專利名稱：一種臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞爬片分離的方法
一種臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞爬片分離的方法本發(fā)明涉及利用干細(xì)胞的趨化特性，通過(guò)讓干細(xì)胞爬片方式分離的方法，特別是關(guān)于一種臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞爬片分離的方法。間充質(zhì)干細(xì)胞(英文mesenchymal stem cells,簡(jiǎn)稱MSCs)是干細(xì)胞的一種類
型，具備干細(xì)胞的兩個(gè)重要特征很強(qiáng)的自我增殖能力和多分化潛能。MSCs起源于中 胚層，理論上講，它可以向其它中胚層組織分化。近期研究表明，在適宜的體內(nèi)或體外 環(huán)境下MSCs不僅可以分化為中胚層來(lái)源的間質(zhì)組織，還保持有內(nèi)胚層的分化潛能，可 分化為神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞等。近年來(lái)，人們對(duì)MSCs的生物學(xué)特性和潛在的臨床應(yīng)用的認(rèn)識(shí)有了顯著的提 高。MSCs具有高度的分化潛能，易于分離培養(yǎng)和擴(kuò)增，易于外源基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)，易于 獲得、移植且可避免排斥反應(yīng)，使其具有重要的研究和應(yīng)用前景，特別在細(xì)胞治療和基 因治療中有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。其中也包括間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療白血病、糖尿病、 燒傷、紅斑狼瘡、肝硬化，以及神經(jīng)疾病如帕金森氏癥、脊髓損傷和心臟病等方面的疾 病，并都有明顯的療效。MSCs廣泛分布于胎兒的胎肝、乳牙、臍帶、臍帶血和成體的骨髓、骨膜、松 骨質(zhì)、脂肪、滑膜、骨骼肌中。其中從胎兒身體的組織中分離獲取MSCs有悖于倫理道 德，很少應(yīng)用；臍帶來(lái)自于胎兒生產(chǎn)后的廢棄物，從臍帶中獲取MSCs，資源豐富、質(zhì) 量高、較純凈，日益成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)；從成人身體組織中獲取MSCs細(xì)胞數(shù)量及增 殖分化潛能隨年齡的增大而下降，病毒感染率較高，且供者M(jìn)SCs的采集過(guò)程存在一定 痛苦，致使來(lái)源受到限制，很少采用。因此，臍帶成為MSCs的理想來(lái)源。隨著醫(yī)學(xué)研 究的進(jìn)一步發(fā)展，MSCs已經(jīng)用于治療多種疾病，預(yù)計(jì)在不久的將來(lái)還會(huì)有干細(xì)胞藥物面 世，干細(xì)胞生產(chǎn)將步入產(chǎn)業(yè)化。因此，這就要求必須嚴(yán)格控制干細(xì)胞的生產(chǎn)過(guò)程，確保 干細(xì)胞產(chǎn)量及其功能的穩(wěn)定性，在保證后期使用效果的前提下，充分利用有限的資源。目前，通常采用酶消化法從臍帶組織中獲取MSCs，多使用膠原酶，其原理為 細(xì)胞外含有多種胞外蛋白將細(xì)胞間粘連起，可用膠原酶消化，使動(dòng)物組織細(xì)胞間的膠原 纖維和胞外蛋白酶解，獲得單個(gè)細(xì)胞。但膠原酶消化過(guò)度會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞表面一些生活物質(zhì) 的改變進(jìn)而影響細(xì)胞活力，對(duì)細(xì)胞具有損傷作用。對(duì)酶消化臍帶組織的時(shí)間有一定的要 求，消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)影響破壞所得細(xì)胞的活性，消化時(shí)間過(guò)短又會(huì)影響細(xì)胞得率。加之 待消化的臍帶組織又不是一個(gè)完全均一的體系，很難保證所有細(xì)胞消化程度的統(tǒng)一性。 因此也很難把握最佳的消化時(shí)間，影響了所得細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量，進(jìn)而影響以后的研究 及使用。另由于現(xiàn)有膠原酶來(lái)源于動(dòng)物內(nèi)臟，應(yīng)用酶消化法在分離培養(yǎng)時(shí)，存在動(dòng)物源 蛋白和動(dòng)物源病原物的污染，增加了臨床應(yīng)用干細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)。[發(fā)明內(nèi)容]本發(fā)明的目的在于克服以上技術(shù)的不足，而提出不采用消化酶的一種臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞爬片分離的方法，其不采用消化酶，避免了 MSCs分離過(guò)程中，消化酶對(duì) 臍帶MSCs引入動(dòng)物源蛋白和動(dòng)物源病原物的污染風(fēng)險(xiǎn)，且最大限度的保持了干細(xì)胞原 有的生物特性和活性，細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，有利于其在后期研究和臨床應(yīng)用中發(fā)揮更明顯 穩(wěn)定的作用。本發(fā)明提供一種臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞爬片分離的方法，該方法是由下述步驟 組成⑴首先取新生兒的臍帶，由8g的NaCl、0.2g的KC1、1.15g的Na2HPO4、0.2g 的KH2PO4用水定容為IL的方法制作而成磷酸緩沖液反復(fù)沖洗干凈，去除殘留的血液， 獲得干凈臍帶；(2)將干凈的臍帶粉碎，獲得大量臍帶組織塊；(3)再將獲得的臍帶組 織塊濾過(guò)孔徑1.5mm的粗濾網(wǎng)，收集粗濾網(wǎng)下的臍帶組織塊，去掉不符合要求的大臍帶 組織塊，獲得直徑小于等于1.5mm的小臍帶組織塊；(4)再將獲得的小臍組織帶塊濾過(guò) 200目濾網(wǎng)，收集200目濾網(wǎng)上的臍帶組織塊，去掉不符合要求的過(guò)小的臍帶組織塊，獲 得直徑為l-1.5mm多個(gè)臍帶組織塊；(5)直徑為l-1.5mm臍帶組織塊在200目濾網(wǎng)上浙 干液體后，將200目濾網(wǎng)上臍帶組織塊接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中；(6)不加培養(yǎng)液，直接放置 于5%C02、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)，靜置三小時(shí)；(7)然后加入含20%牛血清、lOng/mL EGF的 D-MEM/F12培養(yǎng)液5mL，置于5%C02、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，五天后，在培養(yǎng)皿中 臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞增生達(dá)到80%融合；(8)胰蛋白酶消化先用磷酸緩沖液清洗培 養(yǎng)皿兩次，每次用量5mL，吸棄洗液，吸取ImL的含0.25%胰蛋白酶和0.1% EDTA的磷 酸緩沖液，加入到培養(yǎng)皿內(nèi)，消化3-5分鐘，再將5mL含了 20%牛血清、10ng/mL EGF 的D-MEM/F12培養(yǎng)液加入到培養(yǎng)皿中，反復(fù)吹打，臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)入消化液 中；(9)消化液經(jīng)200目濾網(wǎng)過(guò)濾，去掉臍帶組織塊，獲得含臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞的濾 液；(10)將濾液在900rpm下離心5分鐘，去除上清，使用3mL的D-MEM/F12培養(yǎng)液 重新懸浮均勻細(xì)胞，獲得臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞。所述的步驟(5)中，培養(yǎng)皿的規(guī)格為90mmX 16mm，每個(gè)培養(yǎng)皿中接種14至16 個(gè)臍帶組織塊，接種多個(gè)培養(yǎng)皿。所述的步驟(2)中，粉碎采用剪切裝置粉碎。所述的剪切裝置為剪刀。所述的步驟(7)中，培養(yǎng)液D-MEM/F12中培養(yǎng)基D-MEM與營(yíng)養(yǎng)成分F12的 比例是1 1。正常的情況下，動(dòng)物組織器官內(nèi)的間充質(zhì)干細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)。當(dāng)組織器官受 到損傷后，大量的炎性因子的釋放，會(huì)激活間充質(zhì)干細(xì)胞，促使其活化、增殖、趨化聚 集到損傷部位，釋放大量的細(xì)胞因子，發(fā)揮修復(fù)和再生的作用。本發(fā)明利用此原理，將 臍帶組織粉碎成小塊，就會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞損傷，釋放炎性因子，從而活化臍帶組織內(nèi)的間充 質(zhì)干細(xì)胞，促使間充質(zhì)干細(xì)胞趨化聚集到組織小塊的周圍，通過(guò)培養(yǎng)，可獲得大量的間 充質(zhì)干細(xì)胞，而且細(xì)胞的生物特性和活性保持良好。與現(xiàn)有的酶消化法相比，本方法的優(yōu)點(diǎn)為操作簡(jiǎn)單快捷，避免了分離過(guò)程中 膠原酶對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的損傷作用以及動(dòng)物源膠原酶中引入動(dòng)物源蛋白和病原物的 污染風(fēng)險(xiǎn)。還避免了酶消化過(guò)程中消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)影響破壞細(xì)胞的活性，消化時(shí)間過(guò)短影響細(xì)胞得率這一問(wèn)題。本發(fā)明中，臍帶被均勻粉碎為直徑l_1.5mm的小塊，使得每小塊 臍帶在相同的條件下，獲得的MSCs均衡一致，利用本發(fā)明的方法，每根臍帶被分成大 量均一小塊臍帶，每個(gè)培養(yǎng)皿中接種14至16小塊，可接種多個(gè)培養(yǎng)皿，五天后每個(gè)培養(yǎng) 皿中的MSCs會(huì)大量繁殖增生，在培養(yǎng)皿中臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞增生達(dá)到80%融合。 對(duì)比現(xiàn)有的酶消化法，同樣數(shù)量的臍帶，本發(fā)明可獲得更多的MSCs。本發(fā)明的方法對(duì)比 現(xiàn)有的酶消化法，不用選擇消化酶，不用控制消化時(shí)間，操作更簡(jiǎn)便，保持了細(xì)胞原有 活性及生長(zhǎng)狀態(tài)，大大提高了 MSCs得率，并能夠長(zhǎng)時(shí)間保存而不失其活性，解決此類 資源得不到高效利用的現(xiàn)狀，保證了臨床應(yīng)用中干細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量。

圖1為本發(fā)明一種臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞爬片分離的方法工藝流程圖；圖2為本發(fā)明方法中小塊臍帶組織細(xì)胞在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)三天后MSCs的細(xì)胞形態(tài)圖；圖3為本發(fā)明方法中小塊臍帶組織細(xì)胞在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)五天后MSCs的細(xì)胞形態(tài) 圖；圖4為本發(fā)明方法獲得的原代臍帶組織MSCs培養(yǎng)十天后的細(xì)胞形態(tài)圖；圖5為本發(fā)明方法獲得的臍帶組織MSCs隨時(shí)間的生長(zhǎng)曲線圖；圖6為酶消化法獲得的臍帶組織MSCs隨時(shí)間的生長(zhǎng)曲線圖；圖7為本發(fā)明方法獲得的臍帶間組織充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化示 意圖。為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明為達(dá)成預(yù)定目的所采取的技術(shù)手段及功效，以下結(jié)合附 圖及較佳實(shí)施例，對(duì)依據(jù)本發(fā)明提出的一種臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞爬片分離的方法，其具體實(shí)施方式
、特征及其功效，說(shuō)明如后。本發(fā)明提供的一種臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞爬片分離的方法，其工藝流程如圖1 所示，由下述步驟組成(1)取新生兒的臍帶，通過(guò)磷酸緩沖液(簡(jiǎn)稱PBS，英文全 稱Phosphate buffer saline)反復(fù)沖洗干凈，去除殘留的血液，獲得干凈臍帶，該磷酸 緩沖液是由8g的NaCl、0.2g的KC1、1.15g的Na2HPO4、0.2g的KH2PO4用水定容為 IL(升)的方法制作而成，該緩沖液用來(lái)維持臍帶細(xì)胞內(nèi)外滲透壓、維持離子強(qiáng)度和PH 值，維持細(xì)胞存活狀態(tài)；(2)然后將干凈的臍帶粉碎，獲得大量臍帶組織塊；(3)再將 獲得的臍帶組織塊濾過(guò)孔徑為1.5mm的粗濾網(wǎng)，收集粗濾網(wǎng)下的臍帶組織塊，去掉不符 合要求的大臍帶組織塊，獲得直徑小于等于1.5mm以下的小臍帶組織塊；(4)再將獲得 的小臍帶組織塊濾過(guò)200目濾網(wǎng)，收集200目濾網(wǎng)上的臍帶組織塊，去掉不符合要求的 過(guò)小的臍帶組織塊，獲得直徑為l_1.5mm多個(gè)臍帶組織塊；(5)直徑為l-1.5mm臍帶 組織塊在200目濾網(wǎng)上浙干液體后，將200目濾網(wǎng)上臍帶組織塊接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中， 每個(gè)培養(yǎng)皿中接種14至16個(gè)臍帶組織塊，接種多個(gè)培養(yǎng)皿；(6)不加培養(yǎng)液，直接放 置于5%C02、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)，靜置三小時(shí)，使得臍帶組織塊帖壁，加入培養(yǎng)液后，臍 帶組織塊不會(huì)漂??；(7)然后每個(gè)培養(yǎng)皿中加入含20%牛血清、10ng/mLEGF(中文全 稱表皮生長(zhǎng)因子，英文全稱Epidermal Growth Factor)的D-MEM/F12 (英文全稱Dulbecco，s Modified Eagle，s Medium/Nutrient F_12Ham，s, 一種培養(yǎng)基)培養(yǎng)液 5mL,置于5%C02、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，五天后，在培養(yǎng)皿中臍帶組織間充質(zhì)干細(xì) 胞增生達(dá)到80%融合；(8)然后用磷酸緩沖液清洗培養(yǎng)皿兩次，每次用量5mL，吸棄洗 液，吸取ImL的含0.25%胰蛋白酶和0.1% EDTA(中文全稱乙二胺四乙酸鈉，英文 全稱ethylenediaminetraacetic acid)的磷酸緩沖液，加入到培養(yǎng)皿內(nèi)，消化3-5分鐘， 胰蛋白酶消化使細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與培養(yǎng)皿間的粘連成分酶解，獲得單個(gè)細(xì)胞，在倒置 顯微鏡下觀察細(xì)胞，確保細(xì)胞完全消化下來(lái)，再將5mL含了 20%牛血清、10ng/mLEGF 的D-MEM/F12培養(yǎng)液加入到培養(yǎng)皿中，反復(fù)吹打，臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)入消化液 中；(9)消化液經(jīng)200目濾網(wǎng)過(guò)濾，去掉臍帶組織塊，獲得含臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞的濾 液；(10)將濾液在900rpm下離心5分鐘，去除上清，使用3mL的D-MEM/F12培養(yǎng)液 重新懸浮均勻細(xì)胞，獲得臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞。上述步驟中所使用器材和試劑均需事 先經(jīng)過(guò)消毒和滅菌。步驟(7)中，培養(yǎng)液D-MEM/F12中培養(yǎng)基D_MEM與營(yíng)養(yǎng)成分F12的比例是 1 I0
本發(fā)明方法獲得的臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞最大限度的保持了干細(xì)胞原有的生物 特性和活性，細(xì)胞繁殖增生速度快。在本發(fā)明方法獲得的臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞按1 3 傳代置于培養(yǎng)器皿中，即將長(zhǎng)于η個(gè)培養(yǎng)皿中的細(xì)胞接種到3η個(gè)培養(yǎng)皿上；然后在培養(yǎng) 器皿中加入含10%牛血清、10ng/mL EGF的D-MEM/F12培養(yǎng)液5mL ；再將培養(yǎng)器皿置 于5%C02、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；五天后，在培養(yǎng)器皿中間充質(zhì)干細(xì)胞增生將達(dá)到80%融 合，即將分離出的間充質(zhì)干細(xì)胞按13傳代進(jìn)行了擴(kuò)增。可以采用同樣的方法對(duì)擴(kuò)增 后的干細(xì)胞再進(jìn)行1 3傳代擴(kuò)增。連續(xù)傳20代，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察顯示本發(fā)明方法分離的原代干細(xì)胞多于24-48小時(shí)內(nèi)爬出組 織，請(qǐng)參見(jiàn)圖2所示，可以看出原代干細(xì)胞培養(yǎng)三天后，組織塊邊緣有間充質(zhì)干細(xì)胞爬 出，圖中深色部分為接種的臍帶組織塊；圖3為本發(fā)明方法中小塊臍帶組織細(xì)胞在培養(yǎng) 皿中培養(yǎng)五天后MSCs的細(xì)胞形態(tài)圖，可以看出，培養(yǎng)五天后，MSCs已經(jīng)爬出組織并蔓 延生長(zhǎng)開(kāi)來(lái)，圖中深色部分為接種的臍帶組織塊。采用本方法分離的原代干細(xì)胞培養(yǎng)1-2周，倒置顯微鏡可見(jiàn)貼壁細(xì)胞呈梭形、 多角形，增長(zhǎng)速度較快，請(qǐng)參見(jiàn)圖4所示，原代干細(xì)胞培養(yǎng)十天后，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿底部；2周以后成為形態(tài)相對(duì)均一的梭形細(xì)胞，呈平行排列生長(zhǎng)或旋渦 狀生長(zhǎng)，于第2-3周可形成80%融合貼壁細(xì)胞層。連續(xù)傳20代，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變， 細(xì)胞活率較傳統(tǒng)酶消化法高。本發(fā)明方法獲得的臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞增殖較快，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞倍增 時(shí)間均約為24h左右，即細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，以最大的速率生長(zhǎng)和 分裂，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量呈對(duì)數(shù)增加的時(shí)期約為24h左右。臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞繁殖生長(zhǎng)曲線的測(cè)定方法如下將貼壁干細(xì)胞用ImL的 含0.25%胰蛋白酶和0.1% EDTA的磷酸緩沖液消化后，按IX IO4細(xì)胞/孔接種在24孔 板內(nèi)，每隔24h用含0.25%胰蛋白酶和0.1% EDTA消化3個(gè)孔，收集干細(xì)胞，并用0.4% 的胎盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線，時(shí)間單位 為天，細(xì)胞數(shù)單位為XlO4個(gè)，如圖5所示；圖6為酶消化法采用相同測(cè)定方法獲得的MSCs隨時(shí)間的生長(zhǎng)曲線圖。由圖可以看出，本發(fā)明方法獲得臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞繁殖生長(zhǎng)能力優(yōu)于酶消化法獲得的臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞。圖7為本發(fā)明方法獲得的臍帶間 充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化示意圖，圖中7A、7C表示未分化的臍帶間充質(zhì)干 細(xì)胞；7B表示臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化圖；7D用油紅-O染料顯示的臍帶間充 質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化圖。由7A和7B、7C和7D對(duì)比可以看出，本發(fā)明方法獲得的 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有很好的成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化活性。實(shí)施例1 一種臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞爬片分離的方法，取新生兒的臍帶一根，用50mL的 磷酸緩沖液反復(fù)沖洗干凈，去除殘留的血液，獲得干凈臍帶；用剪切裝置粉碎，獲得大 量臍帶組織塊；過(guò)孔徑為1.5mm的粗濾網(wǎng)，去掉不符合要求的大塊臍帶組織，獲得直徑 小于等于1.5mm以下的小臍帶組織塊；粗濾網(wǎng)下接200目濾網(wǎng)，收集200目濾網(wǎng)上的小 臍帶組織塊，去掉不符合要求的過(guò)小的臍帶組織塊，獲得直徑為l-1.5mm多個(gè)臍帶組織 塊，直徑l-1.5mm的臍帶組織塊在200目濾網(wǎng)上浙干液體后，將200目濾網(wǎng)上臍帶組織塊 接種于規(guī)格為90mmX 16mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中接種15個(gè)臍帶組織塊，可接 種20個(gè)培養(yǎng)皿，不加培養(yǎng)液，直接放置于5%C02、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)，待三小時(shí)后加入5mL 含20%牛血清、10ng/mL EGF的D-MEM/F12培養(yǎng)液，置于5%C02、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)繼 續(xù)培養(yǎng)，五天后，在培養(yǎng)皿中臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞增生達(dá)到80%融合，然后用磷酸緩 沖液清洗培養(yǎng)皿兩次，每次用量5mL，吸棄洗液，吸取ImL的含0.25%胰蛋白酶和0.1% EDTA的磷酸緩沖液，加入到培養(yǎng)皿內(nèi)，消化3-5分鐘，臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)入消化 液中；消化液經(jīng)200目濾網(wǎng)過(guò)濾，去掉臍帶組織塊，獲得含臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞的濾 液；將濾液離心，去除上清，使用3mLD_MEM/F12培養(yǎng)液重新懸浮均勻細(xì)胞，獲得臍 帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞，一根臍帶獲得的約干細(xì)胞的數(shù)量為1.5X 107-2.0X 107個(gè)。 所述的剪切裝置為剪刀。與現(xiàn)有的酶消化法相比，本方法的優(yōu)點(diǎn)為操作簡(jiǎn)單快捷，避免了分離過(guò)程中 膠原酶對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的損傷作用以及動(dòng)物源膠原酶中引入動(dòng)物源蛋白和病原物的 污染風(fēng)險(xiǎn)。還避免了酶消化過(guò)程中消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)影響破壞細(xì)胞的活性，消化時(shí)間過(guò)短影 響細(xì)胞得率這一問(wèn)題。本發(fā)明中，臍帶被均勻粉碎為直徑l_1.5mm的小塊，使得每小塊 臍帶在相同的條件下，獲得的MSCs均衡一致，利用本發(fā)明的方法，每根臍帶被分成大 量均一小塊臍帶組織，每個(gè)培養(yǎng)皿中接種14至16小塊，可接種多個(gè)培養(yǎng)皿，五天后每個(gè) 培養(yǎng)皿中的MSCs會(huì)大量繁殖增生，在培養(yǎng)皿中臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞增生達(dá)到80%融 合。對(duì)比現(xiàn)有的酶消化法，同樣數(shù)量的臍帶，本發(fā)明可獲得更多的MSCs。本發(fā)明的方 法對(duì)比現(xiàn)有的酶消化法，不用選擇消化酶，不用控制消化時(shí)間，操作更簡(jiǎn)便，保持了細(xì) 胞原有活性及生長(zhǎng)狀態(tài)，大大提高了 MSCs得率，并能夠長(zhǎng)時(shí)間保存而不失其活性，解 決此類資源得不到高效利用的現(xiàn)狀，保證了臨床應(yīng)用中干細(xì)胞的質(zhì)量。在此說(shuō)明書(shū)中，本發(fā)明已參照其特定的實(shí)施例作了描述，但是，很顯然仍可以 做出各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)和附圖被認(rèn) 為是說(shuō)明性的而非限制性的。
權(quán)利要求
1.一種臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞爬片分離的方法，其特征在于，該方法是由下述步驟 組成(1)首先取新生兒的臍帶，由8g的NaCl、0.2g的KCl、1.15g的Na2HP04、0.2g 的KH2PO4用水定容為IL的方法制作而成磷酸緩沖液反復(fù)沖洗干凈，去除殘留的血液， 獲得干凈臍帶；(2)將干凈的臍帶粉碎，獲得大量臍帶組織塊；(3)再將獲得的臍帶組 織塊濾過(guò)孔徑1.5mm的粗濾網(wǎng)，收集粗濾網(wǎng)下的臍帶組織塊，去掉不符合要求的大臍帶 組織塊，獲得直徑小于等于1.5mm的小臍帶組織塊；(4)再將獲得的小臍組織帶塊濾過(guò) 200目濾網(wǎng)，收集200目濾網(wǎng)上的臍帶組織塊，去掉不符合要求的過(guò)小的臍帶組織塊，獲 得直徑為l-1.5mm多個(gè)臍帶組織塊；(5)直徑為l-1.5mm臍帶組織塊在200目濾網(wǎng)上浙 干液體后，將200目濾網(wǎng)上臍帶組織塊接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中；(6)不加培養(yǎng)液，直接放置 于5%C02、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)，靜置三小時(shí)；(7)然后加入含20%牛血清、lOng/mL EGF的 D-MEM/F12培養(yǎng)液5mL，置于5%C02、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，五天后，在培養(yǎng)皿中 臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞增生達(dá)到80%融合；(8)胰蛋白酶消化先用磷酸緩沖液清洗培 養(yǎng)皿兩次，每次用量5mL，吸棄洗液，吸取ImL的含0.25%胰蛋白酶和0.1% EDTA的磷 酸緩沖液，加入到培養(yǎng)皿內(nèi)，消化3-5分鐘，再將5mL含了 20%牛血清、10ng/mL EGF 的D-MEM/F12培養(yǎng)液加入到培養(yǎng)皿中，反復(fù)吹打，臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)入消化液 中；(9)消化液經(jīng)200目濾網(wǎng)過(guò)濾，去掉臍帶組織塊，獲得含臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞的濾 液；(10)將濾液在900rpm下離心5分鐘，去除上清，使用3mL的D-MEM/F12培養(yǎng)液 重新懸浮均勻細(xì)胞，獲得臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞爬片分離的方法，其特征在于，所述的 步驟(5)中，培養(yǎng)皿的規(guī)格為90mmX 16mm，每個(gè)培養(yǎng)皿中接種14至16個(gè)臍帶組織塊， 接種多個(gè)培養(yǎng)皿。
3.如權(quán)利要求1所述的臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞爬片分離的方法，其特征在于，所述的 步驟(2)中，粉碎采用剪切裝置粉碎。
4.如權(quán)利要求3所述的臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞爬片分離的方法，其特征在于，所述的 剪切裝置為剪刀。
5.如權(quán)利要求1所述的臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞爬片分離的方法，其特征在于，所述的 步驟(7)中，培養(yǎng)液D-MEM/F12中培養(yǎng)基D-MEM與營(yíng)養(yǎng)成分F12的比例是1 1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞爬片分離的方法，包括取新生兒臍帶，磷酸緩沖液沖洗干凈；臍帶粉碎；將粉碎后臍帶過(guò)粗濾網(wǎng)及200目濾網(wǎng)，獲得直徑為1-1.5mm臍帶組織塊；瀝干后，將臍帶組織塊接種于培養(yǎng)皿中；培養(yǎng)皿放于5％CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，三小時(shí)后；加入含20％牛血清、10ng/mL EGF的D-MEM/F12培養(yǎng)液，放回培養(yǎng)箱，五天后；將胰蛋白酶加入培養(yǎng)皿中，干細(xì)胞入消化液；消化液經(jīng)200目濾網(wǎng)過(guò)濾；將濾液離心，去除上清，獲得臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明操作更簡(jiǎn)便，保持細(xì)胞原有活性及生長(zhǎng)狀態(tài)，提高M(jìn)SCs得率，避免膠原酶對(duì)干細(xì)胞的損傷作用以及動(dòng)物源膠原酶中引入動(dòng)物源蛋白和病原物的污染風(fēng)險(xiǎn)。
文檔編號(hào)C12N5/0775GK102010850SQ20091024237
公開(kāi)日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2009年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月15日
發(fā)明者劉廣洋, 劉擁軍, 徐萌 申請(qǐng)人:和澤生物科技有限公司