專利名稱：檢測待測水稻是否為科豐6號轉(zhuǎn)基因水稻的方法及其專用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測待測水稻是否為科豐6號轉(zhuǎn)基因水稻的方法及其專用試劑
背景技術(shù)：
水稻是我國乃至全世界最重要的糧食作物之一，是世界上食用人口最多、歷史最悠久的農(nóng)作物。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)正廣泛地應(yīng)用于農(nóng)作物品質(zhì)改良，已有多個轉(zhuǎn)基因水稻品系進(jìn)行了環(huán)境釋放，申請商業(yè)化種植?？曝S6號是轉(zhuǎn)雙價抗蟲基因的轉(zhuǎn)基因水稻品系，所導(dǎo)入外源基因是Bt/CpTI。對轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行品系特異性檢測是對轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行監(jiān)督管理，保障其健康發(fā)展的重要技術(shù)基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)基因植物的外源插入片段的邊界序列是轉(zhuǎn)基因植物品系最重要的分子特征之一，它代表了一個轉(zhuǎn)基因事件，一個品系。因此，檢測邊界序列即品系特異性是保障轉(zhuǎn)基因安全的重要手段。 在轉(zhuǎn)基因生物安全受到越來越廣泛關(guān)注的當(dāng)今社會，以生物技術(shù)為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因檢測方法成了監(jiān)管轉(zhuǎn)基因植物及食品的有效手段。實時熒光PCR(Real time PCR)就是其中一個最常用最有效的方法。實時熒光PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針，通過對PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析，具有高特異性和高靈敏度的優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測待測水稻是否為科豐6號轉(zhuǎn)基因水稻(轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號)的方法及其專用試劑盒。 本發(fā)明提供了針對轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號外源插入片段邊界序列的特異性引物對和特異性探針。 所述特異性引物對是由序列表的序列1所示核苷酸和序列表的序列2所示核苷酸
組成的引物對。 特異性引物對 上游引物5， -ACGTAGTACGTACCGCCGTG-3';序列表的序列1 ;
下游引物5， -AGTGCAGATGCATGAATCGC-3';序列表的序列2。 所述特異性探針可為TaqMan熒光探針，其核苷酸序列如序列表的序列3所示。TaqMan熒光探針是一種寡核苷酸探針，報告熒光基團連接在探針的5'末端，淬滅熒光基團連接在探針的3'末端。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5' _3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。
所述特異性探針的5'端標(biāo)記有報告熒光基團，3'端標(biāo)記有淬滅熒光基團。所述報告熒光基團可為Fam(FAM) 、 Hex (HEX) 、 Tet (TET) 、 Joe (JOE) 、 Vic (VIC) 、 Fite(FITE)、Cy3 (CY3)或Cy5 (CY5)。所述淬滅熒光基團可為Tamra (TAMRA) 、 Rox (R0X) 、 Dabcy (DABCY)、Bhql (BHQ1)或Bhq2 (BHQ2)。特異性探針的核苷酸序列5' -CCGCGCGTTGTACTGAGAACCA-3'。所述特異性探針中，所述報告熒光基團具體可為FAM熒光基團，所述淬滅熒光基團具體可為TAMRA熒光基團。 所述特異性引物對和/或所述特異性探針可應(yīng)用于制備檢測待測水稻是否為轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號的試劑盒。 本發(fā)明同時保護一種檢測待測水稻是否為轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號的試劑盒，它包括所述特異性引物對和/或所述特異性探針。 所述試劑盒可應(yīng)用于檢測待測水稻是否為轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號。
本發(fā)明同時保護一種檢測待測水稻是否為轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號的方法，是以待測水稻的基因組DNA(總DNA)為模板，其特征在于所述方法為用所述特異性引物對和所述特異性探針進(jìn)行實時熒光PCR檢測，確定待測水稻是否為轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號。
所述實時熒光PCR的PCR體系中，反應(yīng)起始時，所述特異性引物對中的兩條引物的濃度均可為0. 2 ii mol/L，所述特異性探針的濃度可為0. 1 ii mol/L。 所述實時熒光PCR的參數(shù)具體如下5(TC、2min ;95°C、10min ;95 °C、 15s，60°C、lmin，共40個循環(huán)。 本發(fā)明提供的特異性引物對和特異性探針是根據(jù)轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號外源插入片段的邊界序列設(shè)計的，檢測特異性好，用于檢測實時熒光PCR靈敏性高。本發(fā)明提供的檢測方法，準(zhǔn)確性高、反應(yīng)靈敏，所需時間短。本發(fā)明提供的試劑盒使用非常方便。本發(fā)明提供的特異性引物對、特異性探針、試劑盒和方法，可以快速檢測待測水稻是否為轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號，為轉(zhuǎn)基因安全提供好了保證。


圖1為實時熒光PCR檢測品系特異性結(jié)果；1 :科豐6號。
圖2為本發(fā)明檢測方法靈敏度實驗結(jié)果。
具體實施例方式
以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗試劑，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。 轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號(GM0+)(轉(zhuǎn)CpTI基因水稻)中國檢驗檢疫科學(xué)研究院；戎俊，宋志平，蘇軍，夏輝，王鋒，盧寶榮.Bt/CpTI轉(zhuǎn)基因稻及其非轉(zhuǎn)基因親本對照在間隔種植條件下的轉(zhuǎn)基因漂移.生物多樣性，2006，14(4) :309-314?？曝S6號由中國水稻研究所王渭霞提供，是1994年由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所王鋒和中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所朱禎共同培育的。 轉(zhuǎn)基因水稻品系Bt63 :中國檢驗檢疫科學(xué)研究院；趙衛(wèi)東，鄭文杰，賀艷.熒光PCR方法定性和定量檢測BT63轉(zhuǎn)基因大米[J].食品研究與開發(fā)，2009， (03) :133-135。
非轉(zhuǎn)基因水稻品系明恢86(GM0-):中國檢驗檢疫科學(xué)研究院；張建新，鄭家團，謝華安，羅家密，黃顯波，鄧則勤，吳蘭英.水稻新種質(zhì)明恢86及其系列組合的選育研究[J].植物遺傳資源科學(xué)，2001， (01) :32-36。。 轉(zhuǎn)基因番茄品系華番1號中國檢驗檢疫科學(xué)研究院；黃文勝，陳紅運，趙文軍，等.轉(zhuǎn)基因延熟番茄"華番一號"的品系特異性檢測方法[J].植物檢疫，2005，19(6):321-325。 轉(zhuǎn)基因棉花品系中棉41 :中國檢驗檢疫科學(xué)研究院；劉生榮，夏志明，劉黨培.雙價抗蟲棉中棉所41豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)性及其簡化栽培技術(shù)研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2005， (03):166-168。 轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米品系BVLA430101 :中國檢驗檢疫科學(xué)研究院；Rumei Chen，Guangxing Xue， Yunliu Fan et al. ， Transgenic maize plants expressing af皿galphytase gene. Transgenic Res (2008) 17 :633-643。
實施例1、試劑盒的制備 根據(jù)科豐6號中外源插入片段的邊界序列設(shè)計篩選特異性引物對和特異性探針，用于制備試劑盒。 試劑盒由如下特異性引物對和特異性探針(T叫Man探針)組成。
特異性引物對 RB-F(上游引物)5， -ACGTAGTACGTACCGCCGTG-3';
RB-R (下游引物)5 ， -AGTGCAGATGCATGAATCGC-3'。 特異性探針5'端用報告熒光基團FAM標(biāo)記，3'端用淬滅熒光基團TAMRA標(biāo)記，核苷酸序列為5' -CCGCGCGTTGTACTGAGAACCA-3'。
實施例2、試劑盒的特異性檢測 用實施例1制備的試劑盒分別檢測科豐6號、明恢86、華番1號、Bt63、中棉41和BVLA430101，以驗證試劑盒的特異性。每個樣品采用相同的檢測方法，包括樣本總DNA的提取和實時熒光PCR兩個步驟。
—、樣品總DNA的提取 1、取樣品葉片約0. lg于研缽中，加入液氮迅速研磨至粉末狀。 2、將葉片粉末迅速轉(zhuǎn)入到事先加入700 ii 1 CTAB緩沖液的2ml離心管中，輕輕混
勻后，65t:水浴保溫30分鐘。每隔十分鐘小心搖晃混勻。 3、取出離心管，待冷至室溫后(25 °C )，加入等體積酚(350 y1)/氯仿(350 iU) 700 iil 。上下顛倒充分混合，抽提5分鐘。 4、室溫下，12000rpm離心10分鐘，用剪去頭部的lml槍頭將上清轉(zhuǎn)移到另一個新的離心管中。加2iU RNaseA(10mg/ml)。 5、加入與上清等體積的氯仿700 ii 1，上下顛倒充分混合，抽提5分鐘。 6、室溫下，12000rpm離心10分鐘，吸取上清到另一新的離心管中。 7、加入等體積的異丙醇(700 ii 1)，充分混勻，常溫放置10分鐘后可見沉淀。為沉
淀完全，可在_201:放置1-2小時。 8、室溫下，12000rpm離心10分鐘，沉淀積于管底。棄盡上清液。
9、加入700 iil 70% (體積百分含量)乙醇水溶液清洗30分鐘。
10、倒去離心管中的乙醇水溶液，使DNA沉淀在管中自然晾干。
11、加入適量TE(50iU)溶解，放入-2(TC冰箱保存?zhèn)溆谩?
二、實時熒光PCR 實時熒光PCR反應(yīng)體系將12. 5u 1 AB TaqMan Gene Expression Master Mix、
5iilDNA模板、5ii1滅菌超純水、1 iU試劑盒中的上游引物(RB-F) 、1 iU試劑盒中的下游引
物(RB-R)禾P 0. 5iU試劑盒中的特異性探針混合，得到25 iU的反應(yīng)體系；反應(yīng)體系中，反
應(yīng)初始時，上下游引物的濃度均為0. 2iimol/L，探針的濃度為0. liimol/L。 實時熒光PCR反應(yīng)參數(shù)50。C、2min ;95。C、10min ;95。C 、 15s， 60°C 、 lmin，共40個循環(huán)。 反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴增曲線判定結(jié)果。 結(jié)果見圖1。只有科豐6號有熒光信號，其他樣本均無熒光信號。
實施例3、試劑盒的靈敏度檢測 以科豐6號種子粉末和明恢86種子粉末為試材，將兩種種子粉末不同配比混合， 得到系列樣本(科豐6號種子粉末在樣本中所占的重量百分含量依次為5% 、 1 % 、0. 5% 、 0. 1%和0. 01% )。 提取各個樣本的總DNA，以20ng總DNA為模板進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)。樣品總DNA 的提取和實時熒光PCR的方法同實施例2。 結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，本發(fā)明的方法至少可檢測0. 01%的轉(zhuǎn)基因水稻品系 科豐6號(2X10—3ng)。序列表〈110〉中國檢驗檢疫科學(xué)研究院〈120〉檢測待測水稻是否為科豐6號轉(zhuǎn)基因水稻的方法及其專用試劑盒〈130〉CGGNARY92748〈160>3〈210>1〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>1acgtagtacg taccgccgtg 20〈210>2〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>2
agtgcagatg catgaatcgc 20 <210>3 〈211>22 〈212〉DNA <213>人工序列 〈220〉 〈223〉 〈400>3 ccgcgcgttg tactgagaac ca 2權(quán)利要求
序列表的序列1所示核苷酸和序列表的序列2所示核苷酸組成的特異性引物對。
2. 核苷酸序列如序列表的序列3所示的特異性探針。
3. 如權(quán)利要求2所述的特異性探針，其特征在于所述特異性探針為T叫Man熒光探 針，所述特異性探針的5'端標(biāo)記有FAM熒光基團，3'端標(biāo)記有TAMRA熒光基團。
4. 如下(a)或(b)在制備檢測待測水稻是否為轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號的試劑盒中的 應(yīng)用(a) 權(quán)利要求1所述特異性引物對和/或權(quán)利要求2所述特異性探針；(b) 權(quán)利要求1所述特異性引物對和/或權(quán)利要求3所述特異性探針。
5. —種檢測待測水稻是否為轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號的試劑盒，它包括如下(c)或(d):(c) 權(quán)利要求1所述特異性引物對和/或權(quán)利要求2所述特異性探針；(d) 權(quán)利要求1所述特異性引物對和/或權(quán)利要求3所述特異性探針。
6. 權(quán)利要求5所述試劑盒在檢測待測水稻是否為轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號中的應(yīng)用。
7. —種檢測待測水稻是否為轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號的方法，是以待測水稻的基因組 DNA為模板，其特征在于所述方法為如下(e)或(f)(e) 用權(quán)利要求1所述特異性引物對和權(quán)利要求2所述特異性探針進(jìn)行實時熒光PCR 檢測，確定待測水稻是否為轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號；(f) 用權(quán)利要求1所述特異性引物對和權(quán)利要求3所述特異性探針進(jìn)行實時熒光PCR 檢測，確定待測水稻是否為轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述實時熒光PCR的PCR體系中，反應(yīng)起 始時，所述特異性引物對中的兩條引物的濃度均為0. 2 ii mol/L，所述特異性探針的濃度為 0. 1 ii mol/L。
9. 如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述實時熒光PCR的參數(shù)如下5(TC、 2min ;95。C、10min ;95。C、 15s，60°C、lmin，共40個循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測待測水稻是否為科豐6號轉(zhuǎn)基因水稻的方法及其專用試劑盒。本發(fā)明提供了針對轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號外源插入片段的邊界序列的特異性引物對和特異性探針。所述特異性引物對是序列表的序列1所示核苷酸和序列表的序列2所示核苷酸組成的引物對。所述特異性探針的核苷酸序列如序列表的序列3所示。本發(fā)明提供的方法，是以待測水稻的總DNA為模板，用所述特異性引物和所述特異性探針進(jìn)行實時熒光PCR檢測，確定待測水稻是否為轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號。本發(fā)明提供的試劑盒，包括所述特異性引物對和所述特異性探針。本發(fā)明提供的特異性引物對、特異性探針、試劑盒和方法，可以快速檢測待測水稻是否為轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號，為轉(zhuǎn)基因安全提供好了保證。
文檔編號C12Q1/68GK101724699SQ20091024199
公開日2010年6月9日 申請日期2009年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月18日
發(fā)明者張琰, 朱水芳, 黃新 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院