形；反應腔包括框架和反應池，框架包括側(cè)邊、頂面，側(cè)邊固接于頂面周緣、正交向下， 側(cè)邊圍成的形狀與絕緣基片的形狀相適配；反應池口設于頂面，池體向下延伸，反應池為 圓、方或多邊形柱體，反應池底面為平面，反應池底面面積與加熱電極面積相適配；加熱芯片和反應腔中反應池數(shù)目相等，至少為四個，成陣列設置；
使用時，將反應腔對準加熱電極后按下，使反應腔下表面與加熱電極上表面緊密 貼連，向反應池內(nèi)注入樣品液，然后啟動。所述的陣列式微聚合酶鏈式反應芯片，其所述絕緣基片為硅片；加熱電極和溫度 傳感器為鉬制作，陣列中每個加熱芯片的形狀、大小、加熱電極的電阻值和溫度傳感器的電 阻值都相同；反應腔為聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料制作的一次性器件，陣列中每個反應池 的形狀和容積完全相同。所述的陣列式微聚合酶鏈式反應芯片，其所述溫控系統(tǒng)，包括多路溫度采集電路、 信號放大電路、A/D轉(zhuǎn)換電路、微控制器比例積分微分(PID)調(diào)節(jié)器、執(zhí)行器件；其中，多路 溫度采集電路經(jīng)信號放大電路、A/D轉(zhuǎn)換電路與微控制器比例積分微分(PID)調(diào)節(jié)器輸入 端電連接，微控制器比例積分微分(PID)調(diào)節(jié)器輸出端與執(zhí)行器件電連接；微控制器比例積分微分(PID)調(diào)節(jié)器設有觸摸屏；多路溫度采集電路的多個輸入端與溫度傳感器電連接，執(zhí)行器件的多個輸出端與 加熱電極電連接。所述的陣列式微聚合酶鏈式反應芯片，其所述微控制器比例積分微分(PID)調(diào)節(jié) 器或外接計算機，并與計算機雙向通訊；微控制器比例積分微分(PID)調(diào)節(jié)器輸出端發(fā)出 脈寬調(diào)制(PWM)信號，以控制執(zhí)行器件對陣列中每一路加熱芯片的溫度升溫或降溫進行順 序控制。本發(fā)明充分綜合了微電子機械系統(tǒng)(MEMS)技術的優(yōu)點和聚二甲基硅氧烷(PDMS) 材料的優(yōu)良特性，既實現(xiàn)了聚合酶鏈式反應(PCR)的微型化，具有小、輕、快、省等諸多優(yōu) 點；同時又避免了生物兼容性和聚合酶鏈式反應(PCR)污染的問題。由于溫控系統(tǒng)的智 能化、自動化以及操作界面的人性化，微型聚合酶鏈式反應(PCR)的使用靈活方便，容易上手。


圖1是本發(fā)明中單個加熱電極和溫度傳感器的集成結(jié)構示意圖；圖2是本發(fā)明中微加熱芯片的制作工藝流程示意圖，其中
圖2 (a)在硅片的兩面上都生長二氧化硅和氮化硅；圖2 (b)在硅片正面甩膠并光刻出圖案；圖2 (C)在硅片的正面濺射鉬；圖2 (d)在硅片的背面腐蝕挖坑；圖3是本發(fā)明中微加熱芯片的陣列結(jié)構示意圖；圖4是本發(fā)明中制作聚二甲基硅氧烷(PDMS)微反應腔陣列的模具結(jié)構示意圖；圖5是本發(fā)明中聚二甲基硅氧烷(PDMS)微反應腔陣列的結(jié)構示意圖；圖6是本發(fā)明中溫控系統(tǒng)的總體結(jié)構方塊圖。
具體實施例方式一種陣列式微聚合酶鏈式反應(PCR)芯片，利用微電子機械系統(tǒng)(MEMS)工藝和材 料(如硅、鉬等)制作微加熱芯片，利用性能穩(wěn)定、價格低廉的聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料 制作微反應腔陣列，并把微加熱芯片和微反應腔陣列相分離。每次做擴增反應時，取一塊干凈的微反應腔陣列粘在微加熱芯片上，通過溫控系統(tǒng)控制微加熱芯片進行溫度循環(huán)，便可 實現(xiàn)擴增反應。本發(fā)明的一種陣列式微聚合酶鏈式反應(PCR)芯片，主要包括以下三個部分，每 部分的結(jié)構和功能如下(1)微加熱芯片。微加熱芯片是利用微電子機械系統(tǒng)(MEMS)技術和材料制作的， 主要工藝過程包括生長二氧化硅和氮化硅薄膜、甩膠光刻、濺射、去膠等步驟。為了實現(xiàn)一 次擴增多個樣品的目的，將芯片上的微加熱電極做成陣列式。為了使每個加熱電極的溫度 分布更加均勻，將加熱器設計成環(huán)形圓盤狀。在圓盤中間留出一個溝道，通過此溝道將溫度 傳感器嵌入加熱電極之中，這樣便可以實時準確的監(jiān)測和控制加熱電極的溫度。(2)微反應腔陣列。為了解決微型化聚合酶鏈式反應(PCR)存在的生物兼容性差 和聚合酶鏈式反應(PCR)污染的問題，本發(fā)明采用性能優(yōu)良的聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料 來制作微反應腔。聚二甲基硅氧烷(PDMQ是一種高分子有機聚合物，它具有良好的生物兼 容性、耐高低溫性和耐腐蝕性，不會與聚合酶鏈式反應(PCR)試劑發(fā)生化學反應；同時它的 價格低廉，用它制作一次性使用的微反應腔陣列成本很低，而且制作工藝簡單。因此，聚二 甲基硅氧烷(PDMS)是一種非常適合做微反應腔陣列的材料。(3)溫控系統(tǒng)。為了實現(xiàn)一次擴增多個樣品的目的，溫控系統(tǒng)設計成可以多路采樣 和多路A/D轉(zhuǎn)換的結(jié)構。由電橋電路采集到的微弱溫度信號送儀表放大器進行放大處理， 然后再送A/D轉(zhuǎn)換器進行數(shù)模轉(zhuǎn)換，根據(jù)轉(zhuǎn)換的結(jié)果得到當前的溫度值，然后再通過比較 當前設定值進行比例積分微分(PID)調(diào)節(jié)，最后通過輸出PWM信號控制加熱電極的工作狀 態(tài)，從而實現(xiàn)實時調(diào)節(jié)加熱器溫度的目的。本發(fā)明的一種陣列式微聚合酶鏈式反應(PCR)芯片技術特點在于(1)微加熱芯片和反應腔陣列的分離性。為了既能實現(xiàn)聚合酶鏈式反應(PCR)的 微型化，又能解決微型化帶來的一些問題，本發(fā)明將微加熱芯片和微反應腔陣列分離設計。 利用微電子機械系統(tǒng)(MEMS)技術制作微加熱芯片實現(xiàn)了聚合酶鏈式反應(PCR)的微型化， 利用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料制作一次性使用的微反應腔陣列解決了生物兼容性和聚 合酶鏈式反應(PCR)污染的問題。(2)陣列式。為了提升擴增的效率，本發(fā)明將加熱電極以及微反應腔都設計成陣列 式，這樣一次便可以擴增多個樣品。這在基因測序等需要進行大量脫氧核糖核酸(DNA)擴 增的場合有著獨特的優(yōu)勢。(3)加熱電極和溫度傳感器的集成性。微加熱芯片主要包括兩個部分加熱電極 和溫度傳感器，加熱電極用來給試劑進行加熱，而溫度傳感器用來實時控制當前溫度。本發(fā) 明在制作微加熱芯片時將二者集成在了一起，這樣溫度傳感器便能更加準確快速的反應出 但前實際溫度，改善擴增效果。(4) 一次性使用的微反應腔陣列。微型化聚合酶鏈式反應(PCR) —個主要的問題 就是容易受污染。如果每次在做擴增實驗之前，都要花大量的時間和精力去清洗反應腔，這 無疑會在很大程度上降低擴增的效率。而且隨著微型化的發(fā)展，清洗工作會變得越來越困 難，一旦清洗不干凈，就會造成難以估計的后果。本發(fā)明利用價格低廉的聚二甲基硅氧烷 (PDMS)材料制作一次性使用的微反應腔陣列，每次反應時取一塊干凈的反應腔陣列粘在加 熱芯片上便可進行擴增反應。這樣既省去了繁瑣的清洗工作，也完全杜絕了聚合酶鏈式反
5應(PCR)污染的發(fā)生。而且由于聚二甲基硅氧烷(PDMS)的廉價性，即便一次性使用，也不 會增加太多成本。(5)溫控系統(tǒng)的多路性。為了配合微加熱芯片和微反應腔陣列，將溫控系統(tǒng)設計 成了可多路采樣、多路轉(zhuǎn)換的控制系統(tǒng)。通過對每一路的循環(huán)控制，實現(xiàn)多個反應的同時進 行。(6)溫控系統(tǒng)的自動化和智能化。溫度控制采用經(jīng)典的比例積分微分(PID)調(diào)節(jié) 算法，可以根據(jù)當前值和設定值的差值調(diào)節(jié)脈寬調(diào)制信號的占空比，從而控制加熱電極的 工作狀態(tài)。只要在擴增前設置好比例積分微分(PID)調(diào)節(jié)參數(shù)和每個時間段的溫度值，擴 增過程中完全不需要人工操作，便可自動完成多次的擴增反應。下面結(jié)合附圖進一步詳細說明本發(fā)明的具體實施。如圖1所示，將每個加熱電極和溫度傳感器集成在一起做成一個加熱單元。其中 線條較粗的圓盤是加熱電極，中間較細的線條便是溫度傳感器。由于二者緊密集成在一起， 因此溫度傳感器可以實時準確的檢測出加熱器當前的溫度，送至溫控系統(tǒng)進行溫度控制。圖2是制作微加熱芯片的一個大概流程圖。(a)在清洗干凈的硅片上熱氧化一層 氧化硅薄膜，再低壓化學氣相淀積(LPCVD) —層氮化硅薄膜；(b)在硅片正面甩膠、光刻、顯 影，得到加熱電極和溫度傳感器的圖案；(c)利用Lift_0ff工藝濺射一層鉬，用丙酮浸泡去 膠后，便可得到加熱電極和溫度傳感器；(d)為了提高升降溫的速率，將硅片背面腐蝕掉一 部分。圖3便是制作完成以后整個芯片的陣列結(jié)構圖，從圖中可見，每個芯片上面多個加熱 單元排成陣列，以便同時擴增多個樣品。圖4是制作聚二甲基硅氧烷(PDMS)微反應腔陣列的模具結(jié)構示意圖。制作聚二 甲基硅氧烷(PDMS)微反應腔陣列時，先將聚二甲基硅氧烷(PDMS)液體和固化劑按10 1 的比例完全混合均勻后放入真空腔中抽氣以排除混合液里的氣泡；然后將混合液灌入圖4 所示的模具中后，放入烘箱中烘烤大約1小時便可得到成型的聚二甲基硅氧烷(PDMS)微反 應腔陣列，如圖5所示。由圖5可知，每個微反應腔陣列上有多個反應池，而且反應池的結(jié) 構、數(shù)量與微加熱芯片陣列上加熱單元的結(jié)構、數(shù)量相對應。圖6是溫控系統(tǒng)的總體結(jié)構方框圖。從圖中可知，溫控系統(tǒng)大體上可以分成4個 部分溫度信號輸入部分、溫度信號處理部分、控制信號輸出部分和操作界面部分。其中，溫 度信號的輸入又包括信號采集、信號放大以及信號的A/D轉(zhuǎn)換三個部分。為了能采集到微 弱的溫度信號，將信號采集部分設計成雙臂電橋結(jié)構，為了能盡可能的抑制共模、放大溫度 信號，信號放大部分采用儀表放大器。信號處理部分的主要作用是根據(jù)當前設定溫度值與 實際溫度值之間的大小關系，利用比例積分微分(PID)調(diào)節(jié)算法，輸出一個占空比可調(diào)的 脈寬調(diào)制信號，控制加熱電極的開關工作狀態(tài)，進而調(diào)節(jié)加熱電極的溫度使其趨于設定值。 操作界面也即人機接口部分，友好的人機接口是一個好的電子產(chǎn)品的重要組成部分，本發(fā) 明的人機接口主要包括觸摸屏和PC機兩部分，用以實現(xiàn)參數(shù)設定、過程控制、實時監(jiān)測等 目的。
權利要求
1.一種陣列式微聚合酶鏈式反應芯片，包括溫控系統(tǒng)、加熱芯片和反應腔；其特征在 于加熱芯片和反應腔是分離設置；加熱芯片與溫控系統(tǒng)電連接，加熱芯片包括絕緣基片、加熱電極和溫度傳感器，其中， 在絕緣基片上表面濺射有加熱電極和溫度傳感器；加熱電極為環(huán)形圓盤狀，環(huán)形圓盤的中 間徑向、在絕緣基片上表面有一條溝道，溫度傳感器探頭嵌入在溝道中；絕緣基片下表面， 相對于加熱電極和溫度傳感器設有凹槽，使絕緣基片側(cè)剖面為倒凹形；反應腔包括框架和反應池，框架包括側(cè)邊、頂面，側(cè)邊固接于頂面周緣、正交向下，側(cè)邊 圍成的形狀與絕緣基片的形狀相適配；反應池口設于頂面，池體向下延伸，反應池為圓柱 體，反應池底面為平面，反應池底面面積與加熱電極面積相適配；加熱芯片和反應腔中反應池數(shù)目相等，至少為四個，成陣列設置；使用時，將反應腔對準加熱電極后按下，使反應腔下表面與加熱電極上表面緊密貼連， 向反應池內(nèi)注入樣品液，然后啟動。
2.如權利要求1所述的陣列式微聚合酶鏈式反應芯片，其特征在于所述絕緣基片為 硅片；加熱電極和溫度傳感器為鉬制作，陣列中每個加熱芯片的形狀、大小、加熱電極的電 阻值和溫度傳感器的電阻值都相同；反應腔為聚二甲基硅氧烷材料制作的一次性器件，陣 列中每個反應池的形狀和容積完全相同。
3.如權利要求1所述的陣列式微聚合酶鏈式反應芯片，其特征在于所述溫控系統(tǒng)，包 括多路溫度采集電路、信號放大電路、A/D轉(zhuǎn)換電路、微控制器比例積分微分(PID)調(diào)節(jié)器、 執(zhí)行器件；其中，多路溫度采集電路經(jīng)信號放大電路、A/D轉(zhuǎn)換電路與微控制器比例積分微 分調(diào)節(jié)器輸入端電連接，微控制器比例積分微分調(diào)節(jié)器輸出端與執(zhí)行器件電連接；微控制器比例積分微分調(diào)節(jié)器設有觸摸屏；多路溫度采集電路的多個輸入端與溫度傳感器電連接，執(zhí)行器件的多個輸出端與加熱 電極電連接。
4.如權利要求3所述的陣列式微聚合酶鏈式反應芯片，其特征在于所述微控制器比 例積分微分調(diào)節(jié)器或外接計算機，并與計算機雙向通訊；微控制器比例積分微分調(diào)節(jié)器輸 出端發(fā)出PWM調(diào)制信號，以控制執(zhí)行器件對陣列中每一路加熱芯片的溫度升溫或降溫進行 順序控制。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種陣列式微聚合酶鏈式反應芯片，涉及脫氧核糖核酸(DNA)擴增技術，包括溫控系統(tǒng)、加熱芯片和反應腔；其加熱芯片和反應腔是分離設置，使用時，將反應腔框架套于絕緣基片外圓后，按下，使反應池底面下表面與加熱電極上表面緊密貼連，向反應池內(nèi)注入樣品液，然后啟動。每次只需取一塊干凈的一次性聚二甲基硅氧烷(PDMS)微腔陣列粘在加熱芯片上即可進行擴增反應。本發(fā)明的反應芯片，既可將聚合酶鏈式反應(PCR)微型化，實現(xiàn)小、輕、快、省的目的，又可解決微型化難以克服的生物兼容性和聚合酶鏈式反應(PCR)污染的問題。
文檔編號C12M1/38GK102071136SQ20091024153
公開日2011年5月25日 申請日期2009年11月25日 優(yōu)先權日2009年11月25日
發(fā)明者丁國杰, 于留波, 方震, 趙湛 申請人:中國科學院電子學研究所