專利名稱：球等鞭金藻Δ⁹延長酶的核苷酸序列及其應(yīng)用的制作方法
球等鞭金藻as延長酶的核苷酸序列及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明屬于生物和遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及從一種產(chǎn)DHA的球等鞭金 藻(Isochrysis galbana)中克隆A9延長酶基因，具體講是球等鞭金藻八9延長酶的核苷 酸序列及其應(yīng)用。將該基因直接或與不同表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)入到細(xì)菌、酵母、植物或動(dòng)物中， 利用其編碼A9延長酶產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的方法和應(yīng)用。背景技術(shù)：
:多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid，PUFAs)是指含有兩 個(gè)或兩個(gè)以上順式雙鍵、碳原子數(shù)為16至22的直鏈脂肪酸。多不飽和脂肪酸是以多種形 式存在于細(xì)胞中如細(xì)胞膜、儲(chǔ)存脂、甘油三酯磷脂、鞘脂和脂蛋白等。作為生物膜結(jié)構(gòu)中磷 脂的重要成分之一，PUFAs的種類、數(shù)量、飽和度的改變會(huì)直接影響生物膜的剛性結(jié)構(gòu)，因此 影響了與剛性結(jié)構(gòu)相關(guān)的各種生理功能。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)PUFAs與包括心血管疾病，糖尿病、 關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、潰瘍性結(jié)腸炎在內(nèi)的多種慢性疾病相關(guān)，并且可以通過影響細(xì)胞的增殖和 信號(hào)傳導(dǎo)途徑來影響癌癥的發(fā)生和發(fā)展情況。最近的研究表明，PUFAs還能影響骨骼的生 長與修復(fù)過程。不僅如此PUFAs還能作為一種重要的生理活性物質(zhì)影響胎兒的發(fā)育。因此 PUFAs的生物合成以及合成途徑中的一些關(guān)鍵酶受到廣泛的關(guān)注。 PUFAs的合成主要是由碳鏈的延長和脫氫兩個(gè)主要反應(yīng)組成，合成的最初底物是 飽和脂肪酸軟脂酸和硬脂酸。為了適應(yīng)不同的自然界環(huán)境，不同的物種在基本的合成途 徑基礎(chǔ)之上又衍生出了各種不同PUFAa合成機(jī)制。除了傳統(tǒng)的n-6和n_3兩類不同的多 不飽和脂肪酸途徑外，在藻類等微生物中又發(fā)現(xiàn)了第三種分支合成途徑，即A9延長酶途 徑亞油酸(LinoleicAcid， LA， C18:2n-6， A 9， 12)或a亞麻酸(a-LinolenicAcid， ALA， C18:3n-3， ) A 9， 12， 15) A 9延長酶的催化下生成二十碳二烯酸EDA (Eicosadienoic Acid， EDA， C20:2n-6， A 11， 14)和二十碳三烯酸Etr (EicosatrienoicAcid， EtrA， C20:3n-3， All，14，17)，然后通過A8脫氫酶生成二高y亞麻酸DGLA(Dihomo-y-LinolenicAcid， DGLA，C20:3n-6， A8，11，14)和二十碳四烯酸ETA(EicosatetraenoicAcid， C20:4n-3， A8， 11， 14， 17)，再進(jìn)入n-6和n-3合成途徑，經(jīng)一系列的碳鏈延長和脫氫反應(yīng)合成花生四烯 酸(Arachidonic acid， AA. C20:4n_6， A 5， 8， 11， 14) 、 二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid， EPA. C20:5n-3， A 5， 8， 11， 14， 17)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid， DHA. C22:6n-3， A 4， 5， 8， 11， 14， 17)等有生物活性的長鏈多不飽和脂肪酸(Long-chain polyunsaturated fatty acids， LC-PUFAs)。包括a _亞麻酸在內(nèi)的多不飽和脂肪酸在保 健和醫(yī)療方面有很廣闊的應(yīng)用前景。研究不飽和脂肪酸的合成和它的生理作用成為當(dāng)前的 熱點(diǎn)之一。A 9延長酶的克隆對(duì)于PUFAs的合成和應(yīng)用研究具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的一是提供從球等鞭金藻中分離的編碼八9延長酶的核 苷酸序列或其核苷酸序列的片段、類似物或衍生物。從一種球等鞭金藻中克隆八9延長酶 基因，具體講是球等鞭金藻A9延長酶的核苷酸序列及其應(yīng)用。 本發(fā)明的目的之二是提供由該核苷酸序列所編碼的A9延長酶多肽、或其片段、類 似物或衍生物。 本發(fā)明的目的之三是提供含有該基因核苷酸序列與異源調(diào)節(jié)序列連接，進(jìn)行功能 性表達(dá)的重組表達(dá)載體。
本發(fā)明的目的之四是提供含有該基因核苷酸序列或該基因核苷酸序列與異源調(diào) 節(jié)序列連接的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞及其后代。 本發(fā)明的目的之五是提供一種用含有該基因核苷酸序列、或該基因核苷酸序列與 異源調(diào)節(jié)序列連接的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞及其后代細(xì)胞、或該核苷酸序列 所編碼的A9延長酶多肽制備多不飽和脂肪酸的方法。 本發(fā)明第一方面是，提供了 SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列或核苷酸序列的片段、 類似物和衍生物。 本發(fā)明分離的八9延長酶基因的核苷酸序列，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序 列，與選自下組的一種核苷酸序列有至少65%的同源性1)編碼SEQ ID N0:2氨基酸序列 的活性多肽的核苷酸序列；(2)與核苷酸序列(1)互補(bǔ)的核苷酸序列。準(zhǔn)確地，該核苷酸序 列是選自下組中的一種(a)具有SEQ ID NO :1序列中1-1653的序列和(b)具有SEQ ID NO :1中45-830的序列。 本發(fā)明的第二方面是，提供分離的上述核苷酸序列所編碼的多肽，該多肽包含具 有SEQ IDNO :2所示的氨基酸序列的多肽、或其片段、或其保守性變異多肽、或其衍生類似 物。更準(zhǔn)確地，該多肽是具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列的多肽或其氨基酸變異不超 過30%的衍生物。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本 發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核 宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物)細(xì)胞中產(chǎn)生。 本發(fā)明的第三方面是，提供了含有上述核苷酸序列與質(zhì)?；虿《舅鶚?gòu)建的重組表 達(dá)載體；所述的重組表達(dá)載體具體是PYES2. O-ASE或pX952A。 本發(fā)明的第四方面是，提供了一種用含有該基因核苷酸序列、或者該基因核苷酸 序列與異源調(diào)節(jié)序列連接的質(zhì)?；虿《局亟M表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞及其后代細(xì) 胞、或用該核苷酸序列所編碼的A9延長酶多肽制備不飽和脂肪酸的方法。這些宿主細(xì)胞 包括細(xì)菌、真菌、酵母、霉菌、高等植物、昆蟲或哺乳動(dòng)物等細(xì)胞。 本發(fā)明的其他方面由于本文技術(shù)的公開，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。 本發(fā)明所涉及的技術(shù)術(shù)語的含義"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是 天然環(huán)境)。例如，活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的核苷酸序列和多肽是沒有分離純化的，但同 樣的核苷酸序列或多肽如從天然狀態(tài)中與同存在的其它物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
"分離的核苷酸序列"是指基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其 它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的DNA純化技術(shù)純化的。"球等鞭金藻A9延長酶的核苷酸序列"是指包括編碼球等鞭金藻A9延長酶多肽 的核苷酸序列和包括附加編碼和/或非編碼的核苷酸序列。"簡并的變異體"在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID N0:2的蛋白質(zhì)或多肽，但與SEQ ID N0:1所示的編碼區(qū)序列有差別的核苷酸序列。 非編碼的衍生物還表示可用于抑制所述新型蛋白生物合成的反義DNA。所述的反 義DNA屬于本發(fā)明的無功能衍生物。如不具備酶促活性的衍生物。可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員 熟知生產(chǎn)無功能衍生物的其它方法有共抑制，核糖酶和內(nèi)含子的使用。
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本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的核酸片段。如本發(fā)明所用，"核酸片段" 的長度至少含10個(gè)核苷酸，優(yōu)選是至少20-30個(gè)核苷酸，特別優(yōu)選是至少50-60個(gè)核苷酸， 非常特別的優(yōu)選是至少100個(gè)核苷酸以上。核苷酸片段也可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR) 以確定和/或分離編碼的核苷酸序列。 本發(fā)明中的多肽和核苷酸序列優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明中特異核苷酸序列能用多種方法獲得。例如，用本領(lǐng)域熟知的雜交技術(shù)分 離核苷酸序列。這些技術(shù)包括但不局限于(l)用探針與基因組或cDNA文庫雜交以檢出同 源的核苷酸序列；和(2)表達(dá)文庫的抗體篩選以檢出具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆的核苷酸序 列片段。 本發(fā)明的DNA片段序列也能用下列方法獲得(1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序 列；(2)化學(xué)合成DNA序列以獲得所述多肽的雙鏈DNA。 本發(fā)明還提供了一種新的多肽序列-球等鞭金藻八9延長酶多肽的氨基酸序列， 是由SEQ IDN0:2所示的氨基酸序列組成。發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多 肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重 組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生。
本發(fā)明也涉及含有編碼球等鞭金藻A9延長酶的核苷酸序列和外源性調(diào)節(jié)序列元
件結(jié)合進(jìn)行功能性表達(dá)的重組表達(dá)載體。 術(shù)語"載體"指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng) 物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體。能夠影響基因表達(dá)產(chǎn)物的序列元件包括有 復(fù)制起始點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯調(diào)控元件。 可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法來構(gòu)建含編碼球等鞭金藻A9延長酶的核苷酸 序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控元件的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合 成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的編碼球等鞭金藻八9延長酶的核苷酸序列可有效連接到表 達(dá)載體的恰當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動(dòng)子的代表性例子有大腸桿菌的lac 或trp啟動(dòng)子；A噬菌體的啟動(dòng)子真核啟動(dòng)子包括CMV早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng) 子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核細(xì)胞 或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn) 錄終止子等。在載體中插入增強(qiáng)子序列將會(huì)使其在高等真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng) 子是DNA表達(dá)的順式作用因子，通常大約有10-300bp，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。如 腺病毒增強(qiáng)子。 本發(fā)明還涉及用含有本發(fā)明編碼球等鞭金藻A9延長酶的核苷酸序列的重組載體
或直接用編碼球等鞭金藻八9延長酶的核苷酸序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞。本發(fā)明中， 編碼球等鞭金藻A9延長酶的核苷酸序列或含有該核苷酸序列的重組載體可轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)入
宿主細(xì)胞，以構(gòu)成含有該核苷酸序列或重組載體的基因工程化宿主細(xì)胞。術(shù)語"宿主細(xì)胞" 指原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng) 物細(xì)胞。宿主細(xì)胞的代表性例子有大腸桿菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞如油菜、煙草、大 豆；昆蟲細(xì)胞如果蠅S2或Sf9 ;動(dòng)物細(xì)胞如CHO、 COS或Bowes黑素瘤細(xì)胞等。
用本發(fā)明所述的核苷酸序列或含有核苷酸序列的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本 領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期收集菌體，用Ca(^法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域是眾所周知的。也可 用MgC^，電穿孔等方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用DNA轉(zhuǎn)染法、顯微注射、電穿孔、脂 質(zhì)體包裝等方法。 本發(fā)明還涉及用上述轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞生產(chǎn)多不飽和脂肪酸，根據(jù)宿主細(xì)胞，用本 領(lǐng)域技術(shù)人員所共知的方法生長或培養(yǎng)。比如微生物細(xì)胞通常是在0-100'e，優(yōu)選10-60\ 同時(shí)還要氧氣。培養(yǎng)基中含有碳源，如葡萄糖，氮源，通常是有機(jī)氮的形式，如酵母提取物、 氨基酸，或鹽，如硫酸銨，微量元素，如鐵、鎂鹽，如果需要的話還有維生素。在此期間培養(yǎng)基 的pH可以保持固定的值，就是說，在培養(yǎng)期間進(jìn)行控制或不控制。培養(yǎng)可以分批培養(yǎng)、半不 連續(xù)培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)形式進(jìn)行。在培養(yǎng)之后，收集細(xì)胞，搗碎或直接使用，通過本領(lǐng)域技術(shù) 人員熟知的方法從細(xì)胞中提取脂肪酸。 本發(fā)明還涉及一種制備不飽和脂肪酸的方法，該方法是這樣實(shí)現(xiàn)的，將具有飽和
或不飽和脂肪酸甘油三酯與SEQ ID N0:2序列編碼的酶一起培養(yǎng)。該方法優(yōu)選是在由能夠
攝取或釋放還原性等同物的化合物存在條件下進(jìn)行的。然后，可以從甘油三酯中釋放脂肪
酸。上述方法優(yōu)選可以合成通過9位延長、合成具有11位雙鍵的脂肪酸。 本發(fā)明還涉及用上述方法制備不飽和脂肪酸，以及將其應(yīng)用于生產(chǎn)人類食品、動(dòng)
物飼料、化妝品或藥品用途。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果 本發(fā)明獲得了球等鞭金藻Ag延長酶基因，通過與其它合成PFUAs相關(guān)基因組合 并將其克隆表達(dá)特定的表達(dá)宿主中，通過基因重組和表達(dá)技術(shù)的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)PUFAs 和/或提高食品PUFAs的含量。


圖1是顯示所構(gòu)建的釀酒酵母重組表達(dá)載體pYASE圖。
圖2A是顯示LA、 ALA、 EDA、 EtrA標(biāo)準(zhǔn)物的GC圖。
圖2B是含pYES2空載體的轉(zhuǎn)基因釀酒酵母的GC圖。
圖2C是含重組質(zhì)粒pYASE的轉(zhuǎn)基因釀酒酵母的GC圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體的實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不是限制本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例l從球等鞭金藻中分離八9延長酶的核苷酸序列 采用Trizol方法從培養(yǎng)3d的球等鞭金藻中提取總的RNA，以2 y L總RNA為模板， 以oligo(dT16)作為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，擴(kuò)增獲得cDNA。取2iiL cDNA為模板進(jìn)行聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。根據(jù)所發(fā)表(Baoxiu Qia. et al. 2002， FEBS Letters)的八9延長酶同源序 列的跨膜區(qū)和組氨酸保守區(qū)II氨基酸序列設(shè)計(jì)兼并引物(引物1和引物2)，以上述cDNA 為模板在T-Gradient PCR儀(Biometra公司)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)所用引物、組分和擴(kuò) 增條件如下 引物1 :5-ATG TA (TC) AC (TCAG) TA (TC) TA (TC) GG (TCAG) (CT) T—3
引物2 :5- (ATCG) AG (ATCG) CC (GA) TA (GA) TA (ATCG) GT (GA) TA CAT—3
反應(yīng)組分加入量終濃度模板cDNA緩沖液(10 X)(含20mmol/LMgCl2)5 LIXdNTP(2. 5,1/L)0. 4mmol/l引物l(10iimol/L)0. 4u mol/L引物2(10iimol/L)0. 4 mol/LT叫ase (5u/ li U1 ii L5u/反應(yīng)H。0總體積擴(kuò)增條件94t:變性5min，再用94°Clmin ;55°C lmin — 72 °Clmin進(jìn)行3個(gè)循
環(huán)，然后94°C lmin ;52°C lmin -+ 72°C lmin進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72。C10min。瓊脂糖凝
膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，擴(kuò)增得到大小約180bp的片段，用DNA凝膠回收試劑盒(鼎國生物技 術(shù)有限公司產(chǎn)品)回收，把回收片段亞克隆到測(cè)序載體pGEM-T easy(Promega公司產(chǎn)品) 中；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到用CaCl2法處理的大腸桿菌DH5a ，在含氨芐青霉素(終濃度為100iig/ ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜；挑取平板上生長的白色菌落，接入含氨芐青霉素(終濃 度為60iig/ml)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，離心收集菌體按堿裂解法[Sambroook， et al. ，1989， Molecular Cloning, a Laboratory Ma皿al， coldSpring Harbor Laboratory, NewYork， pl9_21]提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoR I酶切和PCR擴(kuò)增鑒定正確，測(cè)序(上海生工生物工 程技術(shù)服務(wù)有限公司)。測(cè)序結(jié)果顯示所擴(kuò)增得到的片段大小為174bp，通過其核苷酸序列 和其編碼的氨基酸序列在Genbank數(shù)據(jù)庫中用Blast程序進(jìn)行同源檢索，檢索結(jié)果表明與 該片段已報(bào)道的八9延長酶序列十分相似，但并不完全相同，證明所擴(kuò)增片段為潛在八9延 長酶基因的片段。 根據(jù)所獲得的部分序列設(shè)計(jì)基因特異性引物(引物3、引物4和引物5)，利用 RACE(Clontech公司)的方法獲得包含上述片段的基因的3—和5—末端序列。先提取細(xì)胞 總RNA，，以2 ii L總作為模板，按照Clontech SMART RACE cDNAAmplif ication Kit提供 的方法反轉(zhuǎn)錄得到5' RACE cDNA和3' RACE cDNA，然后以3' RACE cDNA作為模板，以試劑 盒提供的UPM引物分別與引物3、4和5配對(duì)，擴(kuò)增獲得3'下游序列；以5' RACE cDNA作為 模板，以試劑盒提供的UPM引物分別與引物6、7和8配對(duì)，擴(kuò)增獲得5'上游序列。
引物3 :5—-GACACGGCCTGGCTGGTGCTCAAGGG-3— ， (SEQ ID NO :3)
引物4 :5—-GAAGAACGTCTCTTTCCTCCAGGC-3— (SEQ ID NO :4)
引物5 :5—-ATGTGTATTTGGGCATCCGGCTC-3— ， (SEQ ID NO :5) 模板3'RACE cDNA 3 ii L、緩沖液(10X) 5 ii L、 dNTP(50X) 1 y L、弓|物 UPM(10ii mol/L) 5 ii L、引物3/4/5 (10 ii mol/L) 5 ii L、Taq酶2 ii L、H20 29iiL。擴(kuò)增條件 先94。C變性5min，進(jìn)入94。C 30sec， 72°C 3min進(jìn)行5個(gè)循環(huán)；再94°C 30see， 70°C 30sec， 72°C 3min進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后94°C 30sec， 68°C 30sec， 72°C 3min進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，最后 72°C 10min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋50倍后作為模板，以引物UPM和引物4進(jìn)行PCR，94°C 30sec，68。C 30sec，72。C 3min進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，最后72°C 10min，再將產(chǎn)物稀釋IOO倍，以引 物UPM和引物5進(jìn)行PCR驗(yàn)證，若獲得特異性條帶，將該帶連接pGEM-T easy并轉(zhuǎn)化測(cè)序，獲得3'下游序列1220bp。 引物6 :5—-GAGGCCGTAGTAGGTGTACATTATGGTG-3—， (SEQ ID NO :6)
引物7 :5—-TATGGTGTGAATGAATGAGTTGAAAA-3— (SEQ ID NO :7)
引物8 :5—-ACATGAAGATCCACACGCCCTC-3— (SEQ ID NO :8) 模板5'RACE cDNA 3 ii L、緩沖液(10X) 5 ii L、 dNTP(50X) 1 y L、弓|物 UPM(10iimol/L) 5iiL、引物6/7/8(10iimol/L) 5 ii L、Taq酶2 ii L、H20 29iiL。擴(kuò)增條件 先94。C變性5min，進(jìn)入94。C 30sec，72。C 3min進(jìn)行5個(gè)循環(huán)；再94。C 30sec， 70°C 30sec， 72°C 3min進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后94°C 30sec， 68°C 30sec， 72°C 3min進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，最后 72°C 10min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋50倍后作為模板，以引物UPM和引物7進(jìn)行PCR，94°C 30sec，68。C 30sec，72。C 3min進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，最后72°C 10min，再將產(chǎn)物稀釋100倍，以引 物UPM和引物8進(jìn)行PCR驗(yàn)證，若獲得特異性條帶，將該帶連接pGEM-T easy并轉(zhuǎn)化測(cè)序， 獲得5'上游序列561bp。 用序列分析軟件DNAstar將三個(gè)片段進(jìn)行拼接并進(jìn)行分析，得到如SEQ ID NO :1 所示的核苷酸序列，其中45-830bo (ATG一一TAG)為潛在的開放閱讀框，編碼262個(gè)氨基酸。 根據(jù)兩個(gè)末端序列，設(shè)計(jì)基因特異性引物(引物9和引物10)按上述條件PCR擴(kuò)增、測(cè)序，
所得結(jié)果和拼接結(jié)果一致。 引物9 :5—-ATGGCGACGGAGGCGACCGCATC-3— (SEQ ID NO :9);
引物10 :5—-TGATGGAAGCCAATGAACAAGATTTC-3— (SEQ ID NO :10);
實(shí)施例2 :所分離核苷酸序列的同源性搜索 將分離的A 9延長酶的核苷酸序列在Genbank上進(jìn)行同源性搜索，與已經(jīng)報(bào)道的 A9延長酶(BaoxiuQia. et al. 2002， FEBS Letters)的核苷酸序列(AF390174)相似性最 高，達(dá)氨基酸相似性最高，達(dá)92%。這說明本發(fā)明的新的核苷酸序列所編碼的酶具有八9延 長酶的功能。 實(shí)施例3 :釀酒酵母重組表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)SEQ ID N0:1所示編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)出一對(duì)基因特異性擴(kuò)增引物(引物ll和 引物12)分離其潛在開放閱讀框序列 引物11 :5-TTGGATCCAACACAATGGCGACGGAGGCGACCGC-3— (SEQ ID NO :11);
引物12 :5—-AAGCATGCTTACTACAGGGCCTTGCCTCCCT-3— (SEQ ID NO :12);
此兩個(gè)引物的5—端黑體分別含有BamH I和Sph I酶切位點(diǎn)。所用的擴(kuò)增條件和 反應(yīng)組分同上，擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果顯示和SEQ ID N0:l所示40-830bp的序列一致。然 后取50 L PCR產(chǎn)物和1 LpYES2. 0分別進(jìn)行雙酶切，回收酶切大片段，并用T4連接酶在 16t:水浴鍋中過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a ，通過質(zhì)粒提取和PCR篩選陽性克 隆，并進(jìn)行測(cè)序鑒定。質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果見附圖2，所構(gòu)建的含有A9延長酶基因的酵母表達(dá)質(zhì) 粒命名為pYASE。該質(zhì)粒是由pYES2. O(Invitrogen公司)和引物11和引物12的PCR產(chǎn)物 構(gòu)建而成。 實(shí)施例4 :重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母細(xì)胞 挑取釀酒酵母菌株INVScl單菌落于10ml YEPD液體培養(yǎng)基中、3(TC搖床過 夜培養(yǎng)，檢測(cè)菌液的0D6。。值，取適量菌液稀釋于50ml，使0D6。。為0. 4 ;繼續(xù)培養(yǎng)2到 4h后，2500rpm離心沉淀細(xì)胞，以40ml 1 XTE重懸菌體，2500rpm離心沉淀細(xì)胞，以2mllXLiAc/0. 5XTE懸浮細(xì)胞，并在室溫下放置10min，此細(xì)胞即為感受態(tài)細(xì)胞；取100 制備好的酵母感受態(tài)細(xì)胞，加入1 P g重組質(zhì)粒pYASE和100 ii g變性鮭精DNA，混勻，加入 700 ii 1 lXLiAc/40% PEG-4000/1 XTE并混勻，于30。C溫育30min ;然后，加入88ii 1 DMSO 混勻，于42t:水浴中熱激7min ;離心10s沉淀細(xì)胞，加入lml 1 X TE懸浮細(xì)胞并再次離心沉 淀細(xì)胞，最后加入100 重懸細(xì)胞，全鋪于SC-Ura (無尿嘧啶)選擇培養(yǎng)基平板，置3(TC培 養(yǎng)48-72h，篩選出重組轉(zhuǎn)化子。
實(shí)施例5 :酵母工程菌的誘導(dǎo)表達(dá) 挑取實(shí)施例4中SC-Ura(無尿嘧啶)選擇培養(yǎng)基平板上出現(xiàn)的陽性轉(zhuǎn)化，接種于 10ml SC-Ura選擇培養(yǎng)基(含2% (w/v)的葡萄糖)，28。C搖菌過夜培養(yǎng)，以適宜的接種量加 入含有2% (w/v)半乳糖的50ml SC-Ura培養(yǎng)基，使其0D600約0. 4，并加入亞油酸和a亞 麻酸作為底物，并加入NP-40促進(jìn)底物的吸收，20°C繼續(xù)培養(yǎng)72h ;2500rpm收集菌體，用去 離子水洗滌三次，50。C烘干，研碎，取100mg加入5ml 5% (w/v)的KOH_CH3OH溶液，70。C反 應(yīng)2-3h ;反應(yīng)結(jié)束，冷卻到室溫，用6mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值到2. O，加入4ml 14% (v/v)BF3-CH30H，7(TC反應(yīng)1. 5h，合成脂肪酸甲酯；再加入飽和的NaCl溶液10ml，劇烈震蕩 混勻，并轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，用8ml 1 : 4的氯仿己烷抽提兩次，合并提取液；加入適量 無水Na2S04干燥提取液，靜置lh，去掉Na2S04，把含有脂肪酸甲酯的上清液用氮?dú)獯蹈?，?200 ii L的正己烷回溶樣品，后用0. 45mm的微孔濾膜過濾。
實(shí)施例6 :脂肪酸氣相色譜分析
按如下條件進(jìn)行 儀器為島津GC-7A，柱子彈性石英毛細(xì)管柱，0.32X30m，固相支持物聚二乙二 醇丁二酸酯(Poly-diethylene glycol succinate, DEGS)鍍膜物聚酰亞胺。載氣^，線 速8cm/s。分流比IOO : l，氣化室溫度280。C，柱溫180。C，尾吹50ml/min，檢測(cè)器氫 火焰離子化檢測(cè)器。以CAYMAN CHEMICAL公司生產(chǎn)的PUFAs甲酯化后為標(biāo)準(zhǔn)品，把上述實(shí)施 例5的方法制備的脂肪酸甲酯化的樣品，進(jìn)行GC分析，上樣量為1 y L ;分析軟件Anstar， 分析之星色譜工作站。色譜分析結(jié)果見附圖2，附圖2顯示LA、 ALA、 EDA、 EtrA標(biāo)準(zhǔn)物(2A)、含pYES2. 0
空載體的轉(zhuǎn)基因酵母(2B)和含重組質(zhì)粒pYASE的轉(zhuǎn)基因酵母(2C)的氣相色譜圖。通過
與已知的脂肪酸甲基酯標(biāo)準(zhǔn)物的保留時(shí)間進(jìn)行比較鑒別出各個(gè)峰。圖2C中保留時(shí)間為
21. 344min、23. 534min對(duì)應(yīng)的峰即為A9延長酶催化產(chǎn)生的EDA和EtrA。 序列表 SEQUENCE LISTING 〈110>南開大學(xué) 〈120〉球等鞭金藻A 9延長酶的核苷酸序列及其應(yīng)用
〈130>20091201
〈160>12 〈170>PatentIn version 3. 5
〈210>1
〈211>1653
〈212>DNA
9
〈213〉球等鞭金藻(Isochrysis galbana)
〈400〉 1ggggg腿g3ggg卿g卿ggg郷gacgcgccgctcgcgacgatggcg 3Cgg郷Cg360ccgcatctatctgggccgcagtgagcgatccagagatcctgatcggcaca ttctcatett120tgctgctcaagcctettctccgcagctcggggctcgtcgatgag皿g皿g ggcgccteca180ggacatcgatgatctggtecaacgteattctegcgctcttctccgcaacg agcttttecg240tcacggcgacggctcttggatgggactetggragtggcgagtggctgcgt郷ct雄gg300gcgacacgccgcagccactgtttcagtgcccgtccagagtatgggattct aaactcttcg360tgtggaccgc皿3ggcattctettettccaagtecgtggaateccttgac accgcatggc420tggtgctteagggg皿g雄gtctctttcctccaggcattccatcacttc ggcgcgccgt■gggatgtgtetttgggcatccggctccagaacg郷gcgtgtggatcttc atgtttttca540actcattcattcacaccateatgtecacctattecggcctcactgctgcg ggcteteaga600tc朋ggcteagccgctcatc3C3gCg3tgC皿3teagcc3attcatgggc ggcttcatcc660tcgtctgggactecatcaatattccatgcttccgctctgateacggc皿g gtgtttegct720gggtettc朋ctetgcttetgtcggcttcgtgttcttgttgttctgccac ttcttcteca7803gg3C朋CCttgcctcteag皿gCC3gCg3ggccctgteg agagateggt840gcaacttctegctctgcgaaacacctctga3gC3tgggC3teggacgaat acttggcctc■tg卿卿tgcggcattecctcctecatggacgcgccacgC3CCg3gg3g agtcgcgctg960cccctgcaacgccgcctegcggctgaccggggccgggatggtgtatccgt tgttgacgat1020gggccccgcttcatgtagcatattgatcgattcgtattgccatctgtttt gagcategca1080tecgccgcatcgctgaatecgttgtgcggcttegcttgcatgtcatcggc ctgccgcatt1140ctctgcaggccgtcgcteccccgcgagcgcgttgaccttgag皿tgggte cggcggcctt1200gagccatgcgccgccctgttgctggc皿ggctetttggacg3g3ttCg3C 3C3C3CC3Cg1260cagtgccacacgctttggcttteagaggacgcga朋ga皿tcttgttcat tggcttccat1320caacgatggggtcatgcgggatgctggagcratgcgggatgcaccgcc皿3Cg朋tg3Cg1380cggctetgtgagtttcategtgc皿ggccacgaacgttcgragtgcttgg g郷3tgCg314403gCg朋CC3Cttgtgcactcccgacggcatgagtecgatctgcaatcaat caatecggct15003tgg3CC3tgtcaacggactcagatetetggatcttgtggtgttggtgga tggatggtcg1560tggactecggcggcggtetgttggtcggggtgtcgacttt皿g朋agc皿tgcarattcc16201653〈210〉2〈211〉261〈212〉PRT〈213〉球等鞭金藻(Isochrysis galbana)〈400〉2Met Ala Thr Glu Ala Thr Ala Serlie Trp Ala Ala Val Ser Asp Pro151015Glu lie Leu lie Gly Thr Phe Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Pro lie Leu202￡> 30Gly Leu ValAsp Glu Lys Lys GlyAlaTyrArgThrSer354045MetlieTrpTyr Asn Vallie LeuAla Leu PheSerAlaThrSerPhe505560TyrValThrAla Thr AlaLeu GlyTrp Asp TyrGlySerGlyGluTrp65707580LeuArgArgLeu Thr GlyAsp ThrPro Gin ProLeuPheGinCysPro859095SerArgValTrp Asp SerLys LeuPhe Val TrpThrAlaLysAlaPhe100105110TyrTyrSerLys Tyr ValGlu TyrLeu Asp ThrAlaTrpLeuValLeu115120125
LysGlyLysAsn Val SerPhe LeuGin Ala PheHisHisPheGlyAla130135140ProTrpAspVal Tyr LeuGly lieArg Leu GinAsnGluGlyValTrp145150155160liePheMetPhe Phe AsnSer Phelie His ThrlieMetTyrThrTyr165170175TyrGlyLeuThr Ala AlaGly TyrLys lie LysAlaLysProLeulie180185190ThrAlaMetGin lie SerGin PheMet Gly GlyPhelieLeuValTrp195200205
AspTyrlieAsn lie ProCys PheArg Ser AspAsnGlyLysValPhe210215220SerTrpValPhe Asn TyrAla Tyr Val Gly PheValPheLeuLeuPhe225230235240CysHisPhePhe Tyr LysAsp Asn Leu Ala SerLysLys Pro Ala Lys
245250255GlyGlyLysAla Leu260〈210>3〈211>26〈212>DNA〈213〉球等鞭金藻(Isochrysis galbana)〈400>3gacacggcct ggctggtgct caaggg26〈210>4〈211>24〈212>DNA
〈213>球等鞭金藻(Isochrysis galbana) 〈400>4 gaagaacgtc tctttcctcc aggc 〈210>5 <211>23 〈212〉DNA 〈213>球等鞭金藻(Isochrysis galb,) 〈400>5 atgtgtattt gggcatccgg etc <210>6 〈211〉28 〈212>DNA 〈213>球等鞭金藻(Isochrysis galbana) 〈400>6 gaggcegtag taggtgtaca ttatggtg 〈210>7 〈211>26 〈212>DNA 〈213>球等鞭金藻(Isochrysis galbana) 〈400>7 t;atggtgtga atg朋tgagt tgaaaa 〈210〉8 〈211>22 〈212>DNA 〈213>球等鞭金藻(Isochrysis galb,) 〈400>8 acatgaagat ccacacgccc tc 〈210>9 〈211>23 〈212>DNA 〈213>球等鞭金藻(Isochrysis galbana) <400>9 atggcgacgg aggcgaccgc ate 〈210>10 〈211>26 〈212>DNA 〈213〉球等鞭金藻(Isochrysis galbana) 〈400〉 10 tgatggaagc caatgaacaa gatttc
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2611/11頁
〈210>11 〈211>34 〈212>DNA
〈213〉球等鞭金藻(Isochrysis galbana) 〈400>11
ttggatccaa cacaatggcg acggaggcga ccgc 34
<210>12
〈211>31
〈212>DNA
〈213〉球等鞭金藻(Isochrysis galbana) 〈400>12
aagcatgctt actacagggc cttgcctccc t 31
1權(quán)利要求
一種產(chǎn)DHA的球等鞭金藻的Δ9延長酶的核苷酸序列，其特征在于它包括(a)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或(b)與(a)所述的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
2. 按照權(quán)利要求l所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列是選自(a) 編碼為SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列多肽的核苷酸序列；(b) 與核苷酸序列(a)互補(bǔ)的核苷酸序列；(c) 核苷酸序列(a)的核苷酸突變序列。
3. —種多肽，其特征在于它是SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列的多肽。
4. 一種重組表達(dá)載體，其特征在于它是由權(quán)利要求1所述的核苷酸序列與質(zhì)?；虿《舅鶚?gòu)建的重組表達(dá)載體。
5. 按照權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于它是pYES2. O-ASE或pX952A。
6. —種基因工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于它是選自于下列一種宿主細(xì)胞(a) 它是用權(quán)利要求1所述的核苷酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞及其后代細(xì)胞(b) 它是用權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞及其后代細(xì)胞。
7. 按照權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述的宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞，或這些宿主細(xì)胞的后代。
8. 權(quán)利要求1所述的核苷酸序列、權(quán)利要求3所述的氨基酸序列或權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體應(yīng)用于多不飽和脂肪酸的生產(chǎn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從產(chǎn)DHA的球等鞭金藻中分離的編碼Δ9延長酶的核苷酸序列及其應(yīng)用。它是具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列或編碼具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的核苷酸序列及其多肽。本發(fā)明包括編碼Δ9延長酶的核苷酸序列與表達(dá)載體連接而成的進(jìn)行功能性表達(dá)的重組表達(dá)載體以及含有本發(fā)明重組表達(dá)載體的酵母細(xì)胞、霉菌細(xì)胞及其后代細(xì)胞。用上述的核苷酸序列直接或與不同表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)入到細(xì)菌、酵母、植物或動(dòng)物中，利用其編碼Δ9延長酶或直接利用多肽序列產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的方法和應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12P7/64GK101724637SQ20091024503
公開日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2009年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月23日
發(fā)明者李明春, 歐秀元, 邢來君, 魏東盛, 黎明 申請(qǐng)人:南開大學(xué)