專利名稱：Cad及ami易感性診斷試劑盒和snp在其制備中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種冠心病(Coronary artery disease,CAD)及急性心肌梗塞(Acute myocardial infarction, AMI)易感性檢測(cè)試劑盒，以及一種SNP在制備冠心病及急性心肌 梗塞易感性檢測(cè)試劑盒中的用途。
背景技術(shù)：
冠心病和急性心肌梗塞是西方發(fā)達(dá)國家第一大病，其致死率居所有疾病中的第一 位。據(jù)美國心臟協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，全美約有1260萬人患有CAD，750萬人患有AMI。僅在1999年， 美國有52萬多人死于CAD和AMI。在40歲以上的人群中，約有49%的男性，32%的女性受 到慢性CAD的威脅[1]。2002年，美國醫(yī)療保障系統(tǒng)在CAD方面的花費(fèi)總額大約為111，8億 美元，已給國家?guī)沓林氐慕?jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。在我國，隨著老年化進(jìn)程的加速，以及人民生活水 平的大幅度改善，該病業(yè)已成為威脅我國人口健康的重要疾病之一。其在我國發(fā)病率和死 亡率呈迅速上升趨勢(shì)，是中國居民死因構(gòu)成中上升最快的疾病。據(jù)衛(wèi)生部心血管部防治辦 公室統(tǒng)計(jì)資料預(yù)測(cè)1998年至2008年間，中國男性發(fā)病率將較以往同期增加26. 1%，女性 將增加19. 0%，估計(jì)中國每年死于各種CAD的人數(shù)將超過100萬。大部分CAD和AMI的病理基礎(chǔ)是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)，脂 蛋白以及單核細(xì)胞進(jìn)入血管內(nèi)膜下組織，來自血液的單核細(xì)胞吞噬大量脂質(zhì)轉(zhuǎn)變成為泡沫 細(xì)胞，從而觸發(fā)AS過程[2_8]導(dǎo)致CAD ；在AS的基礎(chǔ)上，炎癥細(xì)胞聚集于損傷部位，局部炎癥 反應(yīng)或其它的損傷導(dǎo)致內(nèi)膜細(xì)胞的破壞，引起血管粥樣斑塊的破裂，及進(jìn)一步的侵蝕與伴 隨的組織因子釋放，引起血小板激活并形成血栓則將最終導(dǎo)致AMI的發(fā)生[2_8]。臨床上，無 明顯粥樣斑塊破裂或動(dòng)脈內(nèi)膜嚴(yán)重破壞的患者，病人可能只有穩(wěn)定性心絞痛的癥狀，然而 一旦動(dòng)脈壁的完整性遭到破壞，并產(chǎn)生血栓，病人則極有可能出現(xiàn)不穩(wěn)定性心絞痛，并導(dǎo)致 AMI而突發(fā)心臟病引起死亡。臨床和流行病學(xué)研究顯示CAD和AMI的發(fā)病與多種危險(xiǎn)因素有關(guān)，包括吸煙、老 齡化、性別、高脂肪飲食，低抗氧化水平、傳染性病原體、個(gè)人的心絞痛病史、AMI家族史、肥 胖、糖尿病、高血壓、血漿甘油三酯的升高、，以及高密度脂蛋白膽固醇的降低等，而血液中 Lp(a)、同型半胱氨酸、C反應(yīng)蛋白、載脂蛋白E、纖維蛋白原以及血漿酶原水平的升高，則是 近年來發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致CAD和AMI的一些新的危險(xiǎn)因素[2_8]?？傊珻AD/ΜΙ是由多種環(huán)境因素 和遺傳因素相互作用所致的復(fù)雜性疾病。發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、臨床表現(xiàn)多變、對(duì)治療效果存在明 顯的個(gè)體差異、沒有根本治愈疾病的方法。疾病往往有一個(gè)逐漸發(fā)展過程，早期病變較輕和 較易治療，但較難診斷和發(fā)現(xiàn)；而晚期病變較重，基本上沒有治愈的可能，只能依賴替代、對(duì) 癥和姑息治療；被動(dòng)地延緩病人的生命。這在病人生理和心理上、病人家庭和社會(huì)的經(jīng)濟(jì) 上、乃至醫(yī)療資源合理利用上均會(huì)帶來極大的負(fù)擔(dān)。因此，如果能夠早期預(yù)測(cè)疾病的易感 性，判斷高危人群，早做預(yù)防，及早診治，將有利于降低疾病的發(fā)病率和致殘率，并提高疾病 的治愈率。不論以上何種因素引發(fā)的CAD和AMI，均受到患者本身的遺傳基因的調(diào)控，而流行病學(xué)研究表明，患者的家族史是可引發(fā)CAD和AMI的最主要因素te_7]，這進(jìn)一步說明了基因 與該疾病發(fā)生的相關(guān)性。因此，發(fā)現(xiàn)這些與CAD和AMI相關(guān)的易感基因，并根據(jù)發(fā)現(xiàn)的易感 基因診斷病人患CAD和AMI的可能性，將促進(jìn)疾病的早期預(yù)防、做到及早治療并改善預(yù)后。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了 rsl2050757位點(diǎn)T等位基因與CAD及MI的相關(guān)性，并據(jù)此開發(fā)了 CAD及MI易感性檢測(cè)試劑盒，和rsl2050757位點(diǎn)T等位基因在制備檢測(cè)CAD及MI易感性 的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)冠心病及急性心肌梗塞易感性的試劑盒，其 中包括檢測(cè)樣本中rs 12050757基因型的試劑，所述rs 12050757位點(diǎn)信息為 AGAAAAAGAAAGATTGCCTATAAAAG「C/Tl ATGACAATTAGATCAACCACAGACT。如果樣本中檢測(cè)到 rsl2050757位點(diǎn)等位基因?yàn)門，則說明提供該樣本的個(gè)體具備冠心病及急性心肌梗塞易感性。該試劑盒可以為采用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)檢測(cè)SNP的試劑，只要其能夠檢出樣 本中rsl2050757位點(diǎn)是否存在T等位基因。其包括但不限于下面列舉的各實(shí)施方式。在第一實(shí)施方式中，該試劑盒包括利用測(cè)序法檢測(cè)樣本中rsl2050757位點(diǎn)T等位 基因存在的試劑。測(cè)序法是本領(lǐng)域所公知的技術(shù)，所需的引物等試劑本領(lǐng)域普通技術(shù)人員 均可根據(jù)需要自行選擇(參見ABLBeckman等公司測(cè)序儀相關(guān)使用說明)，在此不再贅述。 利用該試劑盒，通過測(cè)序法可以直接測(cè)得樣本中rsl2050757的序列，從而判斷其是否攜帶 T等位基因，進(jìn)而判斷其冠心病及急性心肌梗塞易感性。在第二實(shí)施方式中，所述試劑盒包括利用Taqman探針SNP檢測(cè)法檢測(cè)樣本中 rsl2050757基因型的試劑。其中所用Taqman探針為針對(duì)rsl2050757設(shè)計(jì)的探針，該探針 可以使用試劑公司提供的探針如ABI公司的相應(yīng)探針(_32199671_10 ；也可使用軟件自行 設(shè)計(jì)，如 PREMIER Biosoft 公司的 BeaconDesigner 7. 5。在第三實(shí)施方式中，所述試劑盒為利用PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性法檢測(cè)樣本中 rs 12050757基因型的試劑盒。該試劑盒中包括用于擴(kuò)增rs 12050757的引物，PCR試劑、對(duì) 照樣本和檢測(cè)構(gòu)象的電泳所需試劑。所述電泳優(yōu)選非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。對(duì)照樣本 中包括rs 12050757位點(diǎn)CC純合子的陰性對(duì)照樣本和rs 12050757位點(diǎn)TT純合子的陽性對(duì) 照樣本中的至少一個(gè)，還可以包括也可以不包括雜合子CT對(duì)照樣本。優(yōu)選同時(shí)包括上述三 種對(duì)照樣本。待測(cè)樣本擴(kuò)增產(chǎn)物與對(duì)照樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)電泳，比較其電泳結(jié)果可以得 出待測(cè)樣本中rsl2050757是否攜帶T等位基因的檢測(cè)結(jié)果。上述第一、第二和第三實(shí)施方式的試劑盒中包括設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl2050757的引 物，該引物具有如下特征1)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度在100_300bp之間；2)引物長(zhǎng)度在15 30堿基之間；3) G+C含量在40 % 60 %之間；4)堿基隨機(jī)分布；5)引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)；和6)引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。
4
該引物可以采用軟件來設(shè)計(jì)，(如使用ft~imer5、01igo6等)，例如，可 以采用如下所述引物對(duì)上游引物5 ‘ GGAAGTCCCACAAGTAGAAA 3 ‘；下游引物 5' CCCACAGTAACACCCAAG 3'。本發(fā)明提供了一種SNP在制備診斷冠心病及急性心肌梗塞易感性的試劑盒中的 用途，其中所述SNP為rsl2050757，如果樣本中檢測(cè)到rsl2050757位點(diǎn)攜帶T等位基因的 存在，則說明提供該樣本的個(gè)體具備冠心病及急性心肌梗塞易感性。所制備試劑盒為上述試劑盒中的至少一種，也可以是利用其他本領(lǐng)域已知的技術(shù) 鑒定該SNP存在的其他試劑盒。


圖1為根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式利用ABI公司提供的探針(貨號(hào) C_32199671_10)開展Taqman探針法realtime PCR檢測(cè)SNP位點(diǎn)結(jié)果截圖。圖2為利用PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性法檢測(cè)SNP的結(jié)果圖。左側(cè)兩條電泳帶為兩個(gè) 純合子，最右側(cè)一條電泳帶為雜合子。
具體實(shí)施例方式鑒于基因與CAD及AMI發(fā)生的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)CAD及AMI的易感基因成為CAD及AMI 治療研究的首要任務(wù)。目前，有三種遺傳學(xué)手段可用來研究如CAD等人類多基因遺傳病[9](1)對(duì)大家系進(jìn)行連鎖分析以定位疾病基因，然后通過突變分析發(fā)現(xiàn)致病基因。由 于大家系難以收集，一些常見疾病發(fā)病時(shí)間較晚，擬表型(phenocopy)的干擾等問題的存 在，使得這一方法在研究常見的復(fù)雜性疾病方面困難重重；(2)候選基因關(guān)聯(lián)分析法。即對(duì)已知候選基因中1-5個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorhism, SNP)位點(diǎn)進(jìn)行基因型分型，對(duì)其在病人群體和對(duì)照群體中頻率 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，或者對(duì)基因數(shù)據(jù)進(jìn)行單倍型(即一條染色體上的多個(gè)SNP的組合)分型，然 后對(duì)每一個(gè)單倍型在病人群體和對(duì)照群體中頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。如所研究SNP位于外顯子 或剪切位點(diǎn)，或可能的啟動(dòng)子區(qū)域，則該SNP有可能與所研究疾病直接相關(guān)。候選基因關(guān)聯(lián) 分析法只局限于對(duì)已知基因的研究，而且經(jīng)常會(huì)引起假陽性、假陰性，同時(shí)選擇候選基因時(shí) 往往易受到主觀性的影響，而對(duì)多個(gè)SWs組合或者單倍型的協(xié)同作用不能做出客觀分析， 這些缺陷限制了其在搜尋人類復(fù)雜性疾病易感基因中的廣泛應(yīng)用；(3)全基因組SNP關(guān)聯(lián)分析。這是一項(xiàng)近年日益受到重視的研究多基因疾病的手 段。全基因組SNP關(guān)聯(lián)分析具有客觀性的優(yōu)勢(shì)，用這種方法可將整個(gè)人類基因組與某種多 基因病的臨床表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析[1°_14]。但這種方法的巨大費(fèi)用限制了它的大規(guī)模應(yīng)用。但 近年來，大容量的SNP數(shù)據(jù)庫的建立，DNA分型新技術(shù)的發(fā)展使得其成本大為降低，為該技 術(shù)在發(fā)現(xiàn)人類復(fù)雜性疾病的易感基因的應(yīng)用創(chuàng)造了條件?？偠灾?，由于最近1-2年新技術(shù)的發(fā)展和成本的降低，使應(yīng)用全基因組SNP關(guān)聯(lián) 分析對(duì)復(fù)雜疾病進(jìn)行研究已經(jīng)成為可能。在本項(xiàng)研究中，發(fā)明人應(yīng)用全基因組SNP關(guān)聯(lián)分析，通過人類基因組中廣泛分布 的SNPs，對(duì)CAD人群和正常對(duì)照人群進(jìn)行基因DNA分型和統(tǒng)計(jì)分析。在該統(tǒng)計(jì)分析中，如 果某個(gè)SNP的一種等位基因或基因型的頻率在以上兩類人群中出現(xiàn)顯著的差異，那么這個(gè)SNP則被認(rèn)為可能與CAD相關(guān)。然后將這些結(jié)果在其它患者群體中加以驗(yàn)證，只有通過驗(yàn)證 而繼續(xù)陽性的SNP或基因才是真正的CAD易感基因。通過這種方法，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在中國人群中，rsl2050757位點(diǎn)T等位基因與CAD及 AMI相關(guān)，是其易感基因位點(diǎn)。這是第一次對(duì)中國人冠心病人群進(jìn)行全基因組SNPs研究，并 首次將rsl2050757位點(diǎn)T等位基因與CAD及AMI相關(guān)聯(lián)。下面說明發(fā)現(xiàn)該關(guān)聯(lián)性的具體 方法和流程。1、建立標(biāo)準(zhǔn)化臨床標(biāo)本庫及信息管理系統(tǒng)冠心病病人的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)是1)AMI 存在以下癥狀中的至少兩種持續(xù)胸痛30 分鐘以上，心電圖符合AMI，達(dá)到MI標(biāo)準(zhǔn)的顯著CK的MB同工酶(CK-MB)升高；或2)冠狀 動(dòng)脈旁路移植術(shù)，冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)，冠狀動(dòng)脈球囊擴(kuò)張/支架術(shù)，或血管造影發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈 70%以上狹窄。凡符合其中一項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)，即診斷為冠心病。所有的正常對(duì)照都是通過血管造 影，沒有發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈狹窄的個(gè)體。所有參與研究的這些病例和正常對(duì)照，都志愿接受跟蹤 調(diào)查，同時(shí)建立有相應(yīng)的完整資料庫。2、對(duì)冠心病患者進(jìn)行分子分型，并對(duì)分型結(jié)果進(jìn)行可靠性分析總實(shí)驗(yàn)流程如下(1) SNP芯片掃描對(duì)大于200例中國漢族冠心病病人和大于200例對(duì)照進(jìn)行了全 基因組90萬SNP的全基因組掃描和CNV位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析，統(tǒng)計(jì)分析，獲得與中國漢族人群冠 心病相關(guān)的易感位點(diǎn)。(2)大樣本驗(yàn)證另外選擇大于400對(duì)CAD病人-對(duì)照人群進(jìn)行對(duì)最顯著的10個(gè) SNP位點(diǎn)的等位基因分布頻率調(diào)查，篩選出其中在CAD人群中頻率顯著高于對(duì)照組的位點(diǎn)。3、統(tǒng)計(jì)分析(1)對(duì)每一個(gè)SNP數(shù)據(jù)單獨(dú)分析。首先計(jì)算該SNP每一等位基因在病人群體和對(duì) 照群體中的頻率。然后對(duì)小等位基因頻率(minor allele frequency, MAF)進(jìn)行卡方檢驗(yàn) (Chi-square test)禾口Fisher精確檢測(cè)分析(Fisher exact test) (two-tailed, = 0. 05), 獲得P值，以及95%的置信區(qū)間。如果MAF小于5%，那么僅使用Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行分 析。(2)以PHASE程序估計(jì)每個(gè)基因的所有分型SNP構(gòu)成的單倍型，把每一個(gè)單倍型作 為一個(gè)SNP的等位基因處理，檢測(cè)其在兩組數(shù)據(jù)(病例和對(duì)照)之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)全基因組SNPs掃描，最大缺陷是存在許多假陽性，對(duì)于那些在一期研究中P < 10_6的SNPs，在二期驗(yàn)證收集的數(shù)據(jù)中，進(jìn)行SNP分型和統(tǒng)計(jì)分析。重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，基因型 分型將用DNA測(cè)序法完成。4、確定冠心病易感基因通過以上對(duì)患者和對(duì)照的全基因組SNPs的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)和冠心病顯著相關(guān)的 SNP，并把這個(gè)基因定為易感基因。5、結(jié)果發(fā)明人首先對(duì)230例中國漢族冠心病病人和230例對(duì)照進(jìn)行了全基因組90萬SNP 和CNV位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析，獲得了與中國漢族人群冠心病相關(guān)的易感位點(diǎn)13個(gè)(P< 10_2).表1 一期SNP芯片分析結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)冠心病及急性心肌梗塞易感性的試劑盒，其中包括檢測(cè)樣本 中特定SNP位點(diǎn)rs 12050757的基因型的試劑，所述rs 12050757序列信息為 AGAAAAAGAAAGATTGCCTATAAAAG[C/T]ATGACAATTAGATCAACCACAGACT。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，所述試劑盒包括利用測(cè)序法檢測(cè)樣本中rsl2050757的 基因型的試劑。
3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，所述試劑盒包括利用Taqman探針SNP檢測(cè)法檢測(cè)樣本 中rsl2050757的基因型的試劑。
4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述試劑盒為利用PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性法檢測(cè)樣 本中rsl2050757的基因型的試劑盒。
5.一種SNP在制備診斷冠心病及急性心肌梗塞易感性的試劑盒中的用途，其中所述 SNP 為 rs 12050757，所述 rs 12050757 序列信息為 AGAAAAAGAAAGATTGCCTATAAAAG[C/T] ATGACAATTAGATCAACCACAGACT，如果樣本中檢測(cè)到rsl2050757位點(diǎn)等位基因?yàn)門，則說明提 供該樣本的個(gè)體具備冠心病及急性心肌梗塞易感性。
6.如權(quán)利要求5所述的用途，其中所述試劑盒為權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明提供一種冠心病及急性心肌梗塞易感性檢測(cè)試劑盒和SNP在該試劑盒制備中的用途，所涉及的SNP為rsl2050757。發(fā)明人驗(yàn)證了rsl2050757位點(diǎn)T等位基因與冠心病及急性心肌梗塞易感性之間的顯著相關(guān)性，據(jù)此通過檢測(cè)rsl2050757位點(diǎn)T等位基因，可以預(yù)測(cè)受試者的冠心病及急性心肌梗塞易感性，從而能夠促進(jìn)疾病的早期預(yù)防和治療。所述試劑盒可以利用測(cè)序、Taqman探針SNP檢測(cè)、PCR-SSCP和其他本領(lǐng)域已知可用于檢測(cè)樣本中特定SNP存在與否的技術(shù)來檢測(cè)樣本中rsl2050757的基因型，進(jìn)而判斷受試者是否具有冠心病及急性心肌梗塞易感性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102108396SQ200910243600
公開日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2009年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月29日
發(fā)明者何青, 周曉陽, 孫福成, 季福綏, 戴大鵬, 歐陽濤, 肖堯, 蔡劍平, 許峰, 賈娜 申請(qǐng)人:何青, 蔡劍平