專(zhuān)利名稱(chēng)：一種微載體固定化脂肪酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微載體固定化脂肪酶及其制備方法。
背景技術(shù)：
生物酶的固定化技術(shù)是酶工程的核心內(nèi)容之一，它有效地克服了游離酶在工業(yè)化 應(yīng)用中穩(wěn)定性差、耐熱性差、不能重復(fù)利用以及不易與產(chǎn)物分離的缺點(diǎn)，極大地推動(dòng)了生物 酶在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用，促進(jìn)了生物技術(shù)的迅猛發(fā)展。脂肪酶是工業(yè)上應(yīng)用較廣的一種酶，它 能夠在油_水界面上催化水解、酯化、轉(zhuǎn)酯化、內(nèi)酯合成、多肽合成及手性化合物的拆分等 多種反應(yīng)。脂肪酶的固定化技術(shù)已經(jīng)成為決定脂肪酶應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)。 脂肪酶固定化的方法有很多種，比較常見(jiàn)的方法包括吸附法、共價(jià)結(jié)合法、包埋 法和微囊法等。脂肪酶固定化可以只采用一種上述方法，有時(shí)因特殊需要也往往采用兩種 及以上的復(fù)合方法進(jìn)行固定化。脂肪酶常用的固定化載體與其他種類(lèi)的酶固定化用的載體 沒(méi)有太大區(qū)別，主要包括天然多孔材料、各類(lèi)凝膠、合成樹(shù)脂和復(fù)合改性材料等。目前市場(chǎng) 上已經(jīng)有多種商品化的固定化脂肪酶，其中應(yīng)用較廣的固定化脂肪酶是以顆粒狀合成樹(shù)脂 為載體，采用共價(jià)結(jié)合的方法進(jìn)行固定化的一類(lèi)酶。這類(lèi)固定化脂肪酶具有活力較高、酶載 量大、使用壽命長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)，其缺點(diǎn)是工藝復(fù)雜，酶分子經(jīng)過(guò)多個(gè)步驟、以共價(jià)方式結(jié)合在預(yù) 先制備好的載體上，固定化過(guò)程酶活損失嚴(yán)重，工藝對(duì)酶自身純度要求也很高。另外此類(lèi)固 定化酶價(jià)格很高，一般在每公斤幾千元以上，有的甚至超過(guò)萬(wàn)元。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種微載體固定化脂肪酶及其制備方法。
本發(fā)明所提供的微載體固定化脂肪酶的制備方法，包括下述步驟 1)脂肪酶復(fù)合液的制備在脂肪酶溶液中加入所述脂肪酶溶液重量的1% 60%
的載體合成用組分，混合均勻得到脂肪酶復(fù)合液； 2)將步驟1)制備的脂肪酶復(fù)合液經(jīng)噴霧干燥得到微載體固定化脂肪酶；
所述載體合成用組分是含有預(yù)聚物的溶液、分散液或乳液；所述預(yù)聚物是聚丙烯 酸酯類(lèi)、聚氨酯類(lèi)或二者任意比例混合的組分。噴霧過(guò)程中載體合成用組分中的預(yù)聚物在 一定溫度下聚合，形成載體。 所述方法中，所述載體合成用組分的含固量(固體含量)為2%_66%，優(yōu)選含 固量為9% _50%，特別優(yōu)選25% 50% ;如9% _16%、9% -32%， 16% _32%、30_32%、 23% -30%、16% -30%、32%、30%、23%、45%、16%、9%。 所述方法中，所述脂肪酶復(fù)合液的脂肪酶活力范圍為0 50000U/g溶液但不包括 OU/g溶液；優(yōu)選為6000 20000U/g溶液，如3000 1 8000 U/g、3000-6000 U/g、3000 U/ g-10489U/g、6000U/g-10489U/g、5000U/g-6000U/g、3000 U/g-6153U/g、3000 U/g、6000U/ g、10489U/g、6153U/g、5000U/g、4000U/g。 所述載體合成用組分的添加量為所述脂肪酶溶液重量的6% 60%，優(yōu)選為12% _60%，特別優(yōu)選為20% -60%，如6% -20%、20% -30%、6% -30%、43% -60%、 30% -43%、20%、6%、30%、43%、60%。 所述方法中，所述脂肪酶溶液根據(jù)需要可以加入質(zhì)量百分濃度為1 10%。的通用
酶穩(wěn)定劑，所述通用酶穩(wěn)定劑為PEG、明膠和海藻糖中的一種或兩種以上任意混合。通用酶
穩(wěn)定劑的添加量可為10%。、5%。、2%。、1%。 ；PEG可為PEG8000、PEG6000等。 所述方法中，所述聚丙烯酸酯是以丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸甲酯、丙烯酸
異辛酯、丙烯酸乙烯酯、甲基丙烯酸甲酯、醋酸乙烯和丙烯酸中兩種或三種以上任意組合為
單體進(jìn)行聚合反應(yīng)得到的共聚物；所述聚氨酯是多異氰酸酯與低聚多元醇的嵌段共聚物；
所述低聚多元醇優(yōu)選為聚醚二醇或聚酯二醇，所述多異氰酸酯為芳香族異氰酸酯或脂肪族
二異氰酸酯；所述芳香族異氰酸酯優(yōu)選為甲苯二異氰酸酯或二苯甲烷二異氰酸酯，所述脂
肪族二異氰酸酯優(yōu)選為六次亞甲基二異氰酸酯。 所述聚丙烯酸酯優(yōu)選為下述1)_6)中任意一項(xiàng)所述的共聚物 1)丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯按質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為(1 3) : (l
4) : (2 6)的比例聚合反應(yīng)得到的共聚物； 2)丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯按質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為1. 1 : 1.3 : 2的 比例聚合反應(yīng)得到的共聚物； 3)丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸和丙烯酸異辛酯按質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為
6:4:3:2的比例聚合反應(yīng)得到的共聚物； 4)丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯按質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為i : i : 2的比例 聚合反應(yīng)得到的共聚物； 5)丙烯酸乙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸乙烯酯和甲基丙烯酸甲酯按質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為
3:2:i:2的比例聚合反應(yīng)得到的共聚物； 6)丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸甲酯和醋酸乙烯按質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為
2:i:3:6的比例聚合反應(yīng)得到的共聚物； 所述聚氨酯優(yōu)選為下述1)_4)中任意一項(xiàng)所述的共聚物 1)甲苯二異氰酸酯與聚醚二醇按照物質(zhì)的量(摩爾)比為3 : 2的比例聚合得到 的共聚物； 2)甲苯二異氰酸酯與聚酯二醇按照物質(zhì)的量(摩爾)比為3 : l的比例聚合得到 的共聚物； 3)六次亞甲基二異氰酸酯與聚酯二醇按照物質(zhì)的量(摩爾)比為2 : 1的比例聚 合得到的共聚物； 4) 二苯甲烷二異氰酸酯與聚酯二醇按照物質(zhì)的量(摩爾)比為9 : 2的比例聚合 得到的共聚物。 當(dāng)所述預(yù)聚物是聚丙烯酸酯和聚氨酯混合的組分時(shí)，所述聚丙烯酸酯和聚氨酯的
質(zhì)量比優(yōu)選為(l-4) : (l-2);更優(yōu)選為i : 1、3 : 2或者4 : i ;所述低聚多元醇的重均
分子質(zhì)量為0.4 3. lkDa，如，當(dāng)?shù)途鄱嘣紴榫勖讯紩r(shí)，其重均分子量可為1.9kDa，當(dāng)
低聚多元醇為聚酯二醇時(shí)，其重均分子量可為2. 3kDa、1. 2kDa、1. 3kDa。 所述方法中，所述脂肪酶溶液為脂肪酶發(fā)酵液或脂肪酶純粉水溶液。 所述方法中，噴霧干燥應(yīng)理解為通常所說(shuō)的干燥方法，是液態(tài)物料霧化后水份經(jīng)迅速蒸發(fā)而除去的干燥方法。所述方法中，所述噴霧干燥時(shí)干燥風(fēng)在干燥室入口處的溫度 為100 360。C，優(yōu)選為126 220。C，最優(yōu)選為126-210。C，如126°C -160。C、126。C _170°C、 126 °C -170°C、126°C -190°C、160°C -180°C、170°C -190°C、190°C _210°C 、 180°C 、 160°C 、 170°C、190°C、210°C、126°C ;干燥室出口溫度為10 98。C，優(yōu)選為60-90。C，如60_65°C、 60-70°C、65°C -70°C、70°C -90°C、80°C _90°C 、60-75°C 、75°C _80°C 、60°C 、65°C 、70°C 、90°C 、 80°C、75°C ;所述方法中，整個(gè)噴霧過(guò)程時(shí)間為60秒以下，優(yōu)選為10-55秒，如48-55秒、 25-35秒、45-50秒、30-36秒、10-16秒、20-25秒、10-20秒、10-30秒25-45秒、16-25秒、 16-36秒。噴霧干燥采用的霧化方式不限，可以是離心式、壓力式和氣流式，優(yōu)選為離心式。 噴霧干燥的同時(shí)固定化載體合成用組分在高溫下發(fā)生聚合反應(yīng)合成顆粒狀微載體，同時(shí)脂 肪酶分子通過(guò)共價(jià)結(jié)合或包埋的方式實(shí)現(xiàn)固定化。 所述方法中，還包括將微載體固定化脂肪酶控制含水量；所述控制含水量是是 將采用自然晾干、真空冷凍干燥或在ot:至9(TC下真空干燥，使固定化酶的含水量控制 在15%以下，優(yōu)選為使固定化酶的含水量控制在2 6% ;所述真空干燥的溫度優(yōu)選為 25-80。C，最優(yōu)選30-75。C ; 噴霧干燥制備的微載體固定化脂肪酶的水解活力可在0 400000U/g，基本能夠 達(dá)到100000 200000U/g。 本發(fā)明所提供的微載體固定化脂肪酶是上述方法制備的固定化脂肪酶，具有易于 從反應(yīng)體系中分離和反復(fù)利用的特點(diǎn)。 本發(fā)明的固定化脂肪酶的制備方法含脂肪酶復(fù)合液的制備，實(shí)現(xiàn)脂肪酶液與載體 合成用預(yù)聚物(或稱(chēng)預(yù)聚體，單體經(jīng)初步聚合而成的物質(zhì)，是可反應(yīng)性半成品)充分混合； 復(fù)合液經(jīng)噴霧干燥制備微載體固定化酶，實(shí)現(xiàn)微型載體制備和脂肪酶固定化同時(shí)完成。該 方法工藝操作簡(jiǎn)單，便于工業(yè)化連續(xù)性生產(chǎn)。該制備方法中載體的制備和脂肪酶固定化同 時(shí)完成在合成固定化用載體的同時(shí)，脂肪酶分子可以通過(guò)共價(jià)結(jié)合或包埋的方式實(shí)現(xiàn)固 定化，其中共價(jià)結(jié)合是通過(guò)脂肪酶分子非活性位點(diǎn)與載體中活性基團(tuán)在高溫下結(jié)合實(shí)現(xiàn) 的。本發(fā)明的方法具有步驟少、過(guò)程短、酶活損失少的特點(diǎn)，市場(chǎng)應(yīng)用前景廣闊。
本發(fā)明的方法可以將脂肪酶發(fā)酵液直接轉(zhuǎn)化成固定化脂肪酶，改變了傳統(tǒng)的脂肪 酶先提取后進(jìn)行固定化的工藝，最大程度上減少了酶處理過(guò)程中的損失，通過(guò)噴霧制備微 載體固定化酶活收率最高能夠達(dá)到96%以上。 本發(fā)明的方法工藝簡(jiǎn)單，制備的微載體固定化脂肪酶粒徑在300ym以下，基本為 5-85um，這樣的粒徑使其比表面積大，具有通用性強(qiáng)、活性高、易于從反應(yīng)體系中分離、重復(fù) 利用性好等優(yōu)點(diǎn)。 本發(fā)明的微載體固定化脂肪酶能夠催化各類(lèi)酯化、轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明該 酶可成功用于在棕櫚酸異辛酯合成、地溝油甲酯化、維生素A棕櫚酸酯合成和魚(yú)油乙酯化 等領(lǐng)域，并且表現(xiàn)出較高的催化活性。


圖1為本發(fā)明固定化脂肪酶的電鏡掃描圖。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例所述的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。 下述實(shí)施例中的百分含量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。 下述實(shí)施例中，脂肪酶活力均用橄欖油水解方法測(cè)定(行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/
T1803-1993)。 實(shí)施例1、本發(fā)明固定化脂肪酶的制備及其效果驗(yàn)證
1、本發(fā)明固定化脂肪酶的制備 從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)深圳市綠微康生物工程有限公司產(chǎn)脂肪酶原料LVK-F，活力 30000U/g，用水溶解脂肪酶原料LVK-F獲得脂肪酶溶液，加入PEG6000，使其質(zhì)量百分濃度 為10%。，混合均勻后加入脂肪酶溶液質(zhì)量20%的載體合成用組分(預(yù)聚物分散在水中獲得
的乳液，其中預(yù)聚物為聚丙烯酸酯類(lèi)組分，由重量分?jǐn)?shù)比為i. i : 1.3 : 2的丙烯酸丁酯、
丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯聚合反應(yīng)得到的共聚物，載體合成用組分含固量32%，聚合 物相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍為15 50kDa (重均分子量37kDa))，混合均勻后得到混合液體即 為脂肪酶復(fù)合液，脂肪酶活力為3000U/g。 將500g上述獲得的脂肪酶復(fù)合液(總共含1500000U脂肪酶)用江陰市干燥機(jī) 械廠QP系列II型噴霧干燥器進(jìn)行噴霧固定化，噴霧條件干燥室進(jìn)口溫度126t:，出口溫度 6(TC，霧化方式為氣流式，噴霧過(guò)程時(shí)間(料液霧化進(jìn)入干燥塔到收集器的時(shí)間)為20-25 秒。噴霧干燥時(shí)，載體合成用組分在高溫下發(fā)生聚合反應(yīng)合成顆粒狀微載體，同時(shí)脂肪酶分 子通過(guò)共價(jià)結(jié)合或包埋的方式實(shí)現(xiàn)固定化。噴霧完成后，23t:自然晾干至含水量7X，得到 87g微載體固定化脂肪酶。 2、本發(fā)明微載體固定化脂肪酶進(jìn)行活力測(cè)定的效果驗(yàn)證 將步驟1獲得的制備的微載體固定化脂肪酶用橄欖油水解方法檢測(cè)(行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) QB/T 1803-1993)，結(jié)果表明獲得的微載體固定化脂肪酶活力為13800U/g，粒徑在10 45 ii m，整個(gè)制備過(guò)程總酶活力收率(總酶活力收率=微載體固定化脂肪酶總活力/噴霧前 酶液總活力X100%)為80.5%?；盍y(cè)定完成后，將微載體固定化脂肪酶從反應(yīng)體系中 分離出來(lái)再進(jìn)行活力測(cè)定，重復(fù)6次，以上述初次測(cè)定結(jié)果為100%，分離出微載體固定化 脂肪酶重復(fù)6次的測(cè)定的活力都保持在初始活力的80%以上。
實(shí)施例2、本發(fā)明固定化脂肪酶的制備及其效果驗(yàn)證
1、本發(fā)明固定化脂肪酶的制備 以亞羅解脂酵母(Yarrowia lipolyica)(保藏編號(hào)CGMCC NO. 1470，專(zhuān)利公布號(hào)為 CN 1948470A;專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?00510112638. 5)為生產(chǎn)菌株，在裝有600L發(fā)酵培養(yǎng)基(培養(yǎng) 基為將豆粕10g/L、豆油20g/L、 K2HP04 0. lg/L、 KH2P04 0. lg/L、消泡劑0. lg/L混于水中獲 得的液體培養(yǎng)基)的發(fā)酵罐中，在2『C下發(fā)酵，過(guò)濾得到6000U/g的脂肪酶發(fā)酵液，經(jīng)硫酸 銨分級(jí)沉淀(使硫酸銨的飽和度依次分別達(dá)到35%、80%，收集達(dá)到80%的沉淀)獲得脂 肪酶純粉，活力200000U/g。脂肪酶純粉用水溶解獲得脂肪酶溶液。 在上述獲得的脂肪酶溶液中加入海藻糖，使海藻糖質(zhì)量百分濃度為5%。，混合均勻 后加入脂肪酶溶液質(zhì)量6%的載體合成用組分(預(yù)聚物分散在水中獲得的乳液，其中預(yù)聚
物為聚丙烯酸酯，預(yù)聚物具體是由重量分?jǐn)?shù)比為6 :4:3: 2的丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯、
丙烯酸和丙烯酸異辛酯聚合而成的聚 物；載體合成用組分含固量30%，聚合物相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍為20 52kDa (重均分子量38kDa))，混合均勻后得到混合液體即為脂肪酶復(fù) 合液，脂肪酶活力6000U/g。 將800g上述獲得的脂肪酶復(fù)合液液體(總共含4800000U脂肪酶)用常州市華夏 干燥制粒設(shè)備有限公司壓力式噴霧干燥機(jī)YPG-50進(jìn)行噴霧固定化，噴霧條件干燥室進(jìn)口 溫度210°C ，出口溫度65°C ，霧化方式為壓力式(霧化壓力2. 5MPa)，噴霧時(shí)間(料液霧化進(jìn) 入干燥塔到收集器的時(shí)間)為10-16秒。噴霧干燥時(shí)，載體合成用組分在高溫下發(fā)生聚合 反應(yīng)合成顆粒狀微載體，同時(shí)脂肪酶分子通過(guò)共價(jià)結(jié)合或包埋的方式實(shí)現(xiàn)固定化。噴霧完 成后真空冷凍(-15°C)干燥至固定化酶的含水量為3.6X，得到37g微載體固定化脂肪酶。
2、本發(fā)明微載體固定化脂肪酶進(jìn)行活力測(cè)定的效果驗(yàn)證 將步驟1獲得的制備的微載體固定化脂肪酶用橄欖油水解方法檢測(cè)(行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) QB/T 1803-1993)，結(jié)果表明獲得的微載體固定化脂肪酶活力為106000U/g，粒徑在30 85 m，整個(gè)制備過(guò)程總酶活力收率為83% ?；盍y(cè)定完成后將微載體固定化脂肪酶從反應(yīng) 體系中分離出來(lái)再進(jìn)行活力測(cè)定，重復(fù)12次(以上述初次酶活測(cè)定為100%，后面12次的 活力值都跟第一次測(cè)定的活力值比較)活力都保持在85%以上。
實(shí)施例3、本發(fā)明固定化脂肪酶的制備及其效果驗(yàn)證
1、本發(fā)明固定化脂肪酶的制備 實(shí)施例2中發(fā)酵液，活力6000U/g，過(guò)濾除去菌體等雜質(zhì)后超濾濃縮至15000U/g， 然后加入脂肪酶發(fā)酵液質(zhì)量43%的載體合成用組分(預(yù)聚物分散在水中獲得的乳液，其中 預(yù)聚物是質(zhì)量比為3 : 2的聚丙烯酸酯與聚氨酯組分，總含固量23%，其中聚丙烯酸酯是丙
烯酸丁酯、丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯按重量份數(shù)比為i:i:2的比例聚合反應(yīng)得到
的共聚物，聚合物相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍為20 50kDa(重均分子量30kDa);聚氨酯是甲 苯二異氰酸酯與聚醚二醇(相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍為0. 9 2. 7kDa(重均分子量1. 9kDa)) 按照物質(zhì)的量(摩爾)比為3 : 2的比例聚合得到的共聚物，聚合物分子量分布范圍為 25 60kDa(重均分子量44kDa))，混合均勻后得到混合液體即為脂肪酶復(fù)合液；其活力為 10489U/g。 將5000g上述獲得的液體(總共含52445000U脂肪酶)用常州市嘉鵬干燥設(shè)備有 限公司離心噴霧干燥機(jī)LPG100進(jìn)行噴霧固定化，噴霧條件干燥室進(jìn)口溫度190°C，出口溫 度7(TC，霧化方式為離心式，噴霧時(shí)間(料液霧化進(jìn)入干燥塔到收集器的時(shí)間)為30-36 秒。噴霧完成后6(TC真空干燥至含水量4. 0%，得到674g微載體固定化脂肪酶。
2、本發(fā)明微載體固定化脂肪酶用于棕櫚酸異辛酯的合成的效果驗(yàn)證
將步驟1獲得的制備的微載體固定化脂肪酶用橄欖油水解方法檢測(cè)(行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) QB/T 1803-1993)，結(jié)果表明步驟1制備的微載體固定化酶活力為70000U/g，粒徑在5 35iim，整個(gè)制備過(guò)程總酶活力收率為90%。 將步驟1制備的固定化脂肪酶按照下述反應(yīng)體系連續(xù)進(jìn)行多次催化酯化反應(yīng) 0. 100g步驟l制備的固定化酶，1.000g棕櫚酸，0.508g異辛醇(酸醇摩爾比為l : 1)，5mL 正己烷。將反應(yīng)體系在4(TC，160r/min搖床，反應(yīng)12小時(shí)。每次催化反應(yīng)后，將所用固定 化酶取出，經(jīng)正己烷清洗后，重新放入新的上述相同體系繼續(xù)反應(yīng)。每次反應(yīng)后，采用酸堿 滴定確定酯化率(酯化率=(1-反應(yīng)完后剩余酸量/反應(yīng)前酸總量)X 100% )，記錄反應(yīng) 酯化率仍保持在90%以上的反應(yīng)次數(shù)。結(jié)果表明酯化率在90%以上的反應(yīng)次數(shù)為46次，結(jié)果表明上述微載體固定化脂肪酶表現(xiàn)出較高活性和使用壽命。
實(shí)施例4、本發(fā)明固定化脂肪酶的制備及其效果驗(yàn)證
1、本發(fā)明固定化脂肪酶的制備 以亞羅解脂酵母(Yarrowia lipolytics)(保藏編號(hào)CGMCC NO. 1470，專(zhuān)利公布號(hào) 為CN 1948470A ;專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?005101 12638. 5)為生產(chǎn)菌株，在裝有3600L發(fā)酵培養(yǎng)基 (培養(yǎng)基為將豆粕15g/L、豆油26g/L、K2HP04 0. lg/L、KH2P04 0. lg/L、消泡劑0. 3g/L混于水 中獲得的液體培養(yǎng)基)的發(fā)酵罐中，溫度28t:下發(fā)酵。取新下罐發(fā)酵液，該發(fā)酵液脂肪酶水 解活力為8000U/g發(fā)酵液，過(guò)濾除去菌體等雜質(zhì)，加入脂肪酶發(fā)酵液質(zhì)量30%的載體合成 用組分(預(yù)聚物分散在水中獲得的乳液，預(yù)聚物是質(zhì)量比為4 : l的聚丙烯酸酯與聚氨酯 組分，總含固量45% ;其中聚丙烯酸酯是丙烯酸乙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸乙烯酯和甲基丙
烯酸甲酯按照質(zhì)量比為3 :2:i: 2聚合反應(yīng)得到的共聚物，聚合物相對(duì)分子質(zhì)量分布
范圍為36 62kDa(重均分子量49kDa);聚氨酯是六次亞甲基二異氰酸酯與聚酯二醇(相 對(duì)分子質(zhì)量分布范圍為1.5 3kDa(重均分子量2.3kDa))按照2 : l的物質(zhì)的量(摩爾) 比聚合得到的共聚物，聚合物分子量分布范圍為55 106kDa(重均分子量79kDa))混合均 勻后得到混合液體即為脂肪酶復(fù)合液；其活力為6153U/g。 將12000g上述獲得的液體(總共含73836000U脂肪酶)進(jìn)行噴霧固定化，噴霧條 件干燥室進(jìn)口溫度170°C，出口溫度9(TC，霧化方式為離心式(儀器同實(shí)施例3)，噴霧時(shí)間 (料液霧化進(jìn)入干燥塔到收集器的時(shí)間)為45-50秒。噴霧完成后8(TC真空干燥至含水量 4. 3%，得到424g微載體固定化脂肪酶。圖1為該固定化脂肪酶的電鏡掃描圖。
2、本發(fā)明微載體固定化脂肪酶用于催化合成脂肪酸甲酯反應(yīng)的效果驗(yàn)證
將步驟1獲得的制備的微載體固定化脂肪酶用橄欖油水解方法檢測(cè)(行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) QB/T 1803-1993)，結(jié)果表明步驟1制備的微載體固定化酶活力為160000U/g，粒徑范圍在 5 50 ii m，整個(gè)制備過(guò)程總酶活力收率為92 % 。 將步驟1制備的固定化脂肪酶按照下述反應(yīng)體系連續(xù)進(jìn)行多次催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng) 0. Olg步驟1制備的固定化酶，2g地溝油(酸值120mgK0H/g)，5ml正己烷，0. lg水，279 yl 甲醇。將反應(yīng)體系在4(TC，170r/min搖床，反應(yīng)12小時(shí)。每次催化反應(yīng)后，將所用固定化 酶取出，經(jīng)正己烷清洗后，重新放入新的上述相同體系繼續(xù)反應(yīng)。每次反應(yīng)后均用氣相色譜 法測(cè)定脂肪酸甲酯的含量，計(jì)算轉(zhuǎn)酯化率(氣相色譜分析中面積歸一積分法，目標(biāo)產(chǎn)物面 積占總面積的比率)，記錄反應(yīng)酯化率仍保持在90%以上的反應(yīng)次數(shù)。結(jié)果顯示，步驟1制 備的微載體固定化脂肪酶均能夠連續(xù)31次催化上述轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，且轉(zhuǎn)化率均在90%以上。
實(shí)施例5、本發(fā)明固定化脂肪酶的制備及其效果驗(yàn)證
1、本發(fā)明固定化脂肪酶的制備 取實(shí)施例4發(fā)酵液，經(jīng)1000g， 10分鐘離心，收集上清液，加入明膠和PEG8000，使明 膠和PEG8000的質(zhì)量百分濃度均為2%。，充分溶解后，加入脂肪酶溶液質(zhì)量60%的載體合成 用組分(預(yù)聚物分散在水中獲得的乳液，預(yù)聚物是質(zhì)量比為1 : l的聚丙烯酸酯和聚氨酯 組分，總含固量16%，其中聚丙烯酸酯是丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸甲酯、醋酸乙烯按
照2 : i : 3 : 6的質(zhì)量比聚合反應(yīng)得到的共聚物，聚合物相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍為39
55kDa(重均分子量46kDa);聚氨酯是甲苯二異氰酸酯與聚酯二醇(相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍 為0. 9 1. 5kDa(重均分子量1. 2kDa))按照3 : 1的物質(zhì)的量(摩爾)比聚合得到的共
9分布范圍為32 51kDa(重均分子量38kDa))混合均勻即為脂肪酶復(fù) 合液；測(cè)定表明其活力為5000U/g。 取lOOOg上述混合溶液(總共含5000000U脂肪酶)進(jìn)行噴霧固定化，設(shè)備同實(shí)施 例3，噴霧條件干燥室進(jìn)口溫度160°C，出口溫度8(TC，霧化方式為離心式，噴霧時(shí)間(料液 霧化進(jìn)入干燥塔到收集器的時(shí)間)48-55秒，噴霧完成后4(TC真空干燥至含水量2% 。得到 90g固定化脂肪酶。 2、本發(fā)明微載體固定化脂肪酶用于合成維生素A棕櫚酸酯反應(yīng)的效果驗(yàn)證
將步驟1獲得的制備的微載體固定化脂肪酶用橄欖油水解方法檢測(cè)(行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) QB/T 1803-1993)，結(jié)果表明步驟1制備的微載體固定化酶活力為48000U/g，粒徑范圍在 20 55 ii m，整個(gè)制備過(guò)程總酶活力收率為88 % 。 以維生素A醋酸酯和棕櫚酸為底物，兩者摩爾比1 : l，加入維生素A醋酸酯重量 1%的步驟1制備的微載體固定化酶，4(TC，160r/min搖床，反應(yīng)9小時(shí)。結(jié)果顯示，步驟1 制備的微載體固定化脂肪酶均能夠連續(xù)18次催化上述反應(yīng)，且轉(zhuǎn)化率均在77 79%。
實(shí)施例6、本發(fā)明固定化脂肪酶的制備及其效果驗(yàn)證
1、本發(fā)明固定化脂肪酶的制備 取實(shí)施例4發(fā)酵液，經(jīng)3000g， 10分鐘離心，收集上清液，加入明膠，使明膠的質(zhì)量 百分濃度為1%。，充分溶解后，加入脂肪酶溶液質(zhì)量12%的載體合成用組分(預(yù)聚物分散在 水中獲得的乳液，總含固量9%，預(yù)聚物是聚氨酯類(lèi)組分，是二苯甲烷二異氰酸酯與聚酯二 醇(相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍為0. 8 1. 8kDa(重均分子量1. 3kDa))按照9 : 2的物質(zhì)的量 (摩爾)比聚合得到的共聚物，聚合物分子量分布范圍為16 56kDa(重均分子量36kDa)) 混合均勻，即為脂肪酶復(fù)合液，測(cè)定脂肪酶活力為4000U/g。 取2000g上述混合溶液(總共含8000000U脂肪酶)進(jìn)行噴霧固定化，設(shè)備同實(shí) 施例3，噴霧條件干燥室進(jìn)口溫度180°C，出口溫度75°C，霧化方式為離心式(離心速度 13000r/s)，噴霧時(shí)間(料液霧化進(jìn)入干燥塔到收集器的時(shí)間)25-35秒，噴霧完成后25"C真 空干燥至含水量1.5%。得到72g固定化脂肪酶。 2、本發(fā)明微載體固定化脂肪酶用于合成魚(yú)油乙酯反應(yīng)的效果驗(yàn)證
將步驟1獲得的制備的微載體固定化脂肪酶用橄欖油水解方法檢測(cè)(行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) QB/T 1803-1993)，結(jié)果表明步驟1制備的微載體固定化酶活力為104000U/g，粒徑范圍在 15 50iim，整個(gè)制備過(guò)程總酶活力收率為95%。 將步驟1制備的固定化脂肪酶按照下述反應(yīng)體系連續(xù)催化多次魚(yú)油乙酯化反應(yīng)； 粗魚(yú)油10g，無(wú)水乙醇1. 95ml，步驟1制備的微載體固定化酶為0. 08g。將反應(yīng)體系在4(TC， 175r/min搖床，反應(yīng)21小時(shí)。反應(yīng)完成后離心將酶分離，反復(fù)重復(fù)上述反應(yīng)，氣相色譜法測(cè) 定甘油三酯的轉(zhuǎn)化率。結(jié)果顯示，該微載體固定化脂肪酶能夠連續(xù)12次催化上述反應(yīng)(轉(zhuǎn) 化率90%以上)。
10
權(quán)利要求
一種微載體固定化脂肪酶的制備方法，包括下述步驟1)脂肪酶復(fù)合液的制備在脂肪酶溶液中加入所述脂肪酶溶液重量的1％～60％的載體合成用組分，混合均勻得到脂肪酶復(fù)合液；2)將步驟1)制備的脂肪酶復(fù)合液經(jīng)噴霧干燥得到微載體固定化脂肪酶；所述載體合成用組分是預(yù)聚物分散到水中得到的溶液、分散液或乳液；所述預(yù)聚物是聚丙烯酸酯、聚氨酯或二者任意比例混合的組分；所述百分含量為重量百分含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述聚丙烯酸酯是以丙烯酸丁酯、丙烯酸 乙酯、丙烯酸甲酯、丙烯酸異辛酯、丙烯酸乙烯酯、甲基丙烯酸甲酯、醋酸乙烯和丙烯酸中兩 種或三種以上任意組合為單體進(jìn)行聚合反應(yīng)得到的共聚物；所述聚氨酯是多異氰酸酯與低 聚多元醇的嵌段共聚物；所述低聚多元醇優(yōu)選為聚醚二醇或聚酯二醇，所述多異氰酸酯為 芳香族異氰酸酯或脂肪族二異氰酸酯；所述芳香族異氰酸酯優(yōu)選為甲苯二異氰酸酯或二苯 甲烷二異氰酸酯，所述脂肪族二異氰酸酯優(yōu)選為六次亞甲基二異氰酸酯。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述脂肪酶復(fù)合液的脂肪酶活力范 圍為0 50000U/g溶液但不包括0U/g溶液；優(yōu)選為3000 20000U/g溶液；特別優(yōu)選為 3000 18000U/g溶液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述步驟1)中還包括將所 述脂肪酶溶液中加入質(zhì)量百分濃度為1 10。；的通用酶穩(wěn)定劑，所述通用酶穩(wěn)定劑為PEG、 明膠和海藻糖中的一種或兩種以上任意混合；所述載體合成用組分的添加量為所述脂肪酶 溶液重量的6% 60%，優(yōu)選為12% _60%，特別優(yōu)選為20% -60% ;所述百分含量為重量 百分含量。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述載體合成用組分的含 固量為2% 66%，優(yōu)選含固量為25% 50%。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述聚丙烯酸酯優(yōu)選為下 述1)_6)中任意一項(xiàng)所述的共聚物1) 丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯按質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為(1 3) : (l 4) : (2 6)的比例聚合反應(yīng)得到的共聚物；2) 丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯按質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為i. i : 1.3 : 2的比例聚合反應(yīng)得到的共聚物；3) 丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸和丙烯酸異辛酯按質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為6 : 4 : 3 : 2的 比例聚合反應(yīng)得到的共聚物；4) 丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯按質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為i : i : 2的比例聚合反應(yīng)得到的共聚物；5) 丙烯酸乙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸乙烯酯和甲基丙烯酸甲酯按質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為3:2:i:2的比例聚合反應(yīng)得到的共聚物；6) 丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸甲酯和醋酸乙烯按質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為2 : i : 3 : 6的 比例聚合反應(yīng)得到的共聚物；所述聚氨酯優(yōu)選為下述i)-4)中任意一項(xiàng)所述的共聚物1) 甲苯二異氰酸酯與聚醚二醇按照物質(zhì)的量比為3 : 2的比例聚合得到的共聚物；2) 甲苯二異氰酸酯與聚酯二醇按照物質(zhì)的量比為3 : i的比例聚合得到的共聚物；3) 六次亞甲基二異氰酸酯與聚酯二醇按照物質(zhì)的量比為2 : i的比例聚合得到的共聚物；4) 二苯甲烷二異氰酸酯與聚酯二醇按照物質(zhì)的量比為9 : 2的比例聚合得到的共聚物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于當(dāng)所述預(yù)聚物是聚丙烯酸 酯和聚氨酯混合的組分時(shí)，所述聚丙烯酸酯和聚氨酯的質(zhì)量比優(yōu)選為(1-4) : (1-2);更優(yōu) 選為l : 1、3 : 2或者4 : l ;所述低聚多元醇的重均分子質(zhì)量為O. 4 3. lkDa ;所述脂肪 酶溶液為脂肪酶發(fā)酵液或脂肪酶純粉水溶液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述噴霧干燥時(shí)干燥風(fēng)在 干燥室入口處的溫度為100 360。C，優(yōu)選為126 220。C，最優(yōu)選為126-210°C ;干燥室出 口溫度為10 98t:，優(yōu)選為60-9(TC;所述方法中，整個(gè)噴霧過(guò)程時(shí)間為60秒以下，優(yōu)選為 10-55秒。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述方法中，還包括將微載 體固定化脂肪酶控制含水量；所述控制含水量是采用自然晾干、真空冷凍干燥或在ot:至 9(TC下真空干燥，使固定化酶的含水量控制在15%以下，優(yōu)選為使固定化酶的含水量控制 在2 6% ;所述真空干燥的溫度優(yōu)選為25-8(TC，最優(yōu)選30-75°C。
10. 權(quán)利要求1-9中任意所述的方法制備的微載體固定化脂肪酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微載體固定化脂肪酶及其制備方法。該方法，包括下述步驟1)脂肪酶復(fù)合液的制備在脂肪酶溶液中加入所述脂肪酶溶液重量的1％～60％的載體合成用組分，混合均勻得到脂肪酶復(fù)合液；2)將步驟1)制備的脂肪酶復(fù)合液經(jīng)噴霧干燥得到微載體固定化脂肪酶；所述載體合成用組分是含有預(yù)聚物的溶液、分散液或乳液；所述預(yù)聚物是聚丙烯酸酯類(lèi)、聚氨酯類(lèi)或二者任意比例混合的組分。該方法實(shí)現(xiàn)微型載體制備和脂肪酶固定化同時(shí)完成；該方法工藝簡(jiǎn)單，制備的微載體固定化脂肪酶具有通用性強(qiáng)、活性高、易于從反應(yīng)體系中分離、重復(fù)利用性好等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N11/08GK101724621SQ200910242520
公開(kāi)日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2009年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月17日
發(fā)明者周浩, 張?jiān)鰝? 張文波, 閔瑞, 顧燕松 申請(qǐng)人:北京凱泰新世紀(jì)生物技術(shù)有限公司