專利名稱：一種燕麥多肽及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種燕麥多肽及其制備方法與應(yīng)用，特別涉及一種燕麥多肽及其制備 方法與其在制備抑制ACE活性和降血壓的食品或藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
燕麥，禾本科燕麥族燕麥屬，一年生或多年生草本植物。燕麥營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富而全 面，其蛋白質(zhì)、脂肪、維生素E、膳食纖維以及鈣、鎂、鐵、磷等礦物元素含量均高于其它谷類
作物，具有降血脂、降低膽固醇、降血壓、降血糖和抗氧化性等多種生物活性功能。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin-I-co読rtingen enzyme，ACE，EC 3. 4. 15. 1)是
一種含鋅二肽羧酶，廣泛分布于哺乳動(dòng)物組織中并對(duì)其血壓調(diào)節(jié)起著關(guān)鍵性的作用。ACE在
人體腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin angiotensin system, RAS)和激肽_激肽生成酶系統(tǒng)
(Kallikerni-kinin system,KKS)中，對(duì)血壓調(diào)節(jié)起著重要的作用，具體調(diào)節(jié)機(jī)理如圖l所
示。因此通過抑制體內(nèi)ACE活性來達(dá)到治療高血壓的目的是一條非常重要的途徑。 近年來， 一些具有特定生理活性的短肽，如ACE抑制肽、阿片肽、免疫調(diào)節(jié)肽等引
起了人們的極大關(guān)注，這些肽具有安全性高，無副作用、來源廣泛等優(yōu)點(diǎn)。植物蛋白以其不
可替代的優(yōu)點(diǎn)成為人們研究活性肽的主要來源。燕麥降壓肽即是從燕麥蛋白中得到的一種
活性多肽。燕麥麩皮是燕麥加工過程中的副產(chǎn)物，其中蛋白質(zhì)含量很高，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)燕麥
麩皮的研究主要集中在膳食纖維方面，對(duì)燕麥麩皮蛋自身的利用很少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種燕麥多肽及其制備方法與其應(yīng)用。
本發(fā)明所提供的燕麥多肽的制備方法，包括如下步驟 1)預(yù)處理將燕麥麩皮與水混合，調(diào)節(jié)pH為8. 5-9. 5，在溫度為50-6(TC條件下， 進(jìn)行超聲波預(yù)處理； 2)酶處理在經(jīng)過步驟1)預(yù)處理后的液體中加入堿性蛋白酶，在50-6(TC下攪拌
處理2-5小時(shí)；然后，加入風(fēng)味蛋白酶，在50-6(TC下攪拌處理1-2小時(shí)； 3)燕麥降壓肽的純化將步驟2)酶解后的液體離心取上清液，在上清液中加入
P _葡聚糖酶，中溫淀粉酶和糖化酶反應(yīng)2-4小時(shí)，過濾得到澄清液體；將澄清液體用大孔
吸附樹脂吸附純化得到含燕麥多肽的溶液。 所述步驟1)中，所述超聲預(yù)處理時(shí)間為30-50min ;所述超聲預(yù)處理的超聲波頻 率50kHz，功率176W。所述燕麥麩皮的大小為20-60目；所述燕麥麩皮水的重量比為
i : 8-i : 12。 所述步驟2)中，所述堿性蛋白酶的添加量為10000-70000U/g燕麥麩皮，優(yōu)選為 50000U/g燕麥麩皮；所述風(fēng)味蛋白酶的添加量為5000-15000U/g燕麥麩皮，優(yōu)選為10000U/ g燕麥麩皮。所述堿性蛋白酶和所述風(fēng)味蛋白酶可為四川新星化工有限公司產(chǎn)品，所述中溫 淀粉酶可為湖北楚軒化工制造有限公司產(chǎn)品。
3
所述步驟3)中，所述大孔吸附樹脂吸附純化的步驟包括將所述澄清液體加入到 以打孔吸附樹脂為填料的吸附柱中，然后用去離子水沖洗至洗脫液中沒有糖分和鹽分，最 后用乙醇溶液洗脫得到含燕麥多肽的溶液。所述大孔吸附樹脂為DA201-C吸附樹脂；所述 乙醇溶液的體積百分比濃度為50% -75%。所述澄清液體優(yōu)選按照DA201-C吸附樹脂的2 倍體積加入到柱中；所述乙醇溶液添加的體積優(yōu)選為柱體積的2倍 所述步驟3)中，P-葡聚糖酶的用量為15000-70000U/g燕麥麩皮，中溫淀粉酶的 用量為125-500U/g燕麥麩皮，糖化酶的用量為500-2000U/g燕麥麩皮；所述過濾的濾徑為 0. 5-0. 8踐。 上述方法中，還包括將含燕麥多肽溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至固含物為20% (可溶性固 形物含量)以上，冷凍干燥得到燕麥多肽干粉。 上述的方法制備的燕麥多肽即本發(fā)明所要保護(hù)的燕麥多肽。 本發(fā)明的方法將燕麥麩皮用單頻超聲波處理輔助酶法降解燕麥麩皮蛋白成為燕 麥多肽，通過板框過濾、樹脂吸附等手段將其分離提純，所得燕麥降壓肽89%的分子量在 1500Da以下，具有抑制ACE的活性，可以廣泛應(yīng)用于降壓保健食品或制備降壓藥物等領(lǐng)域。


圖1為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶對(duì)血壓的調(diào)節(jié)機(jī)理圖
圖2為本發(fā)明制備燕麥多肽的工藝流程圖；
圖3為75%乙醇洗脫純化燕麥降壓肽的曲線。
圖4為本發(fā)明制備的燕麥多肽相對(duì)分子量的分布 圖5為本發(fā)明制備的燕麥多肽(超聲處理)與ACE抑制肽活性比較圖；
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說 明，均為常規(guī)方法。 實(shí)施例1、燕麥降壓肽的制備
—、燕麥降壓肽的制備 提取燕麥降壓肽的工藝流程圖如圖2所示，具體步驟如下
1、燕麥麩皮處理 為了更多獲得燕麥降壓肽，燕麥麩皮選用20目到60目之間的成分(可以粉碎)， 凱氏定氮法測(cè)定其中蛋白含量可達(dá)25%。
2、預(yù)處理 將80g步驟l所述20目到60目的燕麥麩皮與去離子水按重量比1 : 8混合，調(diào) pH值到9. 0，在55t:水浴中進(jìn)行超聲波預(yù)處理(超聲波頻率50kHz，功率176W)，處理時(shí)間為 40min。 3、酶處理 預(yù)處理后測(cè)定液體pH值至8. 0-8. 5，加入堿性蛋白酶(購(gòu)自四川新星化工有限公 司，比活力為50萬U/g)，添加量為50000U/g燕麥麩皮。在溫度55t:條件下，繼續(xù)攪拌加 溫2小時(shí)；然后加入風(fēng)味蛋白酶(四川新星化工有限公司，比活力為50萬U/g)，添加量為10000U/g燕麥麩皮，在55t:繼續(xù)攪拌加溫1小時(shí)。 4、將步驟3酶解后的液體在4000rpm下離心10分鐘取上清液，在上清液中加入 P _葡聚糖酶(購(gòu)自銀川和氏璧生物技術(shù)有限公司，添加量為35000U/g燕麥麩皮)，中溫淀 粉酶(購(gòu)自湖北楚軒化工制造有限公司，添加量為250U/g燕麥麩皮)和糖化酶(購(gòu)自青島 北方霞光食品配料有限公司，添加量為1000U/g燕麥麩皮)反應(yīng)3小時(shí)，利用板框過濾機(jī) (濾徑為0. 5-0. 8 ii m)過濾，加入硅藻土助濾，得到棕色澄清液體。 5、將步驟4得到的澄清液體按照2 : 1倍體積加入到裝有DA201-C吸附樹脂的吸 附柱中，用去離子水沖洗至洗脫液沒有糖分和鹽分。再用75% (體積百分含量)的乙醇水 溶液洗脫，接收洗脫液體積為柱體積的2倍，吸附樹脂洗脫曲線如圖3所示。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮 至固含物(可溶性固形物含量)到20X，冷凍干燥得10g燕麥降壓肽。
二、燕麥肽的分子量分析 將步驟一獲得的燕麥降壓肽的相對(duì)分子量分布測(cè)定，采用HPLC法，測(cè)定色
譜條件安捷侖高效液相色譜儀1100 ;色譜柱TSKgel2000 SWXL體積排阻色譜柱
(300mmX7. 8mm);流動(dòng)相乙腈/冰醋酸/三氟乙酸45/55/0. 1 (v/v/v);檢測(cè):UV220nm ;
流速0. 5ml/min ;柱溫3(TC。結(jié)果表明如圖4所示，95%的多肽分子量在1500Da以下，是
較好的ACE抑制肽源。 實(shí)施例2、燕麥降壓肽的制備 —、燕麥降壓肽的制備 提取燕麥降壓肽的工藝流程圖如圖2所示，具體步驟如下
1、燕麥麩皮處理 為了更多獲得燕麥降壓肽，燕麥麩皮選用20目到60目之間的成分(可以粉碎)， 凱氏定氮法測(cè)定其中蛋白含量可達(dá)25%。
2、預(yù)處理 將80g步驟1所述20目到60目的燕麥麩皮與去離子水按重量比1 : 10混合，調(diào) pH值到9. 5，在5(TC水浴中進(jìn)行超聲波預(yù)處理(超聲波頻率50kHz，功率176W)，處理時(shí)間為 50min。 3、酶處理 預(yù)處理后測(cè)定液體pH值至8. 5，加入堿性蛋白酶(購(gòu)自四川新星化工有限公司， 比活力為50萬U/g)，添加量為10000U/g燕麥麩皮。在溫度6(TC條件下，繼續(xù)攪拌加溫5 小時(shí)；然后加入風(fēng)味蛋白酶(購(gòu)自四川新星化工有限公司，比活力為50萬U/g)，添加量為 15000U/g燕麥麩皮，在6(TC繼續(xù)攪拌加溫1小時(shí)。 4、將步驟3酶解后的液體在4000rpm下離心10分鐘取上清液，在上清液中加入 P _葡聚糖酶(購(gòu)自銀川和氏璧生物技術(shù)有限公司，添加量為35000U/g燕麥麩皮)，中溫淀 粉酶(購(gòu)自湖北楚軒化工制造有限公司，添加量為250U/g燕麥麩皮)和糖化酶(購(gòu)自青島 北方霞光食品配料有限公司，添加量為1000U/g燕麥麩皮)反應(yīng)4小時(shí)，利用板框過濾機(jī) (濾徑為0. 5-0. 8 ii m)過濾，加入硅藻土助濾，得到棕色澄清液體。 5、將步驟4得到的澄清液體按照2 : 1倍體積加入到裝有DA201-C吸附樹脂的吸 附柱中，用去離子水沖洗至洗脫液沒有糖分和鹽分。再用75% (體積百分含量)的乙醇水 溶液洗脫，接收洗脫液體積為柱體積的2倍。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至固含物(可溶性固形物含量)
5到20%，冷凍干燥得10g燕麥降壓肽。
二、燕麥肽的分子量分析 將步驟一獲得的燕麥降壓肽的相對(duì)分子量分布測(cè)定，采用HPLC法，測(cè)定色 譜條件安捷侖高效液相色譜儀1100 ;色譜柱TSKgel2000 SWXL體積排阻色譜柱 (300mmX7. 8mm);流動(dòng)相乙腈/冰醋酸/三氟乙酸45/55/0. 1 (v/v/v);檢測(cè):UV220nm ; 流速0. 5ml/min ;柱溫3(TC。結(jié)果表明，85%的多肽分子量在1500Da以下，是較好的ACE 抑制肽源。 實(shí)施例3、燕麥降壓肽的制備
—、燕麥降壓肽的制備 提取燕麥降壓肽的工藝流程圖如圖2所示，具體步驟如下
1、燕麥麩皮處理 為了更多獲得燕麥降壓肽，燕麥麩皮選用20目到60目之間的成分(可以粉碎)，
凱氏定氮法測(cè)定其中蛋白含量可達(dá)25%。
2、預(yù)處理 將80g步驟l所述20目到60目的燕麥麩皮與去離子水按重量比1 : 12混合，調(diào) pH值到8. 5，在5(TC水浴中進(jìn)行超聲波預(yù)處理(超聲波頻率50kHz，功率176W)，處理時(shí)間為 30min。 3、酶處理 預(yù)處理后測(cè)定液體pH值至8. 0，加入堿性蛋白酶(購(gòu)自四川新星化工有限公司， 比活力為50萬U/g)，添加量為70000U/g燕麥麩皮。在溫度5(TC條件下，繼續(xù)攪拌加溫3 小時(shí)；然后加入風(fēng)味蛋白酶(購(gòu)自四川新星化工有限公司，比活力為50萬U/g)，添加量為 5000U/g燕麥麩皮，在5(TC繼續(xù)攪拌加溫2小時(shí)。 4、將步驟3酶解后的液體在4000rpm下離心10分鐘取上清液，在上清液中加入 P-葡聚糖酶(購(gòu)自銀川和氏璧生物技術(shù)有限公司，添加量為35000U/g)，中溫淀粉酶(購(gòu) 自湖北楚軒化工制造有限公司，添加量為250U/g U/g燕麥麩皮)和糖化酶(購(gòu)自青島北方 霞光食品配料有限公司，添加量為1000U/g U/g燕麥麩皮)反應(yīng)2小時(shí)，利用板框過濾機(jī) (濾徑為0. 5-0. 8 ii m)過濾，加入硅藻土助濾，得到棕色澄清液體。 5、將步驟4得到的澄清液體按照2 : 1倍體積加入到裝有DA201-C吸附樹脂的吸 附柱中，用去離子水沖洗至洗脫液沒有糖分和鹽分。再用75% (體積百分含量)的乙醇水 溶液洗脫，接收洗脫液體積為柱體積的2倍。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至固含物(可溶性固形物含量) 到20%，冷凍干燥得10g燕麥降壓肽。
二、燕麥肽的分子量分析 將步驟一獲得的燕麥降壓肽的相對(duì)分子量分布測(cè)定，采用HPLC法，測(cè)定色 譜條件安捷侖高效液相色譜儀1100 ;色譜柱TSKgel2000 SWXL體積排阻色譜柱 (300mmX7. 8mm);流動(dòng)相乙腈/冰醋酸/三氟乙酸45/55/0. 1 (v/v/v);檢測(cè):UV220nm ; 流速0. 5ml/min ;柱溫3(TC。結(jié)果表明，80%的多肽分子量在1500Da以下，是較好的ACE 抑制肽源。 實(shí)施例4、本發(fā)明燕麥降壓肽抑制ACE活性的實(shí)驗(yàn) 將實(shí)施例1-3制備的燕麥降壓肽進(jìn)行ACE抑制活性的測(cè)定，參照Cushman等的方法略有改動(dòng)，具體方法如下所述 取5mmol/L HCl溶液80 ii 1 (pH8. 3，含0. 3mol/L NaCl)分別與40 ii 1實(shí)施例1、實(shí) 施例2或?qū)嵤├?制備的燕麥降壓肽混合，37t:水浴預(yù)熱5min后，分別加入0. 1U/mlACE (血 管緊張素轉(zhuǎn)化酶，Sigma公司)溶液10 ii 1，繼續(xù)37t:水浴30min，隨后加入lmol/L HCl溶 液200iU終止反應(yīng)，再加入1. 2ml乙酸乙酯均勻混合15s，以萃取反應(yīng)體系中的馬尿酸。離 心(4000rpm)10min后分別取出0. 9ml酯層溶液轉(zhuǎn)入另一試管中，8(TC烘干，并重新溶于2ml 去離子水中在228nm處測(cè)定吸光度。
ACE抑制率如下式計(jì)算 <formula>formula see original document page 7</formula>
0Da——ACE及ACE抑制肽都存在條件下的吸光度；
0Db——不存在ACE抑制肽條件下的吸光度；
0DC——ACE不參與反應(yīng)條件下的吸光度。 水浴處理按照與實(shí)施例l所述方法，在步驟2所述的預(yù)處理步驟將燕麥麩皮液在 水浴中震蕩搖勻，替代超聲處理，溫度、時(shí)間相同，其余步驟同實(shí)施例l，得到燕麥降壓肽，作 為水浴對(duì)照。 超聲處理酶解液按照與實(shí)施例1所述方法，但是將預(yù)處理的步驟中的超聲處理 步驟去除，將步驟3的酶處理步驟中加入堿性蛋白酶后直接進(jìn)行超聲處理，超聲處理的時(shí) 間為2小時(shí)40分鐘，溫度與酶解溫度相同，其余的步驟同實(shí)施例1，得到燕麥降壓肽，作為超 聲處理酶解液。 結(jié)果表明實(shí)施例1、實(shí)施例2或?qū)嵤├?制備的燕麥降壓肽的ACE抑制率遠(yuǎn)高于
水浴組，超聲處理酶解液組，其中實(shí)施例1制備的燕麥降壓肽(圖5中超聲波輔助酶解)的
ACE抑制率結(jié)果如圖5所示。 蛋白質(zhì)水解度測(cè)定方法甲醛滴定法。
<formula>formula see original document page 7</formula>
其中，h即是蛋白質(zhì)水解后每克蛋白中被裂解的肽鍵的毫摩爾數(shù)(mmol/g蛋白 質(zhì))，而ht。t則是指每克原料蛋白中肽鍵的毫摩爾數(shù)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲輔助酶解的蛋白質(zhì)水解度高于水浴和超聲處理酶解液，說明 超聲輔助酶解處理后游離氨基酸的釋放效果越好。 IC5。即ACE抑制率為50%時(shí)的多肽濃度，將冷凍干燥得到的燕麥降壓肽配成不同 濃度，測(cè)定其ACE抑制率，以抑制率為縱坐標(biāo)(X)，以log(多肽濃度)為橫坐標(biāo)繪制曲線， 通過回歸分析等到回歸方程用于計(jì)算ic5。。 IC5。是客觀評(píng)價(jià)ACE抑制肽活性強(qiáng)弱的常用指標(biāo)，通過對(duì)實(shí)施例1、實(shí)施例2或 實(shí)施例3制備的燕麥降壓肽的IC5。的測(cè)定，其中，實(shí)施例1制備的燕麥降壓肽ICs。值為 0. 291mg/ml，與已報(bào)道的其它食物蛋白源ACE抑制肽，如牛血槳蛋白(IC5。 = 0. 56mg/ml)， 蝦蛋白(IC5。 = 0. 98mg/ml)等相比，表明本發(fā)明的燕麥降壓肽具有較強(qiáng)的ACE抑制活性，這 說明施例1、實(shí)施例2或?qū)嵤├?制備的燕麥降壓肽具有更好的降血壓能力。
權(quán)利要求
一種制備燕麥多肽的方法，包括如下步驟1)預(yù)處理將燕麥麩皮與水混合，調(diào)節(jié)pH為8.5-9.5，在溫度為50-60℃條件下，進(jìn)行超聲波預(yù)處理；2)酶處理在經(jīng)過步驟1)預(yù)處理后的液體中加入堿性蛋白酶，在50-60℃下攪拌處理2-5小時(shí)；然后，加入風(fēng)味蛋白酶，在50-60℃下攪拌處理1-2小時(shí)；3)燕麥降壓肽的純化將步驟2)酶解后的液體離心取上清液，在上清液中加入β-葡聚糖酶，中溫淀粉酶和糖化酶反應(yīng)2-4小時(shí)，過濾得到澄清液體；將澄清液體用大孔吸附樹脂吸附純化得到含燕麥多肽的溶液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述步驟l)中，所述超聲預(yù)處理時(shí)間為30-50min ;所述超聲預(yù)處理的超聲波頻率50kHz，功率176W。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述步驟l)中，所述燕麥麩皮的大小為20-60目；所述燕麥麩皮水的重量比為l:8-i: 12。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l-3中任一所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述堿性蛋白 酶的添加量為10000-70000U/g燕麥麩皮，優(yōu)選為50000U/g燕麥麩皮；所述風(fēng)味蛋白酶的添 加量為5000-15000U/g燕麥麩皮，優(yōu)選為10000U/g燕麥麩皮。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l-4中任一所述的方法，其特征在于所述步驟3)中，所述大孔吸附 樹脂吸附純化的步驟包括將所述澄清液體加入到以打孔吸附樹脂為填料的吸附柱中，然后 用去離子水沖洗至洗脫液中沒有糖分和鹽分，最后用乙醇溶液洗脫得到含燕麥多肽的溶 液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l-5中任一所述的方法，其特征在于所述步驟3)中，P-葡聚糖酶的 用量為15000-70000U/g燕麥麩皮，中溫淀粉酶的用量為125-500U/g燕麥麩皮，糖化酶的用 量為500-2000U/g燕麥麩皮；所述過濾的濾徑為0. 5-0. 8 y m。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述大孔吸附樹脂為DA201-C吸附 樹脂；所述乙醇溶液的體積百分比濃度為50% -75%。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述方法中，還包括將含燕 麥多肽溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至可溶性固形物含量為20%以上，冷凍干燥得到燕麥多肽干粉。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的方法制備的燕麥多肽。
10. 權(quán)利要求9所述的燕麥多肽在制備降血壓藥物或降血壓保健食品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種燕麥多肽及其制備方法與應(yīng)用。該燕麥多肽的制備方法，包括如下步驟1)將燕麥麩皮與水混合，調(diào)節(jié)pH為8.5-9.5，在溫度為50-60℃條件下，進(jìn)行超聲波預(yù)處理；2)在預(yù)處理后的液體中加入堿性蛋白酶，在50-60℃下攪拌處理2-5小時(shí)；然后，加入風(fēng)味蛋白酶，在50-60℃下攪拌處理1-2小時(shí)；3)將酶解后的液體離心取上清液，在上清液中加入β-葡聚糖酶，中溫淀粉酶和糖化酶反應(yīng)2-4小時(shí)，過濾得到澄清液體；將澄清液體用大孔吸附樹脂吸附純化得到含燕麥多肽的溶液。該燕麥多肽具有抑制ACE酶的活性，可以廣泛應(yīng)用于降壓保健食品等領(lǐng)域。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，具有較高的純度和得率。
文檔編號(hào)C12P21/06GK101709321SQ20091024172
公開日2010年5月19日 申請(qǐng)日期2009年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月2日
發(fā)明者何聰芬, 王昌濤, 董銀卯, 趙華, 韓揚(yáng) 申請(qǐng)人:北京工商大學(xué)