專利名稱：應(yīng)用電旋轉(zhuǎn)技術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用電旋轉(zhuǎn)技術(shù)檢測細(xì)胞發(fā)生凋亡過程的生理變化的方法，特別是檢
測細(xì)胞發(fā)生早期凋亡變化的方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡現(xiàn)象。它 能及時有效地清除體內(nèi)過量或有潛在危險性的細(xì)胞，用于維持體內(nèi)各種類型細(xì)胞數(shù)目的平 衡。這種平衡對于促進(jìn)器官形成以及維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定至關(guān)重要。對于凋亡研究的重 要意義在于是它開啟了我們對于癌癥藥物研究的一個新的窗口。但是由于癌細(xì)胞的凋亡控 制程序缺陷、癌細(xì)胞發(fā)展出抗藥性，導(dǎo)致癌癥病人在臨床上化療后仍然會復(fù)發(fā)。目前的研究 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種不同類型的癌細(xì)胞均可從凋亡過程中復(fù)原，證明癌細(xì)胞可能利用某種未知的 逃避機(jī)制使自己在化療后繼續(xù)存活。因此，對細(xì)胞早期凋亡及其復(fù)原過程機(jī)制的研究將對 于今后的抗腫瘤工作及藥物研發(fā)方面具有重要意義，于是一種可以方便、非介入的監(jiān)測細(xì) 胞生理活性的手段就顯得十分必要。
目前針對細(xì)胞凋亡的檢測方法主要為介入性技術(shù)，可以分為如下幾類 1.使用染料對細(xì)胞某一靶點(diǎn)進(jìn)行染色，通過對熒光進(jìn)行測定得到相應(yīng)信息，如使
用羅丹明123染色線粒體，在線粒體膜電位下降時，熒光逐漸減弱；或者使用碘化丙啶對細(xì)
胞核染色，凋亡過程中，細(xì)胞核被包裹于凋亡小體中，隨凋亡的進(jìn)程，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核逐漸減
少，熒光強(qiáng)度降低。對細(xì)胞染色一般使用激光掃描共聚焦顯微鏡或者流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。 2. DNA片斷化是凋亡晚期的一個重要特征。普通的瓊脂糖凝膠電泳可檢測DNA的
片斷化。將DNA提取出來，進(jìn)行電泳，凋亡細(xì)胞就會產(chǎn)生階梯狀的電泳條帶，間隔大約是
180bp。這種方法對于凋亡細(xì)胞數(shù)量多的實(shí)驗(yàn)來說較適用，但對于少量細(xì)胞則靈敏度不夠。
目前更為常用的DNA片斷化檢測方法是TUNEL法，但它的費(fèi)用也比電泳法高，而且可能會存
在壞死細(xì)胞或其它細(xì)胞的假陽性。 3.細(xì)胞凋亡會使細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞膜發(fā)生一系列生物化學(xué)和物理上的變化。 在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膨脹變圓，與鄰近細(xì)胞的聯(lián)系斷絕并且脫離后皺縮。在細(xì)胞質(zhì)中，內(nèi) 質(zhì)網(wǎng)腫脹積液形成液泡。在細(xì)胞核內(nèi)，染色質(zhì)逐漸凝集成新月狀，附在核膜周邊，嗜堿性增 強(qiáng)。最終細(xì)胞核裂解為由核膜包裹的碎片。在細(xì)胞膜上，細(xì)胞結(jié)點(diǎn)不再相連，細(xì)胞膜變得更 活躍進(jìn)而發(fā)生內(nèi)陷。這些變化都將導(dǎo)致細(xì)胞裂解為由細(xì)胞膜包裹細(xì)胞內(nèi)容物的凋亡小體。 目前可以使用固定液固定細(xì)胞，通過利用電子顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞核皺縮，或者外部 特征如細(xì)胞膜凋亡小體等判斷細(xì)胞正在處于的凋亡階段。 上面所述為目前所普遍流行的檢測凋亡技術(shù)，但它們?nèi)曰蚨嗷蛏俅嬖谝恍﹩栴}。 對于其中眾多手段來說，研究對象的不同可能導(dǎo)致研究結(jié)果與真實(shí)情況嚴(yán)重偏離。首先的 一個問題就是不同研究對象的受體或者蛋白的表達(dá)不同。比如A皿exin V實(shí)驗(yàn)，不同細(xì)胞 由于本身細(xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸表達(dá)數(shù)量的不同，可能造成的結(jié)果就是，同一種方法應(yīng)用 在高表達(dá)的細(xì)胞上會得到比較滿意的結(jié)果，但是對于那些低表達(dá)磷脂酰絲氨酸的細(xì)胞在凋亡過程中則可能根本看不到明顯的變化。再比如目前公認(rèn)在凋亡過程中起重要作用的 caspase家族蛋白，在不同種屬不同組織的細(xì)胞內(nèi)部的表達(dá)也截然不同，如乳腺癌細(xì)胞系 MCF-7缺少功能性caspase-3蛋白，所以當(dāng)使用DEVD底物來檢測caspase-3活性時，凋亡情 況可能會被低估。 另外一個問題就是不同生化事件或活性的時間點(diǎn)往往是不同的，很多蛋白或受體 的表達(dá)在某一時間點(diǎn)會迅速達(dá)到峰值，然后下降。如果錯過這個時間段，將導(dǎo)致結(jié)論嚴(yán)重錯 誤。比如在使用抗Fas單克隆抗體處理Jurkat細(xì)胞后，caspase-8活性在處理后2小時開 始迅速增加，3小時就達(dá)到峰值，此后活性逐漸下降。但如果在檢測時比較1小時和7小時 溶劑對照組和抗Fas單克隆抗體處理組的caspase-8活性，則會認(rèn)為信號太弱從而得出該 處理方式不會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的結(jié)果，造成結(jié)論錯誤。 除了以上兩個問題以外，最重要的問題是，目前常用的檢測手段無一例外的對于 被測物有介入性，即通過額外加入一種或多種物質(zhì)，使被測物發(fā)生可以用光學(xué)或其他手段 檢測到的，化學(xué)的或生物化學(xué)的變化，比如染色、或者裂解、固定細(xì)胞，然后通過儀器檢測得 到相應(yīng)的結(jié)果。在整個檢測過程中，細(xì)胞由于檢測手段所限，其必要的物質(zhì)因素的加入，會 造成被測本體本身生理的或多或少的變化，甚至死亡。另外采用這樣的手段研究，一旦有染 料等物質(zhì)介入，就無法對樣本繼續(xù)觀察它們在后面過程中的變化，要了解一個過程，就只能 采用多批的樣本分別達(dá)到過程的各階段，分別觀察。 包括電旋轉(zhuǎn)在內(nèi)的電動力學(xué)技術(shù)是一種新興的、非介入性的、簡單靈活的分析手 段。對于電旋轉(zhuǎn)技術(shù)，它的最大優(yōu)勢是它的非介入性，僅僅通過外部施加電場，計(jì)算不同頻 率下細(xì)胞轉(zhuǎn)速就能得到相關(guān)的電生理參數(shù)，從而推斷出細(xì)胞處于不同的生理狀態(tài)。目前已 有少量文獻(xiàn)報(bào)道同為電動力學(xué)技術(shù)之一的介電泳作為一種區(qū)分正常細(xì)胞與凋亡細(xì)胞的技 術(shù)。而在電旋轉(zhuǎn)領(lǐng)域，仍未有文獻(xiàn)報(bào)道其用于檢測細(xì)胞早期凋亡時的變化。如果早期凋亡 過程中細(xì)胞介電性發(fā)生改變，那么我們借助電旋轉(zhuǎn)等電動力學(xué)技術(shù)的非介入性，不需要使 細(xì)胞發(fā)生變化就可將正常細(xì)胞與凋亡不同程度的個體細(xì)胞區(qū)分開來，保持活性然后對同一 個體繼續(xù)培養(yǎng)或進(jìn)行下一步研究，這種方法還便于采用同一批試樣檢測凋亡的整個過程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種應(yīng)用電旋轉(zhuǎn)技術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中檢
測細(xì)胞凋亡時由于不同研究對象的受體或者蛋白的表達(dá)不同，或由于不同生化事件或活性
的時間點(diǎn)往往不同，造成現(xiàn)有技術(shù)的檢測不準(zhǔn)確；且現(xiàn)有的檢測手段對于被測物有介入性， 無法繼續(xù)觀察被測物在后面過程中的變化。 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的一種應(yīng)用電旋轉(zhuǎn)技術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡的方法， 包括如下步驟 (1)對于待測細(xì)胞，向其所處的液體介質(zhì)內(nèi)加入凋亡誘導(dǎo)因子，使待測細(xì)胞發(fā)生凋 亡； (2)將待測細(xì)胞懸浮于液體介質(zhì)中，加入到電旋轉(zhuǎn)檢測池當(dāng)中； (3)采用與所述電旋轉(zhuǎn)檢測池中液體介質(zhì)相同的液體介質(zhì)，向電旋轉(zhuǎn)池中灌流； (4)在電旋轉(zhuǎn)池內(nèi)產(chǎn)生均勻的旋轉(zhuǎn)電場，使待測細(xì)胞發(fā)生電旋轉(zhuǎn)行為； (5)改變旋轉(zhuǎn)電場的頻率，以測定細(xì)胞在相應(yīng)條件下的轉(zhuǎn)速，得到電旋轉(zhuǎn)譜圖。
4
其中，步驟(1)中的所述凋亡誘導(dǎo)因子為腫瘤壞死因子、轉(zhuǎn)化生長因子、糖皮質(zhì)激 素、病毒、細(xì)菌、自由基或化療藥物。其中，步驟(3)中所述的灌流速度為0. lmL/min-0. 5mL/min。
其中，所述灌流速度為0. 25mL/min。 其中，步驟(4)中所述產(chǎn)生均勻的旋轉(zhuǎn)電場為在電旋轉(zhuǎn)測量池的四周均勻分布
的四個鉑金電極上依次施加相位依次相差90°的四路正弦電信號。 其中，所述正弦電信號的電壓的振幅范圍為1V-20V。 其中，所述正弦電信號的電壓的振幅范圍為6V-10V。 其中，步驟(5)中旋轉(zhuǎn)電場的頻率范圍為lkHz-lGHz。 其中，所述液體介質(zhì)的電導(dǎo)率為1 y S/cm-2mS/cm。 其中，所述液體介質(zhì)的電導(dǎo)率為200 ii S/cm-800 ii S/cm。 本發(fā)明使用電旋轉(zhuǎn)技術(shù)作為一種非介入手段檢測細(xì)胞的早期凋亡，在細(xì)胞早期凋 亡可以逆轉(zhuǎn)的時期即可區(qū)別出正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞，不受不同研究對象的受體或者蛋白的 表達(dá)不同，或不同生化事件或活性的時間點(diǎn)不同的影響，保證了檢測的準(zhǔn)確度。并且本發(fā)明 的檢測方法使得被測物能夠保持活性，使得被測物可以繼續(xù)培養(yǎng)或進(jìn)行下一步研究。本方 法適用的范圍包括單細(xì)胞生物以及植物細(xì)胞和動物細(xì)胞，特別適合于哺乳動物的正常細(xì)胞 和腫瘤細(xì)胞。相對于目前研究凋亡的其他技術(shù)可做到對單一批或單個個體連續(xù)研究，并且 實(shí)驗(yàn)證明測定過程對被測物生理活性并無影響。


圖1為本發(fā)明用于檢測細(xì)胞早期凋亡的電旋轉(zhuǎn)芯片及灌流裝置的結(jié)構(gòu)簡圖； 圖2為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡不同時間后的電旋轉(zhuǎn)圖譜； 圖3a為活性氧染料DCFH-DA對不同凋亡時間的細(xì)胞的染色結(jié)果圖； 圖3b為細(xì)胞在不同凋亡時間下活性氧水平的比較； 圖4a為Annexin V-FITC/PI試劑盒處理不同凋亡時間的細(xì)胞的結(jié)果圖； 圖4b為細(xì)胞在不同凋亡時間點(diǎn)經(jīng)過Annexin V-FITC染色后熒光水平的比較； 圖5為細(xì)胞在不同凋亡時間點(diǎn)的掃描電子顯微鏡下的形態(tài)圖。 附圖標(biāo)記說明 1-灌流進(jìn)水毛細(xì)管；2_灌流出水毛細(xì)管；3_鉑金電極；4_底板；5_檢測池；
具體實(shí)施例方式
為了使本發(fā)明的特點(diǎn)能夠更好地被理解，以下將列舉較佳實(shí)施例并結(jié)合附圖進(jìn)行 詳細(xì)說明。 本發(fā)明應(yīng)用電旋轉(zhuǎn)技術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡的方法，其原理為在細(xì)胞凋亡的過程 中，細(xì)胞膨脹變圓、細(xì)胞膜上微絨毛逐漸減少甚至消失、凋亡小體的出現(xiàn)、細(xì)胞膜離子通道 開放導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鉀離子大量丟失、大量增加的活性氧攻擊生物膜磷脂中的多不飽和脂肪酸 引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用等伴隨現(xiàn)象都在很大程度上影響著細(xì)胞的形態(tài)，和細(xì)胞膜以及細(xì)胞內(nèi) 部的介電性質(zhì)，這些因素的改變都與細(xì)胞在電旋轉(zhuǎn)中的行為存在關(guān)聯(lián)，使得可能利用電旋 轉(zhuǎn)測量作為一個手段來檢測細(xì)胞的早期凋亡。
凋亡早期細(xì)胞膨脹變圓、細(xì)胞表面微絨毛逐漸消失、鉀離子通道開放，到中期細(xì)胞 皺縮、染色質(zhì)濃集、核膜完整性消失，至晚期凋亡小體的出現(xiàn)，這一系列的過程在細(xì)胞的凋 亡過程中都是普遍出現(xiàn)的。相較于其他檢測某一蛋白或受體的技術(shù)，應(yīng)用電旋轉(zhuǎn)技術(shù)測定 介電性質(zhì)的變化將更加具有普遍性。另外細(xì)胞介電性質(zhì)在整個凋亡過程中也是一個連續(xù)性 的變化，區(qū)別于眾多受體和蛋白可能只在某一特定階段表達(dá)，細(xì)胞介電性質(zhì)參數(shù)的變化是 一個單方向的增加或降低，從而降低了錯過凋亡過程中某一事件的可能性。因此細(xì)胞介電 性質(zhì)的這種普遍性和連續(xù)性可以作為判別凋亡程度的標(biāo)準(zhǔn)之一。 除此之外，對于本發(fā)明所涉及到的電旋轉(zhuǎn)技術(shù)，其本身是利用電場誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)部 產(chǎn)生一個扭矩，使細(xì)胞產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)行為。在這個過程當(dāng)中，電旋轉(zhuǎn)的檢測并不對細(xì)胞產(chǎn)生永久 性的物質(zhì)介入，因此不會對細(xì)胞生理活性、內(nèi)部蛋白表達(dá)等因素造成影響。細(xì)胞在使用電旋 轉(zhuǎn)技術(shù)檢測之后，生理狀態(tài)將會和檢測之前完全一樣。 因此電旋轉(zhuǎn)技術(shù)可以作為一種方便、迅速、有效的監(jiān)測手段，在使用藥物誘導(dǎo)凋亡 的過程中，隨時監(jiān)控凋亡的進(jìn)行程度，由于電旋轉(zhuǎn)本身的非介入性，可以決定同一批細(xì)胞繼 續(xù)誘導(dǎo)凋亡或者終止。當(dāng)終止藥物作用后，細(xì)胞可以繼續(xù)培養(yǎng)，也可加入其他凋亡誘導(dǎo)劑、 阻斷劑，或利用其他技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步檢測。因此對于其他技術(shù)來說，電旋轉(zhuǎn)本身具有很強(qiáng)的 靈活性。 本發(fā)明的一種用于檢測細(xì)胞早期凋亡的電旋轉(zhuǎn)檢測裝置，其包括底板4，底板4為 電子芯片板，檢測池5設(shè)于底板4上，為一立體的筒狀空間。檢測池5的周圍四根鉑金電極 3均勻分布，即以互為90°正交的方式貼于檢測池5的內(nèi)壁，相對的兩根電極3間的距離為 400iim。 鉑金電極3為"L"形，檢測時，當(dāng)被測物密度大于檢測介質(zhì)時，被測物沉于檢測池 5內(nèi)檢測介質(zhì)的底部，這時電極3的方向是從上往下插，其位置如圖1中所示，"L"形的長邊 位于上方。當(dāng)被測物密度小于檢測介質(zhì)時，被測物浮在電旋轉(zhuǎn)檢測池5內(nèi)檢測介質(zhì)的上方， 這時電極3的方向是從下往上插，即"L"形的長邊位于下方，短邊仍貼于池壁。
灌流裝置包括灌流進(jìn)水毛細(xì)管1、灌流出水毛細(xì)管2和外置泵。灌流進(jìn)水毛細(xì)管1 伸入檢測池5內(nèi)，通過外置泵的作用將介質(zhì)溶液引流入檢測池5中；灌流出水毛細(xì)管2伸入 檢測池5內(nèi)，位于與灌流進(jìn)水毛細(xì)管1相對的位置，灌流出水毛細(xì)管2使用另一外置泵將介 質(zhì)溶液泵出檢測池5，從而保證檢測池5內(nèi)始終為新鮮的檢測介質(zhì)溶液。
當(dāng)檢測的顆粒比重比液體介質(zhì)大時，灌流進(jìn)水毛細(xì)管1位于檢測池5上方，使灌流 進(jìn)水毛細(xì)管1流出的液體介質(zhì)從檢測池5上方輸入檢測池5 ;當(dāng)檢測的顆粒比重比液體介 質(zhì)小時，灌流進(jìn)水毛細(xì)管1位于檢測池5下方，使灌流進(jìn)水毛細(xì)管1流出的液體介質(zhì)從檢測 池5下方輸入檢測池5。 由此生物顆粒處于電旋轉(zhuǎn)檢測池5中時，并未被灌流作用效應(yīng)所擾動而產(chǎn)生位移
和轉(zhuǎn)動，從而使得生物顆粒所處環(huán)境的溫度及介質(zhì)成分始終保持一致。 導(dǎo)管內(nèi)徑可在100iim到300iim之間，優(yōu)選的為200iim。介質(zhì)泵入電旋轉(zhuǎn)池的流
速可控制在0. lmL/min到0. 5mL/min之間，優(yōu)選的為0. 25mL/min。外置泵可以采用普通恒
流泵、蠕動泵或注射泵。 信號發(fā)生器與底板4相連接，信號發(fā)生器產(chǎn)生正弦信號，并通過底板4的電子芯片 將四路相位依次相差90°的正弦信號依次施加在四個鉑金電極3上，使得在電旋轉(zhuǎn)檢測池5中形成立體的三維電場。信號發(fā)生器施加于電極3上的電信號的電壓的振幅范圍在1V至 20V之間，以6V至10V之間為佳。 本發(fā)明的一種應(yīng)用電旋轉(zhuǎn)技術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡的方法，采用上述的電旋轉(zhuǎn)檢測 裝置，其步驟包括 (1)對于待測細(xì)胞，向其所處的液體介質(zhì)內(nèi)加入凋亡誘導(dǎo)因子，使待測細(xì)胞發(fā)生凋亡。 即是在細(xì)胞正常狀態(tài)時，給予一種或多種凋亡誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài)， 凋亡誘導(dǎo)時間可根據(jù)文獻(xiàn)或?qū)嶋H實(shí)驗(yàn)結(jié)果自行設(shè)計(jì)。凋亡誘導(dǎo)因子可以為腫瘤壞死因子、 轉(zhuǎn)化生長因子、糖皮質(zhì)激素、病毒、細(xì)菌、自由基或化療藥物。被測細(xì)胞可以為單細(xì)胞生物如 微生物或原生動物，或高等生物的細(xì)胞如植物細(xì)胞或動物細(xì)胞。 (2)在細(xì)胞在被誘導(dǎo)凋亡之后，將待測細(xì)胞懸浮于該加入有凋亡誘導(dǎo)因子的液體 介質(zhì)中，移動到電旋轉(zhuǎn)檢測池中，并調(diào)節(jié)該液體介質(zhì)的電導(dǎo)率。 (3)通過灌流裝置將與電旋轉(zhuǎn)檢測池中液體介質(zhì)相同的液體介質(zhì)灌流入電旋轉(zhuǎn)池 中。 (4)在電旋轉(zhuǎn)池內(nèi)產(chǎn)生均勻的旋轉(zhuǎn)電場，并改變信號的頻率來改變旋轉(zhuǎn)電場的頻 率，測定細(xì)胞的在相應(yīng)條件下的轉(zhuǎn)速得到電旋轉(zhuǎn)譜，通過電旋轉(zhuǎn)譜的變化了解細(xì)胞凋亡的 程度。 均勻的旋轉(zhuǎn)電場的產(chǎn)生可以通過信號發(fā)生器在四個電極上施加相位差依次相差 90°的電信號，在電旋轉(zhuǎn)池中央產(chǎn)生均勻旋轉(zhuǎn)電場，細(xì)胞會在旋轉(zhuǎn)電場中旋轉(zhuǎn)，其旋轉(zhuǎn)速度 與本身介電性質(zhì)相關(guān)。信號發(fā)生器施加的電信號檢測頻率的范圍在lkHz至lGHz之間，較 佳的為10kHz至20MHz。 在測定細(xì)胞電旋轉(zhuǎn)譜時，液體介質(zhì)可以選擇為單糖如葡萄糖、果糖、半乳糖的溶 液；雙糖如蔗糖、乳糖、麥芽糖的溶液；多糖如淀粉、纖維素、果膠、甘露醇的溶液；氨基酸如 甘氨酸、精氨酸、色氨酸、亮氨酸等的溶液。 液體介質(zhì)也可以為組織水解液、水解乳白蛋白或血清等天然培養(yǎng)液。或?yàn)楹铣膳?養(yǎng)液如DMEM、RPMI1640、MEM、 Medium 199、 CMRL 1066或Ham' s F-12 ;平衡鹽溶液如磷酸鹽 緩沖液、氯化鈉和氯化鉀溶液、Hanks液、Earle氏液或Eagle氏液等。 介質(zhì)的電導(dǎo)率可以使用磷酸鹽緩沖液、氯化鈉、氯化鉀、Hanks液、Earle氏液、 Eagle氏液、DMEM、RPMI1640、MEM、Medium 199、CMRL1066或Ham， s F-12的培養(yǎng)液進(jìn)行調(diào)節(jié)， 介質(zhì)溶液的電導(dǎo)率的調(diào)節(jié)范圍可在1 y S/cm-2mS/cm之間，優(yōu)選的為200 y S/cm到800 y S/ cm之間。 以下列舉H印G2細(xì)胞在乙醇處理后用電旋轉(zhuǎn)技術(shù)檢測其早期凋亡的實(shí)施例，以說 明本發(fā)明應(yīng)用電旋轉(zhuǎn)技術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡的方法。其他細(xì)胞在其他凋亡誘導(dǎo)因子的作用 下發(fā)生凋亡時，其檢測方法與實(shí)施例中相同，僅需要根據(jù)不同細(xì)胞選取其適宜的液體介質(zhì) 和凋亡誘導(dǎo)因子，而這種選取是本領(lǐng)域技術(shù)人員所應(yīng)當(dāng)知道的。 具體的，人肝癌H印G2細(xì)胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加 入100U/ml的青霉素和100ii g/ml的鏈霉素。細(xì)胞培養(yǎng)在37°C，5% C02的孵育箱中。使用 乙醇處理細(xì)胞，使細(xì)胞發(fā)生凋亡。乙醇處理濃度為500mM。分別在處理時間0h、2h、4h、6h、 8h和10h的時間段將細(xì)胞取出并離心，去除上清液。
細(xì)胞重懸于等滲的甘露醇溶液(300m0s/kg)中，電導(dǎo)率使用PBS調(diào)節(jié)到360 y S/ cm。每次實(shí)驗(yàn)使用移液槍吸取100 L的細(xì)胞懸液至電旋轉(zhuǎn)池中，同時開啟蠕動泵進(jìn)行灌 流。 當(dāng)細(xì)胞在池底部穩(wěn)定后，在電極上施加旋轉(zhuǎn)電場。在本實(shí)施例中選擇電壓最佳為 8V，在電信號頻率10kHz-20MHz間每十進(jìn)制頻率段檢測四個點(diǎn)。細(xì)胞的電旋轉(zhuǎn)行為通過倒 置顯微鏡進(jìn)行觀測，應(yīng)用顯微鏡上的攝像頭和視頻采集卡進(jìn)行視頻記錄，細(xì)胞的旋轉(zhuǎn)速度 隨后通過軟件進(jìn)行分析，得到H印G2細(xì)胞在乙醇處理后不同凋亡時段的電旋轉(zhuǎn)圖譜。
附圖2為H印G2細(xì)胞在500mM乙醇處理后不同時段的電旋轉(zhuǎn)圖譜。每條譜線代表 20個細(xì)胞的平均值，我們可以看到不同時段的電旋轉(zhuǎn)頻譜間變化明顯。6h和10h在低頻段 的旋轉(zhuǎn)速度顯著低于正常細(xì)胞，特征頻率向高頻移動。由于電旋轉(zhuǎn)頻譜反映了被測細(xì)胞本 身的介電性質(zhì)，故從電旋轉(zhuǎn)頻譜圖中可以得出細(xì)胞本身的介電性發(fā)生了很大改變，進(jìn)而檢 測出細(xì)胞的早期凋亡。 為了與電旋轉(zhuǎn)檢測方法對照，使用活性氧實(shí)驗(yàn)、磷脂酰絲氨酸外露實(shí)驗(yàn)以及掃描 電子顯微鏡對H印G2細(xì)胞以同樣方式處理后相同時間段進(jìn)行檢測。 活性氧實(shí)驗(yàn)使用2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA， Sigma) 檢測。細(xì)胞使用500mM乙醇處理不同時間后用冷的PBS清洗兩次，隨后在終濃度為10 y M DCFH-DA的PBS中于37t:孵育15min。之后在激光掃描共聚焦顯微鏡上檢測。熒光強(qiáng)度使 用共聚焦軟件進(jìn)行測定，每組檢測100個細(xì)胞。附圖3顯示，H印G2細(xì)胞在500mM乙醇處理 后ROS水平逐漸升高，10h時ROS水平比對照組水平的增長了約100% 。細(xì)胞內(nèi)ROS水平的 上升是細(xì)胞早期凋亡的標(biāo)志性事件之一，活性氧檢測實(shí)驗(yàn)證明了細(xì)胞此時處于細(xì)胞早期凋 亡階段。 磷脂酰絲氨酸外露實(shí)驗(yàn)使用Annexin V-FITC/PI即optosisde tection kit試劑 盒檢測。細(xì)胞使用500mM乙醇處理不同時間，隨后根據(jù)廠商的建議步驟進(jìn)行染色，并于流式 細(xì)胞儀上檢測。附圖4顯示，H印G2細(xì)胞在500mM乙醇處理后，細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)膜上的磷脂酰絲 氨酸逐漸外露，與檢測凋亡試劑Annexin V-FITC結(jié)合，可檢測出細(xì)胞熒光逐漸增強(qiáng)。10h 時，F(xiàn)ITC的熒光強(qiáng)度比對照組水平增長了約50%。細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸的外露是細(xì)胞早期 凋亡的標(biāo)志性事件之一，磷脂酰絲氨酸外露的檢測實(shí)驗(yàn)證明了細(xì)胞此時處于細(xì)胞早期凋亡 階段。 在掃描電鏡實(shí)驗(yàn)中，未處理組與處理組的細(xì)胞應(yīng)用無血清的DMEM清洗，重懸于等 滲的甘露醇溶液15min。細(xì)胞接下來離心固定在3%戊二醛溶液中1. 5h，使用PBS清洗后 用1%鋨酸固定lh，脫水并凍干過夜，噴金后使用電子顯微鏡檢測獲取圖像。附圖5顯示， H印G2細(xì)胞在正常狀態(tài)時，細(xì)胞上覆蓋著很多鞭毛，細(xì)胞形狀為正常的圓形。在500mM乙醇 處理后2h，少部分細(xì)胞鞭毛開始消失；6h后將近一半的細(xì)胞鞭毛變的稀疏，并且少部分細(xì) 胞上出現(xiàn)凋亡小體；10h時，大部分細(xì)胞表面相對較光滑，相當(dāng)一部分細(xì)胞上出現(xiàn)了凋亡小 體。在掃描電鏡上的實(shí)驗(yàn)直觀的表現(xiàn)出了細(xì)胞較早期凋亡的形態(tài)改變的過程。在電旋轉(zhuǎn)實(shí) 驗(yàn)中電旋轉(zhuǎn)譜的變化也對應(yīng)著這種細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。 由上可知，應(yīng)用電旋轉(zhuǎn)技術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡的方法得出的結(jié)論能夠得到使用活 性氧實(shí)驗(yàn)、磷脂酰絲氨酸外露實(shí)驗(yàn)以及掃描電子顯微鏡的支持。 本發(fā)明通過電旋轉(zhuǎn)技術(shù)可以非介入的對細(xì)胞正常狀態(tài)或者受到外界因素影響后進(jìn)入凋亡的狀態(tài)進(jìn)行檢測。細(xì)胞由正常狀態(tài)逐漸進(jìn)入凋亡狀態(tài)的生理變化可以明顯的在電 旋轉(zhuǎn)圖譜中顯示得到。 本發(fā)明使用電旋轉(zhuǎn)技術(shù)作為一種非介入手段檢測細(xì)胞的早期凋亡，在細(xì)胞早期凋 亡可以逆轉(zhuǎn)的時期即可區(qū)別出正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞，不受不同研究對象的受體或者蛋白的 表達(dá)不同，或不同生化事件或活性的時間點(diǎn)不同的影響，保證了檢測的準(zhǔn)確度。并且本發(fā)明 的檢測方法使得被測物能夠保持活性，使得被測物可以繼續(xù)培養(yǎng)或進(jìn)行下一步研究。本方 法適用的范圍包括單細(xì)胞生物以及植物細(xì)胞和動物細(xì)胞，特別適合于哺乳動物的正常細(xì)胞 和腫瘤細(xì)胞。相對于目前研究凋亡的其他技術(shù)可做到對單一批或單個個體連續(xù)研究，并且 實(shí)驗(yàn)證明測定過程對被測物生理活性并無影響。 以上對本發(fā)明的描述是說明性的，而非限制性的，本專業(yè)技術(shù)人員理解，在權(quán)利要 求限定的精神與范圍之內(nèi)可對其進(jìn)行許多修改、變化或等效，但是它們都將落入本發(fā)明的 保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種應(yīng)用電旋轉(zhuǎn)技術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)對于待測細(xì)胞，向其所處的液體介質(zhì)內(nèi)加入凋亡誘導(dǎo)因子，使待測細(xì)胞發(fā)生凋亡；(2)將待測細(xì)胞懸浮于液體介質(zhì)中，加入到電旋轉(zhuǎn)檢測池當(dāng)中；(3)采用與所述電旋轉(zhuǎn)檢測池中液體介質(zhì)相同的液體介質(zhì)，向電旋轉(zhuǎn)池中灌流；(4)在電旋轉(zhuǎn)池內(nèi)產(chǎn)生均勻的旋轉(zhuǎn)電場，使待測細(xì)胞發(fā)生電旋轉(zhuǎn)行為；(5)改變旋轉(zhuǎn)電場的頻率，以測定細(xì)胞在相應(yīng)條件下的轉(zhuǎn)速，得到電旋轉(zhuǎn)譜圖。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用電旋轉(zhuǎn)技術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡的方法，其特征在于，步驟 (1)中的所述凋亡誘導(dǎo)因子為腫瘤壞死因子、轉(zhuǎn)化生長因子、糖皮質(zhì)激素、病毒、細(xì)菌、自由 基或化療藥物。
3. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用電旋轉(zhuǎn)技術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡的方法，其特征在于，步驟(3) 中所述的灌流速度為0. lmL/min-0. 5mL/min。
4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用電旋轉(zhuǎn)技術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡的方法，其特征在于，所述 灌流速度為0. 25mL/min。
5. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用電旋轉(zhuǎn)技術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡的方法，其特征在于，步驟(4) 中所述產(chǎn)生均勻的旋轉(zhuǎn)電場為在電旋轉(zhuǎn)測量池的四周均勻分布的四個鉑金電極上依 次施加相位依次相差90。的四路正弦電信號。
6. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用電旋轉(zhuǎn)技術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡的方法，其特征在于，所述 正弦電信號的電壓的振幅范圍為1V-20V。
7. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用電旋轉(zhuǎn)技術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡的方法，其特征在于，所述 正弦電信號的電壓的振幅范圍為6V-10V。
8. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用電旋轉(zhuǎn)技術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡的方法，其特征在于，步驟(5) 中旋轉(zhuǎn)電場的頻率范圍為lkHz-lGHz。
9. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用電旋轉(zhuǎn)技術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡的方法，其特征在于，所述 液體介質(zhì)的電導(dǎo)率為1 P S/cm-2mS/cm。
10. 如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用電旋轉(zhuǎn)技術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡的方法，其特征在于，所述 液體介質(zhì)的電導(dǎo)率為200 ii S/cm-800 y S/cm。
全文摘要
本發(fā)明的一種應(yīng)用電旋轉(zhuǎn)技術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡的方法，包括如下步驟(1)對于待測細(xì)胞，向其所處的液體介質(zhì)內(nèi)加入凋亡誘導(dǎo)因子，使待測細(xì)胞發(fā)生凋亡；(2)將待測細(xì)胞懸浮于液體介質(zhì)中，加入到電旋轉(zhuǎn)檢測池當(dāng)中；(3)采用與所述電旋轉(zhuǎn)檢測池中液體介質(zhì)相同的液體介質(zhì)，向電旋轉(zhuǎn)池中灌流；(4)在電旋轉(zhuǎn)池內(nèi)產(chǎn)生均勻的旋轉(zhuǎn)電場，使待測細(xì)胞發(fā)生電旋轉(zhuǎn)行為；(5)改變旋轉(zhuǎn)電場的頻率，以測定細(xì)胞在相應(yīng)條件下的轉(zhuǎn)速，得到電旋轉(zhuǎn)譜圖。本發(fā)明使用電旋轉(zhuǎn)技術(shù)作為一種非介入手段檢測細(xì)胞的早期凋亡，保證了檢測的準(zhǔn)確度，并且使得被測物能夠保持活性，可做到對單一批或單個個體連續(xù)研究。
文檔編號C12Q1/00GK101750435SQ200910244458
公開日2010年6月23日 申請日期2009年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日
發(fā)明者唐靜成, 張會亮, 張芳, 徐秉玖, 汪旭, 耿勝燕 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)