專利名稱：一種尾葉紫薇微衛(wèi)星dna分子標記及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA分子標記技術(shù)，具體地說，涉及一種尾葉紫薇微衛(wèi)星DNA分子標記 及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
尾葉紫薇(Lagerstroemia caudata)，屬千屈菜科(Lythraceae)紫薇屬落葉大喬 木，高18 30米，胸徑約40厘米；樹皮光滑，褐色，成片狀剝落；全株無毛；花期4-5月，果 期7-10月。尾葉紫薇開花繁密，香味濃郁，是培育芳香紫薇品種的優(yōu)良親本。其在石灰?guī)r 石山稍蔭蔽的山坡上生長良好，萌蘗力較強，是石灰?guī)r石山優(yōu)良綠化樹種之一。同時，尾葉 紫薇木材堅硬、紋理細致，淡黃色，適于作上等家俱、室內(nèi)裝修、細工或雕刻等用材。尾葉紫 薇原產(chǎn)于我國，已被列為瀕危植物(《中國物種紅色名錄》第一卷，高等教育出版社，2004)。目前僅有關(guān)于尾葉紫薇單一種群結(jié)構(gòu)的研究(黃晨暉等，2008，尾葉紫薇種群結(jié) 構(gòu)和動態(tài)的初步研究，熱帶林業(yè)，36 (4)，24 26)，而關(guān)于尾葉紫薇資源分布、種群遺傳多 樣性和種質(zhì)資源保護等方面的研究尚未見報道。簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat, SSR)，也稱微衛(wèi)星DNAOiiicrosatellite)，是一種由2 5個核苷酸為單位多次串聯(lián)重復(fù)的 長達幾十甚至幾百個核苷酸的序列。這些序列廣泛存在于真核生物基因組的不同座位上， 每個座位重復(fù)單位的數(shù)量可能不完全相同，因而形成多態(tài)性。由于其具有多態(tài)性豐富、重復(fù) 性高、共顯性遺傳等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于植物的群體和進化遺傳研究、種質(zhì)資源遺傳多樣性 分析、指紋圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域。因此，開發(fā)尾葉紫薇微衛(wèi)星標記，利用其研究尾葉紫薇資源遺 傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)，對尾葉紫薇種質(zhì)資源的保護和利用具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種尾葉紫薇微衛(wèi)星DNA分子標記。本發(fā)明的另一目的是提供上述DNA分子標記的篩選方法。本發(fā)明更進一步的目的是提供上述DNA分子標記在尾葉紫薇遺傳多樣性研究中 的應(yīng)用。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種尾葉紫薇微衛(wèi)星DNA分子標記，其中擴增所 述分子標記的引物選自如下引物對DllGF 5' -GTCACAGGTTACCGAATC-3‘IlGR 5' -ATGTAAATGGTGAGGAGG-3‘2)I2BF 5' -TTCTTGTCTTGGGTATCGC-3‘I2BR 5' -GAGCCAGTATTGTCTTCACG-3‘3)12GF 5, -TTCTTCCACTTCCTCCTT-3‘I2GR 5' -CAGCCCACATTAACTTTT-3‘4)12HF 5‘ -AAAGACGCAGAAGGATGG-3‘I2HR 5' -CGATTAGTTTCAGCTCGT-3‘
5)I3GF 5' -ATGTGGTGAATGGGAACT-3‘I3GR 5' -TTGGGCTAAAGATATGGA-3‘6)I9HF 5‘ -GGACCAGATTGTAAATGC-3‘I9HR 5' -CTGCTCCTAATATCAGTGTC-3‘7)IlOHF 5' -ATTCGATCTGCCCTCTTG-3‘IlOHR 5' -ACTCGGGTTTACGTGGTG-3‘8)112HF 5‘ -TCCCTTTAACGAGGAATG-3‘I12HR 5' -AAGTTTCTCGACGGCTTT-3‘9)IIlCF 5' -GTGCTGGAGGAACTGCTA-3‘IIlCR 5' -CACGCTATTCTAAGACAAGG-3‘10)II2CF 5' -TTTGGTGGTAGTGGGAGT-3‘II2CR 5' -GTGTCTGCATGGCTGTAA-3‘11)II3AF 5‘ -CCTAACAAGAAAGGAACAG-3‘II3AR 5' -TTTCAGGACATCAGCACC-3‘12)II3HF 5‘ -CCTCCTCCTGCCACTCCTCT-3‘II3HR 5' -CCCGTCGTCTCCTCAGTTCTC-3‘13)II6AF 5‘ -AGTTACTTATCTCCGCATTC-3‘II6AR 5' -GACCATTTTACCCTTTCA-3‘14)II8AF 5‘ -AAGATATGCTGTTGAGTTT-3‘II8AR 5' -TTCACAAAAGAAAGGAAG-3‘15)II12AF 5‘ -CAACAGTAAAATTGGAGC-3‘II12AR 5' -AGTAGTGATTCGGGTGGA-3‘前述的DNA分子標記，其選自編號分別為11G、I2B、I2G、I2H、I3G、I9H、110H、112H、 II1C、II2C、II3A、II3H、II6A、II8A、II12A 的核苷酸序列，所述核苷酸序列如 SEQ ID No. 1 至 SEQID No. 15 所示。本發(fā)明的一種尾葉紫薇微衛(wèi)星DNA分子標記的篩選方法，其包括以下步驟(1)提取尾葉紫薇基因組DNA，用內(nèi)切酶Rsa I進行酶切，得到大小為300 IOOObp的 DNA 片段； (2)將寡核苷酸 SuperSNX24F (5，-GTTTAAGGCCTAGCTAGCAGAATC-3，)和末端磷酸化 的 SuperSNX24R(5，-pGATTCTGCTAGCTAGGCCTTAAACAAAA_3，)等摩爾混合，形成接頭；(3)將步驟⑵的接頭與步驟(1)的酶切產(chǎn)物連接；(4)以SuperSNX24F為引物，步驟(3)的連接產(chǎn)物為模板，進行PCR反應(yīng)，富集大小 為300 IOOObp的DNA片段；(5)合成3，Biotin標記的探針20種，將其按照要求[Group2 = (AG)12, (TG)12, (AAC)6, (AAG)8, (AAT)12, (ACT)12, (ATC)8 ；Group3 = (AAAC)6, (AAAG)6, (AATC)6, (AATG)6, (ACAG)6, (ACCT)6, (ACTC)6, (ACTG)6 ；Group4 = (AAAT)8, (AACT)8, (AAGT)8, (ACAT)8, (AGAT)8] 等體積混合(所有探針濃度均為100 μ Μ)，將混合好的探針稀釋100倍待用；(6)將步驟(4)的DNA片段分別與步驟(5)三組探針進行雜交；(7)向雜交后的溶液中加入磁珠，洗滌磁珠；
(8)向洗滌后的磁珠中加入TE，得到含有微衛(wèi)星DNA片段的上清液；(9)以SuperSNX24F為引物，步驟(7)的上清液為模板，進行PCR反應(yīng)，得到目的片 段；(10)將步驟(8)的擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，篩選轉(zhuǎn)化子，進行PCR擴增，對產(chǎn) 物大小為500 1200bp的菌液進行測序，得到50個微衛(wèi)星序列，其中包含微衛(wèi)星位點60 個；(11)根據(jù)微衛(wèi)星位點兩端的側(cè)翼序列設(shè)計引物并以8株尾葉紫薇個體基因組DNA 為模板進行SSR-PCR擴增，得到尾葉紫薇微衛(wèi)星標記15個，其編號分別為I1G、I2B、I2G、 I2H、I3G、I9H、I10H、I12H、II1C、II2C、II3A、II3H、II6A、II8A、II12A，其核苷酸序列如 SEQ ID No. 1 至 SEQ ID No. 15 所示。
利用本發(fā)明的尾葉紫薇微衛(wèi)星DNA分子標記分析尾葉紫薇個體間的遺傳學(xué)差異， 具體分析方法為
(1)分別對I1G、I2B、I2G、I2H、I3G、I9H、I10H、I12H、II1C、II2C、II3A、II3H、II6A、 II12A位點的特異性引物的正向引物的5’端進行6-FAM或JOE標記；
(2)提取尾葉紫薇不同個體的基因組DNA；
(3)分別用標記后的I1G、I2B、I2G、I2H、I3G、I9H、I10H、I12H、II1C、II2C、II3A、 II6A、II8A、II12A位點的特異性引物，擴增20株尾葉紫薇的基因組DNA。
所述特異性引物的序列分別為
IlGF IlGR I2BF I2BR I2GF I2GR I2HF I2HR I3GF I3GR I9HF I9HR IlOHF 5 IlOHR 5 I12HF 5 I12HR 5 IIlCF 5 IIlCR 5 II2CF 5 II2CR 5 II3AF 55' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5'
-JOEGTCACAGGTTACCGAATC-3 ‘
-ATGTAAATGGTGAGGAGG-3‘
-6_FAMTTCTTGTCTTGGGTATCGC-3 ‘
-GAGCCAGTATTGTCTTCACG-3‘
-JOETTCTTCCACTTCCTCCTT-3 ‘
-CAGCCCACATTAACTTTT-3‘ _6-faiaaagacgcagmggatgg_3 丨
-CGATTAGTTTCAGCTCGT-3‘
_6-famatgtggtgaatgggaact_3 ,
-TTGGGCTAAAGATATGGA-3‘ -6_FAMGGACCAGATTGTAAATGC-3 ‘ -CTGCTCCTAATATCAGTGTC-3‘ -JOEATTCGATCTGCCCTCTTG-3 ‘ -ACTCGGGTTTACGTGGTG-3‘ -6_FAMTCCCTTTAACGAGGAATG-3 ‘ -AAGTTTCTCGACGGCTTT-3‘ -JOEGTGCTGGAGGAACTGCTA-3 ‘ -CACGCTATTCTAAGACAAGG-3‘ -6_FAMTTTGGTGGTAGTGGGAGT-3 ‘ -GTGTCTGCATGGCTGTAA-3‘
6-FAM』
CCTAACAAGAAAGGAACAG-31
II3AR 5' -TTTCAGGACATCAGCACC-3‘II3HF 5' -J0ECCTCCTCCTGCCACTCCTCT_3‘II3HR 5' -CCCGTCGTCTCCTCAGTTCTC-3‘II6AF 5' -6_famAGTTACTTATCTCCGCATTC-3‘II6AR 5' -GACCATTTTACCCTTTCA-3‘II8AF 5' -J0EAAGATATGCTGTTGAGTTT-3‘II8AR 5' -TTCACAAAAGAAAGGAAG-3‘II12AF 5' -6_famCAACAGTAAAATTGGAGC-3‘II12AR 5' -AGTAGTGATTCGGGTGGA-3‘(4)分析PCR產(chǎn)物以及尾葉紫薇DNA多態(tài)位點的特征。本發(fā)明的優(yōu)點在于，提供了 15個尾葉紫薇的微衛(wèi)星位點及擴增該15個微衛(wèi)星位 點的引物序列和擴增方法，建立了尾葉紫薇的微衛(wèi)星DNA分子標記技術(shù)體系，并利用這些 標記進行尾葉紫薇遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建和分子標記輔助育種，重復(fù)性好，是一種 可靠有效的DNA分子標記。


圖1為本發(fā)明IlG位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖2為本發(fā)明I2B位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖3為本發(fā)明I2G位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖4為本發(fā)明I2H位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖5為本發(fā)明I3G位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖6為本發(fā)明I9H位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖7為本發(fā)明IlOH位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖8為本發(fā)明I12H位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖9為本發(fā)明IIlC位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖10為本發(fā)明II2C位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖11為本發(fā)明II3A位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖12為本發(fā)明II3H位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖13為本發(fā)明II6A位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖14為本發(fā)明II8A位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；圖15為本發(fā)明II12A位點的引物擴增20個尾葉紫薇基因組DNA的STR分型圖；其中，圖1 圖15中1 20分別表示20個不同的尾葉紫薇單株，橫坐標代表擴 增產(chǎn)物大小，縱坐標代表擴增強度。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1尾葉紫薇微衛(wèi)星文庫的構(gòu)建包括如下步驟(1)提取尾葉紫薇基因組DNA(DNA secure Plant Kit，購自天根生物)，用內(nèi)切酶
6Rsa I和Xmn I進行酶切，酶切體系為2. 5 μ L連接緩沖液(NEB)，0. 25 μ L 100 XBSA (NEB), 0. 25 μ L NaCl (5Μ)，1 μ LRsa I (NEB)，1 μ L Xmn I (NEB)，20 μ L DNA(100ng/L)，于 37°C，酶切 40小時，得到大小為300 IOOObp的DNA片段；(2)將 10 μ M 寡核苷酸 SuperSNX24F (5，-GTTTAAGGCCTAGCTAGCAGAATC-3，)和末端 磷酸化的 SuperSNX24R(5，-pGATTCTGCTAGCTAGGCCTTAAACAAAA_3，)等體積混合，95°C變性 10分鐘，緩慢冷卻至室溫，形成接頭；(3)將步驟(2)的接頭7 μ L、T4DNA連接酶(NEB) 2 μ L和10 X連接緩沖液1 μ L混 合后，加入到(1)的酶切產(chǎn)物中，22°C連接2小時后，置于4°C連接40小時以上；(4)以SuperSNX24F為引物，步驟(3)的連接產(chǎn)物為模板，進行PCR反應(yīng)，體系 為 2.5yL 10XPCR 緩沖液，2. 5μ L BSA, 1. 3 μ LSuperSNX24F (10 μ Μ), 1. 5 μ L dNTPs (各 2. 5mM)，2 μ L MgCl2 (25mM)，13 μ L dH20,0. 2 μ L Taq 酶(5U/ μ L)，2 μ L 連接產(chǎn)物，反應(yīng)程序 為 95°C 2min ；95°C 20sec,60°C 20sec，72°C 1. 5min，35 個循環(huán)反應(yīng)；15°C保溫。用 2% 的瓊 脂糖凝膠電泳檢測反應(yīng)產(chǎn)物，富集大小為300 IOOObp的DNA片段；(5)合成3，Biotin標記的探針20種，分為三組，分別按照[Group2 = (AG)12, (TG)12, (AAC)6, (AAG)8, (AAT)12, (ACT)12, (ATC)8 ；Group3 = (AAAC)6, (AAAG)6, (AATC)6, (AATG)6, (ACAG)6, (ACCT)6, (ACTC)6, (ACTG)6 ；Group4 = (AAAT)8, (AACT)8, (AAGT)8, (ACAT)8, (AGAT)8]等體積混合(所有探針濃度均為100 μ M)，將混合好的探針稀釋100倍待用；(6)將步驟(4)的DNA片段分別與步驟(5)的三組探針進行雜交；雜交過程為將 25 μ L 2 X雜交溶液(12 X SSC，0. 2% SDS)，10 μ L生物素標記的一組探針，101 μ L步驟(4) 的DNA片段，5 μ L dH20混合，在PCR儀中進行雜交；雜交程序為95°C 5min,然后迅速降溫 到70°C，再以0. 040C /sec的速率降溫到50°C，然后在50°C保溫lOmin，再以0. 1°C /sec的 速率降溫到40°C，最后迅速降溫到15°C保溫；(7)加入 50 μ L 平衡后的磁珠(10mg/mL, Dynabeads M-280，Invitrogen)，室溫輕 搖30分鐘，使磁架分離，去除溶液；(8)用400 μ L Wl洗液(2 X SSC, 0. 1% SDS)的清洗磁珠2次，棄溶液；用400 μ L W2洗液(1XSSC，0. SDS)清洗磁珠2次，棄溶液；加入400 μ L W2洗液，40°C輕搖2分 鐘，棄溶液；加入400μ LW2洗液，50°C輕搖2分鐘，棄溶液；加入400 μ L W2洗液，45°C輕搖 2分鐘，棄溶液；(9)重復(fù)步驟(8) —次;(10)加入200yL TE，95°C保溫5分鐘，磁架分離后，得到含有微衛(wèi)星DNA片段的
上清液；(11)以SuperSNX24F為引物，步驟(10)的上清液為模板，按照步驟(4)的反應(yīng)體 系和反應(yīng)程序進行PCR反應(yīng)，得到目的片段；(12)將步驟(11)的擴增產(chǎn)物連接到 pCR2. l-T0P0(InvitrogenT0P0 Cloning Kit)載體上，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化菌液涂布在含有 50 μ g/mL氨芐青霉素和40mg/mLX-gal的LB固體培養(yǎng)基平板上進行藍白斑篩選。實施例2含尾葉紫薇微衛(wèi)星序列的陽性克隆的篩選、測序以及尾葉紫薇微衛(wèi)星引 物的設(shè)計包括如下步驟
7
(1)用牙簽挑取72個白色菌落并接種到含50 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中， 370C，150rmp培養(yǎng)40小時。以菌液為模板，進行PCR反應(yīng)；PCR 反應(yīng)體系為2. 5μ L 250 μ g/mL BSA,2. 5μ L 10 X PCR 緩沖液，1 μ L IOmM 引 物M13F 5‘-GTAAAACGACGGCCAG-3‘, 1 μ L IOmM 引物M13R 5，-CAGGAAACAGCTATGAC-3，，2 μ L 25mM MgCl2,1. 5 μ L 2. 5mM dNTP，0. 2 μ L TaqDNA聚合酶，L 5 μ L菌液，12. 8 μ LdH2O ；反應(yīng)程 序:95V 3min ；95°C 20sec,50°C 20sec，72°C 1. 5min，35 個循環(huán)反應(yīng)；15°C保溫；(2)用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測反應(yīng)產(chǎn)物，選取PCR條帶單一，產(chǎn)物大小為 500 1200bp的菌液進行測序，得到50個微衛(wèi)星序列，其中包含微衛(wèi)星位點60個；(3)根據(jù)微衛(wèi)星位點兩端的側(cè)翼序列設(shè)計引物并以8株尾葉紫薇個體基因組 DNA為模板進行SSR-PCR擴增，10 μ L反應(yīng)體系為包括IOng基因組DNA，1 X PCR緩沖液 (IOmM Tris-HCl, 50mM KCl，pH 8. 3)，dNTPs (各 250 μ M)，MgC12 (1. 5mM)，正、反向引物 (各0.5 μ M)，Taq酶(0. 5U)，反應(yīng)程序為95 °C 3min ；95°C 30sec，最佳退火溫度(48 60°C )30sec,72°C lmin，30個循環(huán)反應(yīng)；72°C 5min，15°C保溫。將各PCR產(chǎn)物在6%變性聚 丙烯酰胺凝膠上檢測各引物多態(tài)性，篩選出非特異性條帶擴增少、結(jié)果穩(wěn)定、多態(tài)性豐富的 微衛(wèi)星標記 15 個，分別為 I1G、I2B、I2G、I2H、I3G、I9H、I10H、I12H、II1C、II2C、II3A、II3H、 II6A、II8A、II12A，其核苷酸序列如 SEQ ID No. 1 至 SEQ ID No. 15 所示。實施例3利用尾葉紫薇微衛(wèi)星DNA分子標記分析尾葉紫薇不同個體間的遺傳學(xué)差
已 升具體分析方法為(1)分別對 I1G、I2B、I2G、I2H、I3G、I9H、I10H、I12H、II1C、II2C、II3A、II3H、II6A、 II8A、II12A位點的特異性引物的正向引物的5’端進行6-FAM或JOE標記；(2)提取尾葉紫薇不同單株的基因組DNA (DNA secure PlantKit，購自天根生 物)；(3)分別用 I1G、I2B、I2G、I2H、I3G、I9H、I10H、I12H、II1C、II2C、II3A、II3H、 II6A、II8A、II12A位點的特異性引物，擴增20個尾葉紫薇個體的基因組DNA。10 μ L反應(yīng)體 系為包括 IOng 基因組 DNA，IXPCR 緩沖液(IOmM Tris-HCl，50mM KCl，pH 8. 3)，dNTPs (各 250 μ Μ)，MgCl2 (1. 5mM)，正、反向引物(各 0. 5 μ Μ)，Taq 酶(0. 5U)，反應(yīng)程序為 95°C 3min ； 950C 30sec，最佳退火溫度(48 60°C )30sec,72°C lmin，30 個循環(huán)反應(yīng)；72°C 5min，15°C
保溫；
所述特異性引物的序列分別為
IlGF5'-JOEGTCACAGGTTACCGAATC-3 ‘
IlGR5'-ATGTAAATGGTGAGGAGG-3‘
I2BF5'-6_FAMTTCTTGTCTTGGGTATCGC-3
I2BR5'-GAGCCAGTATTGTCTTCACG-3‘
I2GF5'-JOETTCTTCCACTTCCTCCTT-3 ‘
I2GR5'-CAGCCCACATTAACTTTT-3‘
I2HF5'_6-FAIaaagacgcagmggatgg_3 丨
I2HR5'-CGATTAGTTTCAGCTCGT-3‘
I3GF5'_6-famatgtggtgaatgggaact_3 ,0140]
0141]
0142]
0143]
0144]
0145]
0146]
0147]
0148]
0149]
0150]
0151]
0152]
0153]
0154]
0155]
0156]
0157]
0158]
0159]
0160]
I3GR 5' I9HF 5' I9HR 5' IlOHF 5 IlOHR I12HF I12HR IIlCF IIlCR II2CF II2CR II3AF II3AR II3HF II3HR II6AF II6AR II8AF II8AR II12AF 5 II12AR 5
-TTGGGCTAAAGATATGGA-3‘ -6_FAMGGACCAGATTGTAAATGC-3 ‘ -CTGCTCCTAATATCAGTGTC-3‘ -JOEATTCGATCTGCCCTCTTG-3 ‘ -ACTCGGGTTTACGTGGTG-3‘
_6-famtccctttaacgaggaatg_3 ,
-AAGTTTCTCGACGGCTTT-3‘ -JOEGTGCTGGAGGAACTGCTA-3 ‘ -CACGCTATTCTAAGACAAGG-3‘ -6_FAMTTTGGTGGTAGTGGGAGT-3 ‘ -GTGTCTGCATGGCTGTAA-3‘ -6-FAMCCTAACAAGAAAGGAACAG-3 ‘ -TTTCAGGACATCAGCACC-3‘ -JOECCTCCTCCTGCCACTCCTCT-3 ‘ -CCCGTCGTCTCCTCAGTTCTC-3‘ -6_FAMAGTTACTTATCTCCGCATTC-3 ‘ -GACCATTTTACCCTTTCA-3‘ -JOEAAGATATGCTGTTGAGTTT-3 ‘ -TTCACAAAAGAAAGGAAG-3‘ ‘-6_FAMCAACAGTAAAATTGGAGC-3 ‘ ‘-AGTAGTGATTCGGGTGGA-3‘
0161]所述特異性引物的退火溫度分別為50 0C>50 0C>50°C>50°C>50°C、50°C、50°C、 50°C、52°C、54°C、52°C、60°C、48°C、52°C、54°C。
0162](4)將PCR產(chǎn)物用ABI377遺傳分析儀(Applied Biosystem公司)進行STR基因 分型，使用GeneMapper 4. 0軟件(Applied Biosystem公司)判讀等位基因的具體數(shù)值；
0163](5)使用Popgen 1. 32計算期望雜合度、觀察雜合度、多態(tài)信息量的值來描述尾葉 紫薇DNA多態(tài)位點的特征，結(jié)果如表1所示
0164]表115個尾葉紫薇微衛(wèi)星多態(tài)位點的特征
0165]
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權(quán)利要求
一種尾葉紫薇微衛(wèi)星DNA分子標記，其特征在于，擴增所述分子標記的引物選自如下引物對1)I1GF5′ GTCACAGGTTACCGAATC 3′I1GR5′ ATGTAAATGGTGAGGAGG 3′2)I2BF5′ TTCTTGTCTTGGGTATCGC 3′I2BR5′ GAGCCAGTATTGTCTTCACG 3′3)I2GF5′ TTCTTCCACTTCCTCCTT 3′I2GR5′ CAGCCCACATTAACTTTT 3′4)I2HF5′ AAAGACGCAGAAGGATGG 3′I2HR5′ CGATTAGTTTCAGCTCGT 3′5)I3GF5′ ATGTGGTGAATGGGAACT 3′I3GR5′ TTGGGCTAAAGATATGGA 3′6)I9HF5′ GGACCAGATTGTAAATGC 3′I9HR5′ CTGCTCCTAATATCAGTGTC 3′7)I10HF5′ ATTCGATCTGCCCTCTTG 3′I10HR5′ ACTCGGGTTTACGTGGTG 3′8)I12HF5′ TCCCTTTAACGAGGAATG 3′I12HR5′ AAGTTTCTCGACGGCTTT 3′9)II1CF5′ GTGCTGGAGGAACTGCTA 3′II1CR5′ CACGCTATTCTAAGACAAGG 3′10)II2CF5′ TTTGGTGGTAGTGGGAGT 3′II2CR5′ GTGTCTGCATGGCTGTAA 3′11)II3AF5′ CCTAACAAGAAAGGAACAG 3′II3AR5′ TTTCAGGACATCAGCACC 3′12)II3HF5′ CCTCCTCCTGCCACTCCTCT 3′II3HR5′ CCCGTCGTCTCCTCAGTTCTC 3′13)II6AF5′ AGTTACTTATCTCCGCATTC 3′II6AR5′ GACCATTTTACCCTTTCA 3′14)II8AF5′ AAGATATGCTGTTGAGTTT 3′II8AR5′ TTCACAAAAGAAAGGAAG 3′15)II12AF5′ CAACAGTAAAATTGGAGC 3′II12AR5′ AGTAGTGATTCGGGTGGA 3′
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子標記，其選自如SEQID No. 1至SEQ ID No. 15所示的 核苷酸序列。
3.權(quán)利要求1或2所述的DNA分子標記在尾葉紫薇篩選或輔助育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種尾葉紫薇微衛(wèi)星DNA分子標記，其包括15個尾葉紫薇的微衛(wèi)星位點。本發(fā)明還提供了該尾葉紫薇微衛(wèi)星DNA分子標記的篩選方法及其在尾葉紫薇遺傳多樣性研究中的應(yīng)用。此外，本發(fā)明還提供了擴增該15個尾葉紫薇微衛(wèi)星位點的引物序列和擴增方法，建立了尾葉紫薇的微衛(wèi)星DNA分子標記技術(shù)體系，并利用這些標記進行尾葉紫薇遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建和分子標記輔助育種，重復(fù)性好，是一種可靠有效的DNA分子標記。
文檔編號C12Q1/68GK101974617SQ200910244439
公開日2011年2月16日 申請日期2009年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日
發(fā)明者孫明, 宋平, 張啟翔, 潘會堂, 王學(xué)鳳, 田苗, 程堂仁, 蔡明 , 高亦珂 申請人:北京林業(yè)大學(xué)