專利名稱：一種豬內源性反轉錄病毒載體及其構建方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及反轉錄病毒載體及其構建方法，特別是涉及豬內 源性反轉錄病毒載體及其構建方法。
背景技術：
反轉錄病毒載體是臨床基因治療試驗中較常使用的基因轉移載體，與其它非病毒 載體和病毒載體相比具有許多獨特的優(yōu)點，包括可高效轉導多種類型的細胞、能夠整合進 宿主細胞染色體中并長期穩(wěn)定表達其攜帶的外源基因。目前人們使用的反轉錄病毒載體中 都移除了結構蛋白編碼序列gag、poKerw基因的大部分，使病毒喪失復制形成病毒粒子的 能力。載體包裝系統(tǒng)中需包括這三種病毒結構蛋白，方法是構建表達這三種蛋白的共轉 染質粒，或將這三種基因預先整合到包裝細胞系中。病毒結構還應包括必須的包裝病毒RNA 的序列(包裝信號Ψ+)、編碼病毒RNA的反轉錄以及前病毒整合的序列(長末端重復序列 LTR, RNA引物結合位點PBS以及聚嘌呤區(qū)域PP)。絕大多數反轉錄病毒載體都是基于莫羅尼小鼠白血病病毒(Mo-MLV)構建的，含 有延伸包裝信號(extended Ψ+)，普遍認為它能提高定位于gag基因開放讀碼框(ORF)上 的RNA分子在核質傳輸中的效率，并且能增加病毒滴度。延伸包裝信號(extended Ψ+)即 包裝信號(Ψ+)延伸至gag基因編碼區(qū)的5’端，gag基因起始密碼子ATG需突變?yōu)榻K止密 碼子TAG，以防止野病毒(RCR)的產生。小鼠干細胞病毒(MSCV)載體來源于小鼠胚胎干細胞病毒(MESV)以及LN系列反 轉錄病毒載體(L代表逆轉錄病毒的LTR，具有啟動子功能，N代表了 neo基因)。MSCVne0載 體轉染到包裝細胞系后瞬時表達或者整合后穩(wěn)定表達，載體包含延伸的包裝信號Ψ+，新霉 素抗性基因，以及目的基因。該載體通過一段經特殊設計的5’長末端重復序列(LTR)在造 血和胚胎細胞中穩(wěn)定高表達。LTR使目的基因在干細胞或者其他哺乳動物細胞系中高水平 持續(xù)表達。目的基因被插入到LTR下游調控序列-多克隆位點(MSC)中。鼠磷酸甘油酸脂 激酶(PKG)啟動子調控其下游序列在真核細胞中用于抗性篩選的新霉素抗性基因(NecZ)。 MSCVneo載體還包含有大腸桿菌質粒骨架，包括大腸桿菌(E. coli ori.)和氨芐青霉素抗 性β內酰胺酶基因(Amp1O。反轉錄病毒的整合可以發(fā)生在基因組的任何位置，存在著激活原癌基因的潛在危 險性。豬內源性反轉錄病毒(PERV)是在長期的進化過程中整合進豬基因組中的前病毒序 列，迄今為止，未有文獻報道PERV在豬體內的整合能引發(fā)豬體的病變或變異(如原癌基因 的激活等)，由此看來，與其它常用的反轉錄病毒相比，用PERV構建載體可能具有更好的安 全性。目前，已經發(fā)現多群PERV，包括Y群的1 5亞群、β群的1 4亞群 等。Akiyoshi(Akiyoshi DE, et al. Identification of a full-length cDNA for an endogenousretrovirus of miniature swine. J Virol, 1998, 72 (5) :4503_4507·)等克隆的小型豬PERV-MSL的序列長度為8132bp。與其它反轉錄病毒相似，PERV的基因組結構包 括 5，區(qū)、gag、pol、env、3，區(qū)等 5 部分。1997年，PERV在體外對人源細胞具有感染性的發(fā)現，引起了人們對豬-人異種移 植病原安全性的廣泛性關注，也使得PERV的研究成為了一個熱點問題。經過了幾年的努 力，有關PERV的生物學及分子生物學特性已比較清楚，對其遺傳背景及特性也比較清晰。 PERV感染的人源細胞從其生長特性及折光性上均未發(fā)現變化，且感染的細胞也無細胞病 變的發(fā)生，對其病原性的評估還未有一致的結論。應該指出的是，人與豬有著幾千年的親 密接觸史，至今未見PERV感染人的報道，Heneine等(Heneine W, et al. No evidence of infection with porcine endogenous retrovirus inrecipients of porcine islet-cell xenografts. Lancet. 1998,352(9129) 695-9.)曾對接受過豬胰島移植的160例糖尿病病 人進行了多年的跟蹤檢測，未發(fā)現有PERV感染的證據，這暗示著PERV對人致病的可能性很 小。由于PERV是以前病毒的形式存在于豬細胞基因組中的，根據基因同源重組的原 理，在PERV清晰的分子生物學背景的基礎上，用其構建新型的反轉錄病毒載體，對于轉基 因豬及PERV生物學特性的研究具有重要的意義。目前，國際上對PERV的研究均著眼于異種移植中其病原安全性的評價等方面，至 今尚未見有利用其作為反轉錄病毒載體的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了在豬源細胞中特異表達或可在其它哺乳動物細胞表達的質粒型反 轉錄病毒載體PM-I。本發(fā)明所提供的豬內源性反轉錄病毒載體PM-I由下列DNA元件組成DPERV 的 5，LTR 啟動子；2) MSCVneo 的延伸包裝信號(extended Ψ+);3)小鼠磷酸甘油酸脂激酶(PGK)啟動子及位于PGK啟動子下游并受其調控的新霉 素抗性基因(neor)；4) PERV的聚嘌呤區(qū)域PP及其3，LTR啟動子；5)大腸桿菌質粒骨架，包括大腸桿菌(E. coli ori.)和氨芐青霉素抗性β內酰胺 酶基因(Ampr)。具體來講，所述反轉錄病毒載體PM-I的核苷酸序列如序列表中序列11所示。本發(fā)明還提供了上述豬內源性反轉錄病毒載體PM-I的構建方法。本發(fā)明所提供的構建方法，包括以下步驟1)按照豬PERV全基因序列與MSCVne0序列設計5對引物，擴增P_5，LTR片段的引 物對具有序列表中序列1和序列2的核苷酸序列，擴增Ψ片段的引物對具有序列表中序列 3和序列4的核苷酸序列，擴增P_3’LTR片段的引物對具有序列表中序列5和序列6的核苷 酸序列，擴增neo片段的引物對具有序列表中序列7和序列128的核苷酸序列，擴增O-Amp 片段的引物對具有序列表中序列9和序列10的核苷酸序列，然后PCR擴增得到P-5’ LTR、 Ψ、P-3，LTR、neo 和 O-Amp 片段；2)通過重疊PCR技術及酶切連接的方法構建出豬內源性反轉錄病毒載體PM-1。
4
在上述載體的構建方法中，所述步驟1)的PCR反應體系包括0. 5 μ 1 cDNA(100ng/y 1)，弓I物R禾口 F各1μ 1(20μΜ)，4μ 1 dNTP (2. 5mM), 0. 5 μ 1 Super-Ltaq DNA 聚合酶，5 μ 1 10XPCR Buffer，38 μ 1滅菌水。PCR反應條件為先94°C變性3min ；然后 940C 30s, 560C 45s, 72°C lmin30s，30 個循環(huán)；最后 72°C 7min。步驟2)的重疊 PCR 的反應體系包括0. 5 μ 1 cDNA 1 (lOOng/ μ 1) +0. 5 μ 1 cDNA2 (lOOng/ μ 1)，弓 | 物 R 禾口 F 各 1 μ 1 (20 μ Μ)，4 μ 1 dNTP (2. 5mM)，0· 5 μ 1 Super-Ltaq DNA聚合酶，5μ1 IOXPCR Buffer，37. 5 μ 1滅菌水。反應條件為先94°C變性3min ；然后 940C 30s, 560C lmin，72°C lmin30s，30 個循環(huán)；最后 72°C 7min。含有豬內源性反轉錄病毒載體PM-I的表達載體、轉基因細胞系和宿主菌也屬于 本發(fā)明的保護范圍。上述在豬源細胞中特異表達或可在其它哺乳動物細胞表達的質粒型反轉錄病毒 載體PM-I可在多克隆位點處插入外源基因。本發(fā)明提供了在豬源細胞中特異表達或可在其它哺乳動物細胞表達的質粒型反 轉錄病毒載體PM-I及其構建方法。本發(fā)明構建的載體具有以下優(yōu)點1)能高效感染多種細胞，具有廣泛的宿主范圍；2)能高效地將目的基因整合進所侵染的細胞基因組中，并高水平表達；3)具有高效侵染的特性，能將重組目的基因傳遞給整個細胞群體，更適合于基因 治療等用途；4)與組織特異性啟動子結合，則可能達到目的基因在特定組織或器官中定位表達 的目的。由于我國有著異常非富的小型豬種資源，其遺傳背景清晰。本發(fā)明以我國特有五 指山豬來源的PERV為基礎，進行反轉錄病毒載體的研究。以此為基礎所進行的新型反轉錄 病毒載體包裝細胞系的探索工作也是對病毒載體基因轉移系統(tǒng)的完善和發(fā)展，特別是能為 轉基因豬的建立和開發(fā)以及基因轉移技術提供一條新的途徑。本發(fā)明為轉基因豬的研究提 供一種新的思路，可利用此載體進行封閉PERV轉錄的研究，培育無PERV表達的豬品系。此外，通過建立豬內源性反轉錄病毒新型載體以及篩選高滴度重組病毒的包裝細 胞株，以達到高效表達外源基因，可以用于轉基因豬的建立和開發(fā)；也可用于無內源性反轉 錄病毒表達的豬品系的培育，消除人們對異種移植病毒安全性的疑慮，為我國特有小型豬 種的開發(fā)奠定基礎；還有可能成為基因治療的一種工具。本發(fā)明通過與豬源細胞DNA的同源重組，從而達到目的基因的高效定點整合和表 達，為轉基因豬源細胞/轉基因豬的研究和應用及重組基因疫苗的研究奠定基礎，還有可 能成為基因治療的一種工具。下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。


圖1為PERV全長序列結構2為MSCVneo載體的圖譜圖3A-圖3C為重組PERV載體PM-I的構建流程4為從PERV和MSCVne0模板中PCR擴增的目的片段的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖 5 為重疊 PCR 方法擴增的 P-5，LTR+ Ψ、P_5，UTR+P-gag、neo+P-3，LTR 的瓊脂 糖凝膠電泳檢測結果圖6為酶切回收目的片段的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖7為PM-I的酶切鑒定結果圖8為PCR擴增的GFP基因的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖9為PM-1-GFP-21的酶切鑒定結果
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例1、豬內源性反轉錄病毒載體PM-I的構建用本發(fā)明的方法構建豬內源性反轉錄病毒載體PM-I (如圖3A-圖3C所示)，具體 方法如下按照五指山小型豬PERV(WZS-PERV)全基因序列(GenBank號EF133960，結構如圖 1 所示)與 MSCVneo 序列(序列見 www. clontech. com,Protocol # PT3301-5，圖譜見圖 2) 設計了 5對引物。P-5，LTR和P-3，LTR片段通過PCR方法從WZS-PERV的基因組DNA中擴 增得到，Ψ、neo和O-Amp片段通過PCR方法從MSCVne0載體中擴增得到。引物序列如下Pl :5，LTR-F CGG r|GGTACC| TGAAAGGATGAAAATGCAACCT (序列表中序列 1)P2 :5，LTR-R ATCTCGGTGGAACCTCCATGAAAGGCCAGTCGA (序列表中序列 2)
P3 Ψ-F CTCGACTGGCCTTTCATGGAGGTTCCACCGAGA(序列表中序列 3)P4 Ψ -R CCG ^TCGA^ GTTAACGAATTCCGGCGCC (序列表中序列 4)P5 :3，LTR-F ACCTGTAGGTTTGGCAAGAACTATTAACAAGAG (序列表中序列 5)P6 :3，LTR-R CTAG )TCTAGA( CTGAAAGGCCAGTCGAGTTA (序列表中序列 6)P7 Pneo-F CCG ^TCGAGl AGATCTAATTCTACCGGGT (序列表中序列 7)P8 =Pneo-R TCTCTTGTTAATAGTTCTTGCCAAACCTACAGG (序列表中序列 8)P9 OAmp-F CTAG |TCTAGA| TGGGTAACAGTTTCTTGAAGTTGGA (序列表中序列 9)PlO OAmp-R CGG |GGTACC| TTCCCCCCTTTTTCTGGAGACT (序列表中序列 10)50μ 1反應體系包括0. 5μ 1 cDNA (lOOng/μ 1)，引物R (上游引物)和F (下 游弓I物)各 1μ 1(20μΜ)，4μ 1 dNTP (2. 5mM), 0. 5 μ 1 Super-L taq DNA 聚合酶(NEB 公 司)，5μ1 10XPCR Buffer，38 μ 1 滅菌水。反應條件為94°C變性 3min ;94°C 30s, 56°C 45s, 72°C lmin30s，30 個循環(huán)；72°C 7min。將 PCR 擴增的 P_5，LTR、P_3，LTR、Ψ、neo 和 O-Amp片段進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖4所示(a. P_5’ LTR 702bp，b. P_3’ LTR 730bp, c. f. DL2000 Marker, g. Ψ 890bp, h. neol453bp, i. DL15000 Marker, j. O-Amp 3125bp,k. Marker III)，與預期結果相符。反應產物經Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega公司，美國)回收純化，得到目的DNA片段。P-5，LTR+ Ψ、neo+P-3，LTR 片段分別由 P_5，LTR 與 Ψ，neo 與 P_3，LTR 片段通 過重疊 PCR(SOE)方法得到。50μ 1 反應體系包括0. 5μ 1 cDNA 1 (lOOng/μ 1)+0. 5 μ 1
6cDNA 2(100ng/y 1),引物 R 和F 各 1 μ 1 (20 μ Μ)，4 μ 1 dNTP (2. 5mM), 0. 5 μ 1 Super-L taq DNA 聚合酶(NEB 公司)，5 μ 1 10XPCR Buffer，37. 5 μ 1 滅菌水。反應條件為94°C 變性 3min;94°C 30s, 56°C lmin,72°C lmin30s，30 個循環(huán)；72°C 7min。將重疊 PCR 擴 增的P-5，LTR+ Ψ、neo+P-3 ’ LTR片段進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖5所示 (a. P-5，LTR+ Ψ 1592bp, c.重疊 PCR 擴增 neo+P-3，LTR 2183bp, d. DL2000 Marker)，與預 期結果相符。反應產物經Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega 公司，美國) 回收純化，得到目的DNA片段。然后用限制性內切酶Kpn I和XhoI消化PCR回收產物P-5，LTR+Ψ，用Xho I和 Xba I消化PCR回收產物neo+P-3’LTR，用Xba I與Kpn I消化PCR回收產物Oamp，37°C消 化4h后將酶切片段進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖6所示(a. Kpn I和Xho I雙酶 切 P-5，LTR+ Ψ 回收產物 1592bp, c. DL2000 marker, d. Xho I 和 XbaI 雙酶切 neo+P-3，LTR 回收產物2183bp，e. Marker III,f. Xba I與Kpn I雙酶切OAmp回收產物3125bp)，與預期 結果相符。反應產物經Wizard SV Gel and PCRClean-Up System回收純化。將上述酶切回收產物P-5，LTR+ Ψ，neo+P-3，LTR和Oamp三個片段用T4 DNA連接 酶(NEB公司)4°C連接16h，轉化入E. coli DH5 α感受態(tài)細胞，篩選獲得克隆質粒，命名為 PM-I0提取質粒，用限制性內切酶消化鑒定，鑒定結果如圖7所示(a. DL15000Marker,b. Xho I 酶切鑒定 PM-I 6900bp, c. Kpn I 和 Xba I 酶切鑒定 PM_13775bp 和 3125bp，d. IOkb DNA ladder)，與預期結果相符，再送華大中生科技發(fā)展有限公司測序(3730自動測序儀)，測序 結果表明PM-I具有序列表中序列11的核苷酸序列，全長6900bp，序列正確，上述結果表明 獲得了序列正確的豬內源性反轉錄病毒載體PM-1。實施例2、表達質粒PM-1-GFP-21的構建根據GFP基因編碼區(qū)的序列分別引入Xho I和Bgl II酶切位點合成引物，引物序 列及多聚酶鏈式反應(PCR)的條件如下P15 =GFPXho I CCG |CTCGAG) CCATGGTGAGCAAGGGCGAP16 =GFPBgl II GGA ^GATCT| TTACTTGTACAGCTCGTCCAT50μ 1 反應體系包括0. 5μ 1 cDNA (lOOng/μ 1)，引物 R 和 F 各 1 μ 1 (20 μ Μ)， 4μ 1 dNTP (2. 5mM) ,0. 5μ 1 Super-L taq DNA 聚合酶(NEB 公司)，5 μ 1 10 X PCRBuffer, 38 μ 1 滅菌水。反應條件為94°C變性 3min ；94°C 30s, 54°C 45s, 72°C lmin30s,，30 個循 環(huán)；72°C 7min。將PCR擴增的GFP基因片段進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖8所示 (a. DL2000 Marker，b. GFP 基因 740bp)，與預期結果相符。反應產物經Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega公司，美國)回收純化，得到目的DNA片段。用限制性內切酶Xho I和Bgl II消化PCR回收純化產物GFP以及PM-I和PM-2載 體，經 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega 公司，美國)回收純化，得到目 的DNA片段。將酶切消化的GFP片段分別插入酶切消化的PM-I載體，篩選得到目的表達載 體PM-1-GFP-21。提取質粒用限制性內切酶消化鑒定，PM-1-GFP-21的酶切鑒定結果如圖9 所示(a. Marker III，b. Nco I 酶切 PM-l-GFP-21 1840bp 和 5800bp, c. Xho I 與 Bgl II 酶 切 PM-l-GFP-21 6900bp 和 740bp, d. Xho I 酶切 PM-l-GFP-21 7640bp, e. DLlOOO Marker)， 均與預期結果相符。送華大中生科技發(fā)展有限公司(3730自動測序儀)測序，測序結果表明獲得了序列及插入位置正確的序列表
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<212>DNA
<213>人工序列
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基因目的表達載體PM-1-GFP-21。
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權利要求
豬內源性反轉錄病毒載體PM 1，由下列DNA元件組成1)PERV的5’LTR啟動子；2)MSCVneo的延伸包裝信號；3)小鼠磷酸甘油酸脂激酶啟動子及位于PGK啟動子下游并受其調控的新霉素抗性基因；4)PERV的聚嘌呤區(qū)域PP及其3’LTR啟動子；5)大腸桿菌質粒骨架，包括大腸桿菌和氨芐青霉素抗性β內酰胺酶基因。
2.根據權利要求1所述的豬內源性反轉錄病毒載體ΡΜ-1，其特征在于所述反轉錄病 毒載體PM-I的核苷酸序列如序列表中序列11所示。
3.權利要求1所述豬內源性反轉錄病毒載體PM-I的構建方法，包括以下步驟1)按照豬PERV全基因序列與MSCVne0序列設計5對引物，擴增P_5’LTR片段的引物 對具有序列表中序列1和序列2的核苷酸序列，擴增Ψ片段的引物對具有序列表中序列3 和序列4的核苷酸序列，擴增P-3’ LTR片段的引物對具有序列表中序列5和序列6的核苷 酸序列，擴增neo片段的引物對具有序列表中序列7和序列8的核苷酸序列，擴增O-Amp片 段的引物對具有序列表中序列9和序列10的核苷酸序列，然后PCR擴增得到P-5’LTR、Ψ、 P-3，LTR、neo 和 O-Amp 片段；2)通過重疊PCR技術及酶切連接的方法構建出豬內源性反轉錄病毒載體PM-1。
4.根據權利要求3所述的構建方法，其特征在于所述步驟1)的PCR反應體系包括 0. 5μ 1 cDNAdOOng/μ 1)，弓 ι物 R 禾口 F 各 1μ 1(20μΜ)，4μ 1 dNTP (2. 5mM), 0. 5 μ 1 Super-L taq DNA聚合酶，5 μ 1 10XPCR Buffer, 38 μ 1滅菌水；PCR反應條件為先94°C變性3min ； 然后 94°C 30s, 56°C 45s, 72°C lmin30s，30 個循環(huán)；最后 72°C 7min。
5.根據權利要求3所述的構建方法，其特征在于所述步驟2)的重疊PCR的反 應體系包括0·5μ1 cDNA KlOOng/μ 1)+0. 5μ 1 cDNA 2 (lOOng/μ 1)，弓| 物 R 禾口 F 各 1 μ 1 (20 μ Μ), 4 μ 1 dNTP (2. 5mM), 0. 5 μ 1 Super-L taq DNA聚合酶，5 μ 1 10XPCR Buffer, 37. 5μ1 滅菌水；反應條件為先 94°C 變性 3min;然后 94°C 30s, 56 °C lmin，72°C Imin 30s, 30 個循環(huán)；最后 72°C 7min。
6.含有權利要求1或2所述豬內源性反轉錄病毒載體PM-I的表達載體、轉基因細胞系 或宿主菌。
7.—種表達外源基因的方法，是在權利要求1或2所述在豬源細胞中特異表達或可 在其它哺乳動物細胞表達的質粒型反轉錄病毒載體PM-I的多克隆位點處插入其它外源基 因，當轉染細胞后可被包裝成復制缺陷型的豬內源性反轉錄病毒粒子，直接感染體外培養(yǎng) 的細胞系，在細胞系中表達外源基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了豬內源性反轉錄病毒載體及其構建方法與應用。本發(fā)明構建的載體具有以下優(yōu)點1)能高效感染多種細胞，具有廣泛的宿主范圍；2)能高效地將目的基因整合進所侵染的細胞基因組中，并高水平表達；3)具有高效侵染的特性，能將重組目的基因傳遞給整個細胞群體，更適合于基因治療等用途；4)與組織特異性啟動子結合，則可能達到目的基因在特定組織或器官中定位表達的目的。
文檔編號C12N5/10GK101899472SQ20091024339
公開日2010年12月1日 申請日期2009年12月22日 優(yōu)先權日2009年12月22日
發(fā)明者丁芳, 馮書堂, 呂茂民, 吳健敏, 徐述, 章金剛, 馬玉媛 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院野戰(zhàn)輸血研究所;廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所