專利名稱：一種植物耐低溫脅迫相關蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種植物耐低溫脅迫相關蛋白及其編碼基因在改變植物耐冷脅迫能 力中的應用。
背景技術(shù)：
植物生長在自然環(huán)境中，會受到各種各樣的不良因素的影響，主要包括生物脅迫 和非生物脅迫。前者主要是指各種病原微生物的入侵；后者則主要指鹽，干旱，低溫，高溫 等滲透脅迫。春去冬來，四季更替，溫度的變化不僅是影響植物生長發(fā)育的重要環(huán)境因子之 一，同時也是限制作物產(chǎn)量的主要非生物因素。很多農(nóng)作物的大量減產(chǎn)是由于低溫寒害造 成的，因此，研究植物響應低溫脅迫的生理生化反應及其分子機制，能夠為提高植物抵抗低 溫寒害的能力創(chuàng)造條件。植物由于其生長的固定性，為了在一定范圍的溫度條件下能夠正常的生長和發(fā) 育，當外界環(huán)境溫度發(fā)生變化時，植物自身會對這一變化作出反應，包括Ca2+信號的傳遞， 一系列冷誘導基因的表達，還有各種新成代謝上的變化。近幾年來，雖然有關植物如何響應 低溫分子機制研究已經(jīng)比較深入，但是我們?nèi)匀徊磺宄参锏降资侨绾胃兄蜏匦盘柌?遞低溫信號到核內(nèi)激活轉(zhuǎn)錄因子，進而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄或引起一系列生理生化反應。擬南芥是一種十字花科植物，由于其形態(tài)個體小，生長周期快，基因組小，重復序 列少，并且全部基因組測序已經(jīng)完成，且容易被人工誘變產(chǎn)生大量不同基因位點遺傳變異 突變植株，因此已成為一種典型的模式植物，廣泛用于植物遺傳學、發(fā)育生物學和分子生物 學的研究。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供植物耐低溫脅迫相關蛋白及其編碼基因在改變植物耐冷脅 迫能力中的應用。本發(fā)明通過一個冷敏感突變體，發(fā)現(xiàn)導致該突變體冷敏感的基因，我們發(fā)現(xiàn)它的 編碼蛋白的新功能，就是能夠調(diào)控冷脅迫引起的細胞死亡，即可以改變植物對冷脅迫的耐 受能力。本發(fā)明的植物耐低溫脅迫相關蛋白，即調(diào)控植物低溫細胞死亡相關蛋白AtLSDl， 來源于擬南芥(Arabidopsis thaliana)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中SEQ ID No 2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中SEQ ID No 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取 代和/或缺失和/或添加且與SEQ ID N2 :2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID Na 2 衍生的蛋白質(zhì)。其中，序列表中SEQ ID N2 :2是由183個氨基酸殘基組成。本發(fā)明提供的植物耐低溫脅迫相關基因，是調(diào)控溫度誘導的細胞死亡相 關基因，是在冷信號途徑上起作用的基因，名稱為AtLSDl (Arabidopsis thaliana lesionsimulating disease resistance〗)，該基因在擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫中的編號為At4g20380)，來源于哥倫比亞生態(tài)型的擬南芥，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID Na 1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID Na 2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID Na 1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功 能蛋白質(zhì)的DNA序列。序列表中序列1的DNA序列由2272個堿基組成，該基因的讀碼框為自5’端第1 位到第1880位堿基，含有7個內(nèi)含子，分別為自5’端第199位到第318位堿基；自5’端第 381位到第505位堿基；自5，端第635位到第723位堿基；自5，端第擬9位到第1317位 堿基；自5’端第1458位到第1557位堿基；自5’端第1630位到第1721位堿基；自5’端 第1794位到第1880位堿基。含有本發(fā)明基因的表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系和宿主菌及擴增AtLSDl中任 一片段的引物對均屬于本發(fā)明的保護范圍。其中，上游引物和下游引物之間的距離 在50到2000個堿基之間；該引物對其中的每一個引物的長度為15到25個堿基，如 引物 1:lsdl-R :5，-TCCGTTGATGAAAGCGGAAAGTCG-3，(SEQ ID Na 3)引物 2 :lsdl_F 5， -GGAATAGAGGAAGAATTTGGA-3， (SEQ ID Ns :4)。本發(fā)明還提供一種構(gòu)建低溫敏感型擬南芥的方法，是將擬南芥中的植物耐低溫脅 迫相關蛋白滅活；所述植物耐低溫脅迫相關蛋白為權(quán)利要求1所述的蛋白；所述滅活為點 突變、缺失或插入突變擬南芥中的植物耐低溫脅迫相關蛋白的編碼基因。利用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體，將本發(fā)明的AtLSDl基因 敲除(或沉默)后，植物表現(xiàn)為低溫敏感。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及 篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記或具有抗性的抗生素標記物。 被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物。本發(fā)明的基因為培育耐低 溫植物新品種提供了基因資源，具有潛在的應用價值。下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。


圖1為冷敏感突變體lsdl-3的表型分析和圖位克隆圖2為ATLSDl調(diào)控溫度依賴的細胞死亡驗證
具體實施例方式我們通過篩選擬南芥EMS突變體庫，發(fā)現(xiàn)了一個冷敏感突變體，克隆得到了這個 在冷信號途徑上起作用的基因。我們分析了該基因的生理生化功能，進一步了解了植物感 知及應答環(huán)境溫度的分子機制。以下述實施例說明其獲得方法及其功能。實施例1、AtLSDl的圖位克隆(1)突變體chs4的獲得和表型分析我們通過篩選擬南芥EMS突變體庫，發(fā)現(xiàn)了 2個冷敏感突變體，原來命名為chs4_l 和chs4-3。這兩個突變體是同一個等位基因。我們發(fā)現(xiàn)突變體在低溫條件下出現(xiàn)細胞死 亡，葉片萎蔫的表型(圖1A，圖2A)。(2)突變體的圖位克隆
為了克隆得到基因，我們將突變體與另一生態(tài)型Ler雜交后得到F2代，挑選低溫 敏感植株構(gòu)建圖位克隆的群體。利用BSA，初步將該突變基因定位第四條染色體的中部，經(jīng) 過SSLP和CAP或者dCAP標記進一步定位分析，把突變基因精細定位于F18F4與T7J7之 間(圖1B)，利用測序分析發(fā)現(xiàn)，在chs4-l中，突變堿基位于at4g20380(以前報道過的基 因ATLSD1)最后一個外顯子和內(nèi)含子的交接處，由G-A，造成了剪切錯誤，致使在chs4-l中， mRNA多出將近90bp (圖1C)。在chs4_3中，突變堿基發(fā)生在第七個外顯子上，由C-T。這些 突變造成了 at4g20380蛋白的不穩(wěn)定，在突變體里，ATLSDl蛋白含量表達很低(圖1D)。為 了進一步證實是由于at4g20380的突變造成了 chs4_l的冷敏感表型，我們做了互補實驗， 將野生型基因轉(zhuǎn)入突變體植株，能夠互補突變體的表型，因此進一步確定了該突變體確實 是由于ATLSDl發(fā)生突變所致。因此我們將chs4-l重新命名為lsdl-3(圖1 E)。上述突變 體的鑒定，鑒定chs4-l突變位點所用引物為Isdl-R TCCGTTGATGAAAGCGGAAAGTCG(Taql)； Isdl-F :GGAATAGAGGAAGAATTTGGA。實施例2、ATLSDl調(diào)控溫度依賴的細胞死亡在低溫條件下突變體體內(nèi)有大量細胞死亡，同時誘導表達了抗病基因PRl和冊2， 并且積累了高水平的SA。(1)用臺盼藍染色液染色，在體視鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，低溫處理之后，lsdl-3的葉片有 大量細胞死亡(圖2A)；(2)Northern blot 用1Trizol提取正常條件下和低溫條件下野生型和突變體的 RNA。以IX MOPS為電泳緩沖液，12%甲醛變性膠進行電泳分離。用10XSSC將RNA轉(zhuǎn)移到尼 龍膜上，紫外交連后用于雜交。雜交過程選用Church Buffer, PCR擴增探針之后用同位素 α -32P-dCTP進行標記，雜交16 h之后，洗膜三次，分別用2 X SSC, 0. 1 % SDS, 15min ； 1 X SSC, 0. SDS，65°C下 15min，0. 5 X SSC, 0. SDS，65°C下 15min ；最后用 X 光片顯影，結(jié)果顯示 Chs4-1體內(nèi)的rai，PR2大量誘導表達(圖2B)。報告基因I3Rl:⑶S染色也證明在lsdl_3 體內(nèi)確實PRl表達高于WT (圖2C)。(3)甲醇提取WT和lsdl-3體內(nèi)水楊酸，環(huán)己烷和乙酸乙酯萃取之后風干，乙腈溶 解之后用HPLC測定，結(jié)果顯示在lsdl-3中，不論是游離SA還是SAG，都高于WT (圖2D)。(4) lsdl-3在低溫條件下也表現(xiàn)出細胞死亡。綜上所述，我們得出結(jié)論=ATLSDl調(diào) 控溫度依賴的細胞死亡。序列表<160>4<210>1<211>2272<212>DNA<213> 擬南芥屬擬南芥(Arabidopsis thaiiana(L.)HEYNH.)<400>1cttacgcgtc atgtaaaaaa aaaagaagcg taaattacga aaaacagaga gataaatccg60ggcattgaga ttttggagat agagagagag aaaaatcgaa atctattgtc tatctcctca120atttggattg gattttctgc atatcatcgc tctagctttc gcgggttttg gattcgattc180cttacccttc tccaatcggt aagaacaagc tccaaagttt gttccttttt ttcaattttc240
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〈213〉擬南芥屬擬南芥(Arabidopsi
<400>2
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thaliana(L. )HEYNH.)0083]Met Gln AspGlnLeuValHisGlyCysArg AsnLeuLeuMetTyr Pro0084]1510150085]Arg Gly AlaSerAsnValArgCysAlaLeuCysAsnThrlieAsnMet0086]2025300087]Val Pro ProProProProProHisAspMetAlaHislielieCysGly0088]3540450089]Gly Cys ArgThrMetLeuMetTyrThrArgGlyAlaSerSerValArg0090]5055600091]Cys Ser CysCysGlnThrThrAsnLeuValProAlaHisSerAsnGln0092]657075800093]Val Ala HisAlaProSerSerGlnValAlaGlnlieAsnCysGlyHis0094]8590950095]Cys Arg ThrThrLeuMetTyrProTyrGlyAlaSerSerValLysCys0096]1001051100097]Ala Val CysGlnPheValThrAsnValAsnMetSerAsnGlyArgVal0098]1151201250099]Pro Leu ProThrAsnArgProAsnGly ThrAlaCysProProSerThr0100]1301351400101]Ser Thr SerThrProProSerGlnThrGlnThrValValValGluAsn0102]1451501551600103]Pro Met SerValAspGluSerGlyLysLeuValSerAsnValValVal0104]1651701750105]Gly Val ThrThrAspLysLys0106]1800107]<210>30108]<211>240109]<212>DNA0110]<213>人工序列0111]<220>0112]<223>0113]<400>30114]TCCGTTGATGAAAGCGGAAAGTCG200115]<210>40116]<211>210117]<212>DNA0118]<213>人工序列0119]<220>0120]<223>0121]<400>4
GGAATAGAGGAAGAATTTGGA權(quán)利要求
1.植物耐低溫脅迫相關蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQID No . 2的氨基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQID N2 . 2氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和 /或缺失和/或添加且具有SEQ ID No 2的氨基酸殘基序列相同活性的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述的植物耐低溫脅迫相關蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的植物耐低溫脅迫相關蛋白的編碼基因，其核苷酸序列是下列 核苷酸序列之一1)序列表中SEQID Na 1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQID No 2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQID N2 :1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋 白質(zhì)的DNA序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的表達載體
5.含有權(quán)利要求2或3所述基因的宿主菌。
6.含有權(quán)利要求2或3所述基因的轉(zhuǎn)基因細胞系。
7.擴增權(quán)利要求2或3所述基因任一片段的引物對。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的引物對，其特征在于所述引物對為序列表中SEQID No 3 和 SEQ ID Na :4。
9.權(quán)利要求2或3所述基因在改變植物耐低溫脅迫能力中的應用。
10.一種構(gòu)建低溫敏感型擬南芥的方法，是將擬南芥中的植物耐低溫脅迫相關蛋白滅 活；所述植物耐低溫脅迫相關蛋白為權(quán)利要求1所述的蛋白；所述滅活為點突變、缺失或插 入突變擬南芥中的植物耐低溫脅迫相關蛋白的編碼基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物耐低溫脅迫相關蛋白及其編碼基因與應用。該蛋白是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQ ID №.2氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有SEQ ID №2的氨基酸殘基序列相同活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的基因為培育耐低溫植物新品種提供了基因資源，具有潛在的應用價值。
文檔編號C12N15/63GK102101882SQ200910241990
公開日2011年6月22日 申請日期2009年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月18日
發(fā)明者楊淑華, 黃小貞 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學