專利名稱：：檢測待測植物樣本是否含有植原體第v組成員的方法及其專用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測待測植物樣本是否含有植原體第V組成員的方法及其專用試齊U盒。
背景技術(shù)：
：植原體(phytoplasma)，原稱類菌原體(mycoplasma—likeorganism,ML0)，為單細(xì)胞原核生物，無細(xì)胞壁，由生物膜包圍，它可引起多種病害。植原體屬于細(xì)菌界(Bacteria)，硬壁菌門(Firmicutes)，柔膜菌綱(Mollicutes)，非固醇菌原體目(Achol印lasmatales)，非固醇菌原體科(Achol印lasmataceae)。在1992年的第九屆國際菌原體系統(tǒng)大(InternationalOrganizationforMycoplasmology,10M)Jl,■出了用Hi本(Phytoplasma)作為一個(gè)新的屬名。在整個(gè)柔膜菌綱的分類鑒定中，16SrDNA是系統(tǒng)鑒定的首選標(biāo)記。之后，眾多研究者陸續(xù)根據(jù)16SrDNA序列結(jié)果將植原體分為若干16S組。根據(jù)最新分類研究，以植原體16SrDNA基因序列為對象進(jìn)行分析，將植原體分為28個(gè)組。其中，植原體第V組成員包括棗瘋病植原體、櫻桃致死黃化植原體、重陽木叢枝植原體等。尤其對于棗樹來講，在我國栽培范圍極廣，以山東、河北、山西、陜西、甘肅、安徽、浙江產(chǎn)量最多。在棗樹病害中，棗瘋病(JujubeWitches'Broom)發(fā)生普遍，并且由于其防治難度大，具有毀滅性，全國每年因棗瘋病致棗樹死亡帶來的損失達(dá)數(shù)億元。因此急需一種簡便快速的檢疫檢測方法，來有效的檢測植原體第V組病害，達(dá)到早期預(yù)防和控制的目的。PCR(PolymeraseChainReaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)是一種20世紀(jì)八十年代處發(fā)展起來的分子生物學(xué)技術(shù)，用于富集特定的DNA片段。它運(yùn)用從溫泉細(xì)菌中分離出的DNA聚合酶(DNAPolymerase)，通過變性、復(fù)性(退火)和延伸等三步反應(yīng)，模擬體內(nèi)DNA復(fù)制。能夠?qū)O微量的核酸在短時(shí)間內(nèi)迅速擴(kuò)增復(fù)制，獲得大量的目的DNA片段。實(shí)時(shí)熒光PCR是在常規(guī)PCR體系中加入了一條Taqman探針。Taqman探針5’端標(biāo)記有熒光分子，3’端標(biāo)有淬滅基團(tuán)。在PCR擴(kuò)增過程中，與模板DNA配對正確的Taqman探針在TaqDNA聚合酶的5’端外切酶活性作用下，將熒光分子切下，檢測熒光信號(hào)。實(shí)時(shí)熒光具有高靈敏度、快速的特點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種檢測待測植物樣本是否含有植原體第V組成員的方法及其專用試劑盒。本發(fā)明提供了用于檢測待測植物樣本是否含有植原體第V組成員的特異性引物對和特異性探針。所述特異性引物對是序列表的序列1所示核苷酸和序列表的序列2所示核苷酸組成的引物對。上游引物(F):5，-CAGTTCGTGTCGTGAGATGTTAGG-3，；下游引物(R):5，-TCGCTAAAGTCCCCACCATT-3，；所述特異性探針的核苷酸序列如序列表的序列3所示。特異性探針(P):5，-FAM-TAAGTCCTAAAACGAACGCAACCCCTGTC-TAMRA-3，。所述特異性引物對和/或所述特異性探針在制備檢測待測植物樣本是否含有植原體第V組成員的試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述植原體第V組成員具體可為棗瘋病植原體、櫻桃致死性黃花植原體或重陽木叢枝植原體。本發(fā)明還保護(hù)一種檢測待測植物樣本是否含有植原體第V組成員的試劑盒，包括所述特異性引物對和/或所述特異性探針。所述試劑盒具體可由所述特異性引物對和所述特異性探針組成。所述植原體第V組成員具體可為棗瘋病植原體、櫻桃致死性黃花植原體或重陽木叢枝植原體。本發(fā)明還保護(hù)一種檢測待測植物樣本是否含有植原體第V組成員的方法，是提取待測樣本的基因組DNA作為模板，用所述特異性引物和所述特異性探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，確定待測樣本是否含有植原體第V組成員。所述植原體第V組成員具體可為棗瘋病植原體、櫻桃致死性黃花植原體或重陽木叢枝植原體。所述實(shí)時(shí)熒光PCR的PCR反應(yīng)體系中，反應(yīng)起始時(shí)，序列表的序列1所示核苷酸的濃度具體可為0.3mM,序列表的序列2所示核苷酸的濃度具體可為0.9mM，所述特異性探針的濃度具體可為0.2mM；所述實(shí)時(shí)熒光PCR的參數(shù)具體可為50°C、2min；95°C、5min；95°C、15s，60°C、lmin，40個(gè)循環(huán)。用所述特異性引物對和特異性探針對待測植物樣品進(jìn)行檢測時(shí)，若結(jié)果有Ct值讀出并且陰性對照無Ct值，則可判斷該樣品攜帶有植原體第V組成員。本發(fā)明提供的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)1)檢測結(jié)果準(zhǔn)確性高在發(fā)明開發(fā)過程中，選取棗瘋病植原體(植原體第V組)、櫻桃致死性黃花植原體(植原體第V組)，重陽木叢枝植原體(植原體第V組)，以及泡桐叢枝植原體(植原體第I組)和杏褪綠卷葉植原體(植原體第X組)為對象，進(jìn)行特異性檢測，結(jié)果表明本發(fā)明檢測準(zhǔn)確性高。2)穩(wěn)定性及重現(xiàn)性高在用本發(fā)明檢測時(shí)，因?yàn)楸景l(fā)明基于模板數(shù)檢測，相比于普通PCR，檢測結(jié)果重復(fù)性好，穩(wěn)定性高。3)檢測方法安全應(yīng)用本發(fā)明探針及引物檢測時(shí)，無需進(jìn)行凝聚、染色等步驟，減少了試劑對人體的傷害，因此具有安全性。4)省時(shí)本發(fā)明基于實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，省去凝聚、染色等步驟，減少了檢測時(shí)間。5)檢測結(jié)果易于判斷本發(fā)明基于實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，檢測結(jié)果呈現(xiàn)為數(shù)字和圖形，排除了主觀因素，易于判斷分析。6)檢測靈敏度高應(yīng)用本發(fā)明檢測，具有較高的靈敏度，能夠滿足實(shí)際檢測檢驗(yàn)的需要。7)易于操作掌握其操作過程與普通PCR反應(yīng)操作相似，因此易于操作。8)應(yīng)用可應(yīng)用于檢疫、科研等領(lǐng)域，尤其是對高通量和高靈敏性有要求的領(lǐng)域。本發(fā)明公開的特異性引物對和特異性探針，可快速、方便、高靈敏度檢測出植物樣品是否攜帶或含有植原體第V組成員。檢測過程中無需核酸染料，因此還具有環(huán)保安全的優(yōu)點(diǎn)?？蓱?yīng)用于植物檢疫、植物保護(hù)、科研等領(lǐng)域。圖1為實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性；1棗瘋病植原體DNA；2櫻桃致死性黃花植原體DNA；3重陽木叢枝植原體DNA；4，5無反應(yīng)的泡桐叢枝植原體和杏褪綠卷葉植原體。圖2為棗瘋病植原體DNA梯度實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(圖中標(biāo)注為分子拷貝數(shù))。具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。棗瘋植原體(棗瘋病植原體)、泡桐叢枝植原體(泡桐叢枝病植原體)、重陽木叢枝植原體(重陽木叢枝病植原體)、櫻桃致死性黃花植原體(櫻桃致死黃花病植原體)和杏褪綠卷葉植原體(杏褪綠卷葉病植原體)均來自野外發(fā)病植物，并經(jīng)過了測序驗(yàn)證，其中棗瘋植原體的核苷酸序列如GENBANKACCESSIONNUMBER:FJ445390所示，泡桐叢枝植原體的核苷酸序列如GENBANKACCESSIONNUMBER:FJ263621所示，重陽木叢枝植原體的核苷酸序列如GENBANKACCESSIONNUMBER:EF432569所示，櫻桃致死性黃花植原體的核苷酸序列如GENBANKACCESSIONNUMBER31074425所示，杏褪綠卷葉植原體的核苷酸序列如GENBANKACCESSIONNUMBER:EU168758所示。ABIMix(ABI公司)；探針及引物(由大連寶生物公司合成)。7300實(shí)時(shí)熒光PCR儀(ABI公司)；ND-1000核酸/蛋白檢測儀(Thermal公司)。實(shí)施例1、試劑盒的制備試劑盒由如下特異性引物對和特異性探針組成特異性引物對上游引物(F)5'-CAGTTCGTGTCGTGAGATGTTAGG-3‘(序列表的序列1)；下游引物(R):5，-TCGCTAAAGTCCCCACCATT-3，(序列表的序列2)；特異性探針(P)5‘-FAM-TAAGTCCTAAAACGAACGCAACCCCTGTC-TAMRA-3‘(核苷酸序列為序列表的序列3)。實(shí)施例2、試劑盒的特異性將棗瘋病植原體(植原體第V組)、櫻桃致死性黃花植原體(植原體第V組)，重陽木叢枝植原體(植原體第V組)、泡桐叢枝植原體(植原體第I組)和杏褪綠卷葉植原體(植原體第X組)分別提取基因組DNA作為模板(陰性對照中，用水代替DNA模板)，用實(shí)施例1的試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，以確定試劑盒的特異性。實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的體系見表1，循環(huán)參數(shù)見表2。表1實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的體系A(chǔ)BIMix~~12.5uL上游引物(7.5mM)hi下游引物(7.5mM)^L<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>結(jié)果見圖1。從圖1可看出，試劑盒中的特異性引物對和特異性探針能夠檢測出同屬第V組的棗瘋病植原體DNA、櫻桃致死黃花植原體DNA和重陽木叢枝植原體；而屬于第I組的泡桐叢枝植原體和屬于第X組的杏褪綠卷葉植原體無擴(kuò)增(位于基線下方)，可見探針引物具有較好特異性。實(shí)施例3、試劑盒的靈敏性和穩(wěn)定性一、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備以棗瘋植原體基因組DNA為模板，用引物R16F2n:5，-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3，，R16F2:5，-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3，擴(kuò)增棗瘋病植原體16SrDNA片段，得到1.2kbPCR產(chǎn)物，克隆至PMDtm-IST載體(takara)，提取質(zhì)粒送北京諾賽生物技術(shù)有限公司測序驗(yàn)證，確定為目的質(zhì)粒(標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒)。采用ND-1000核酸/蛋白檢測儀測定濃度，并進(jìn)行10倍梯度稀釋。二、試劑盒的靈敏性10倍梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，分別用實(shí)施例1的試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR。實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的體系和循環(huán)參數(shù)同實(shí)施例2(反應(yīng)初始體系中分別含有1XIO8拷貝、1XIO7拷貝、1XIO6拷貝、1XIO5拷貝、1XIO4拷貝、1XIO3拷貝、1XIO2拷貝、1XIO1拷貝)。反應(yīng)結(jié)束后，以拷貝數(shù)以10為底的對數(shù)和Ct值關(guān)系作函數(shù)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，以確定試劑盒的靈敏性。構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.328X+37.99(其中y為Ct值，χ為拷貝數(shù)對數(shù)；標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)R2=0.998)。提取棗瘋病植原體的總DNA，進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別用實(shí)施例1的試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR。實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的體系和循環(huán)參數(shù)同實(shí)施例2。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線可知樣品中棗瘋病植原體的拷貝數(shù)。結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，采用本發(fā)明的試劑盒可檢測棗瘋植原體8.5Χ101拷貝。三、試劑盒的穩(wěn)定性對4種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(反應(yīng)初始體系中含有1XIO8拷貝1XIO5拷貝)分別用實(shí)施例1的試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，每個(gè)濃度重復(fù)檢測3次，通過實(shí)時(shí)熒光PCRCt值的平均值和變異系數(shù)來評(píng)價(jià)試劑盒的穩(wěn)定性。變異系數(shù)(CV)=測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差與其平均值的百分比。結(jié)果見表3。結(jié)果均能判斷為陽性，并且Ct值變異系數(shù)均小于5%，證明該試劑盒重復(fù)性好。表3實(shí)時(shí)熒光PCR重復(fù)性檢測<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>序列表<110>中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院<120>檢測待測植物樣本是否含有植原體第V組成員的方法及其專用試劑盒<130>CGGNARY92568<160>3<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1cagttcgtgtcgtgagatgttagg24<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>2tcgctaaagtccccaccatt20<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>3taagtcctaaaacgaacgcaacccctgtc29權(quán)利要求序列表的序列1所示核苷酸和序列表的序列2所示核苷酸組成的特異性引物對。2.核苷酸序列如序列表的序列3所示的特異性探針。3.權(quán)利要求1所述特異性引物對和/或權(quán)利要求2所述特異性探針在制備檢測待測植物樣本是否含有植原體第V組成員的試劑盒中的應(yīng)用。4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述植原體第V組成員為棗瘋病植原體、櫻桃致死性黃花植原體或重陽木叢枝植原體。5.一種檢測待測植物樣本是否含有植原體第V組成員的試劑盒，包括權(quán)利要求1所述特異性引物對和/或權(quán)利要求2所述特異性探針。6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒由權(quán)利要求1所述特異性引物對和權(quán)利要求2所述特異性探針組成。7.如權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于所述植原體第V組成員為棗瘋病植原體、櫻桃致死性黃花植原體或重陽木叢枝植原體。8.—種檢測待測植物樣本是否含有植原體第V組成員的方法，是提取待測植物樣本的基因組DNA作為模板，用權(quán)利要求1所述特異性引物和權(quán)利要求2所述特異性探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，確定待測植物樣本是否含有植原體第V組成員。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述植原體第V組成員為棗瘋病植原體、櫻桃致死性黃花植原體或重陽木叢枝植原體。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述實(shí)時(shí)熒光PCR的PCR反應(yīng)體系中，反應(yīng)起始時(shí)，序列表的序列1所示核苷酸的濃度為0.3mM，序列表的序列2所示核苷酸的濃度為0.9mM，所述特異性探針的濃度為0.2mM；所述實(shí)時(shí)熒光PCR的參數(shù)為50°C、2min；95°C、5min；95°C、15s，60°C、lmin，40個(gè)循環(huán)。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測待測植物樣本是否含有植原體第V組成員的方法及其專用試劑盒。本發(fā)明提供了特異性引物對和特異性探針。所述特異性引物對是序列表的序列1所示核苷酸和序列表的序列2所示核苷酸組成的引物對。所述特異性探針的核苷酸序列如序列表的序列3所示。本發(fā)明提供的方法，是以提取待測植物樣本的基因組DNA作為模板，用所述特異性引物和所述特異性探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，確定待測植物樣本是否含有植原體第V組成員。本發(fā)明公開的特異性引物對和特異性探針，可快速、方便、高靈敏度檢測出植物樣品是否攜帶或含有植原體第V組成員。檢測過程中無需核酸染料，因此還具有環(huán)保安全的優(yōu)點(diǎn)?？蓱?yīng)用于植物檢疫、植物保護(hù)、科研等領(lǐng)域。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101812447SQ20091024197公開日2010年8月25日申請日期2009年12月16日優(yōu)先權(quán)日2009年12月16日發(fā)明者侯立華,朱水芳,黃新申請人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院