專利名稱：含內(nèi)參的hcmv熒光定量pcr檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含內(nèi)參的HCMV熒光定量PCR檢測試劑盒，對內(nèi)參DNA和HCMV DNA 同時進行檢測，能有效防止在對人巨細(xì)胞病毒進行實時熒光PCR檢測的過程中出現(xiàn)假陰 性，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)也稱人皰疹病毒5型 (Humanherpesvirus 5)，屬a皰疹病毒亞科，HCMV是人類先人性病毒感染的最常見病原之 一，可致感染患兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累、多器官損害、智力降低、耳聾等；在正常健康人中可引 起單核細(xì)胞增多癥；在免疫缺陷者一如器官移植受者一、獲得性免疫缺陷綜合征患者一及 癌癥患者一中可引起嚴(yán)重的感染，甚至致死。它和弓形體、風(fēng)疹病毒、單純皰疹病毒、梅毒螺 旋體合稱為人類五大生物致畸因子。鑒于HCMV在臨床疾病中的重要作用，已經(jīng)引起醫(yī)學(xué)界 的廣泛重視。在皰疹病毒科中，HCMV基因組最大，約2；35 240kb，分子為150 160X103KDa。 HCMV基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯受其自身及宿主細(xì)胞的調(diào)控，并具有時相性，分為IE(即刻早期)， E (早期)和L (晚期)。HCMV病原學(xué)檢測(一 )血清學(xué)診斷方法HCMV感染的血清學(xué)診斷方法通常有補體結(jié)合試驗(CF)，酶免疫試驗(EIA)等，CF 法敏感性低，而EIA則在高效價血清標(biāo)本檢測時分辯率低下。1.CF 法用于CF法的抗原大多數(shù)從感染CMV實驗株如AD169的成纖維細(xì)胞中提取，抗原提 取方法往往會影響檢測效果，幾年前的重要改進是用甘氨酸提取CMV的CF抗原，增加了實 驗的敏感性.盡管如此，CF法敏感性很低，因而目前不再應(yīng)用。2. EIA 法(1) EIA 法檢測 CMV 抗體 有好幾種CMV抗體檢測ELISA試劑盒供應(yīng)，一般幾小時可出結(jié)果，許多比較性研究 證實ELISA抗體效價高，操作容易，無需慮及血清的抗補體作用，但在ELISA檢測中，某些血 清與正常細(xì)胞抗原有非特異性反應(yīng)而產(chǎn)生假陽性，若提高起始稀釋度以排除假陽性又會降 低實驗的敏感性，故需做重復(fù)試驗并設(shè)定正常細(xì)胞抗原對照.CMV特異性的IgM-ELISA試劑 盒已有供應(yīng)，但如同所有的IgM檢測一樣，可能受類風(fēng)濕因子等干擾，因而血清標(biāo)本需預(yù)處 理.CMV的血清檢測也包括中和病毒感染的抗體測定，血清的中和抗效價常不變，很少超過 1 2000，試驗需要活性良好的補體，有一定技術(shù)難度。(2) EIA 法檢測 CMV 抗原用單克隆抗體進行EIA，檢測CMV抗原是近幾年研究的重點，現(xiàn)已可測定CMV的中 和抗原(至少3種蛋白質(zhì))，及各種結(jié)構(gòu)蛋白，調(diào)節(jié)蛋白.單克隆抗體能在感染后的幾個小時內(nèi)檢測到成纖維細(xì)胞核內(nèi)的CMV抗株，離心可幫助CMV吸附于單層細(xì)胞，效果可提高 4倍，尿與氣管肺泡洗液的培養(yǎng)結(jié)果尤佳.但由于血液白細(xì)胞層常有細(xì)胞毒性，經(jīng)離心會使 單層細(xì)胞受損，反而降低了檢測陽性率。3.乳膠凝集法乳膠凝集法測定CMV抗體是篩選血、器官供體的重要方法，幾分鐘內(nèi)可出結(jié)果，誤 差5% (包括假陰性)，判定結(jié)果的主觀性是誤差的明顯因素。4.免疫吸印法將高分辨率的凝膠電泳和高靈敏度的免疫固相檢出法相結(jié)合，凝膠電泳使混合在 一起的病毒成分和細(xì)胞成份分開，再通過敏感的生物分子親和技術(shù)檢測，克服了 CF試驗敏 感性差，EIA分辨率低的缺陷.同時，整個反應(yīng)只需1 左右即可作出明確的診斷，快速且簡 便.HCMV主要結(jié)構(gòu)蛋白150和38KDa出現(xiàn)于大部分病人血清中，并與HCMV_IgG、HCMV-IgM 均起反應(yīng)，極具代表性，可作為感染HCMV感染的指標(biāo)。(二)核酸雜交目前HCMV感染的診斷技術(shù)已從生物學(xué)病毒分離防和免疫學(xué)檢測抗原抗體，進入 到對基因組進行診斷的分子生物學(xué)水平階段，通過標(biāo)記的核酸探針用分子雜交方法檢測標(biāo) 本微量的病毒DNA，具有特異性強，靈敏度高的優(yōu)點，同時此法，不僅能診斷HCMV的活動性 感染，而且還能確證潛伏感染.用高比活性放射性同位素檢測HCMV，DNA克隆片段及放射自 顯影檢測方法.靈敏度可達0. 5pg，特異性可達100%.如用光敏生物素標(biāo)記探針檢測HCMV DNA，靈敏度達10 50pg，由隨機引物延伸法和缺口平移法標(biāo)記的生物素探針靈敏度分別 為 10 50pg 禾口 IOpg0(三)病毒的分離(細(xì)胞培養(yǎng)):基本原理細(xì)胞培養(yǎng)是以組織活細(xì)胞為母體，使活病毒得到擴增，引起宿主細(xì)胞病 變(CPE).通過CPE出現(xiàn)的時間，特征等進行病毒檢測。從臨床標(biāo)本中分離CMV是一種確切 的診斷，但HCMV感染宿主范圍窄，只在人成纖維母細(xì)胞中增殖，增殖非常緩慢，初次分離需 1個月才出現(xiàn)細(xì)胞毒，細(xì)胞腫大形成巨細(xì)胞性細(xì)胞，腫大的細(xì)胞核內(nèi)和胞漿內(nèi)可查見嗜酸性 包涵體，在不利條件下CMV的感染性迅速減弱，且一些生長迅速的皰疹病毒或真菌會使單 層細(xì)胞受損而影響CMV的分離。(四)DNA/RNA 擴增已有較多文獻報道通過DNA擴增的方法檢測HCMV DNA或RNA，但有報道通過一對 PCR引物可引起假陰性，主要原因可能是臨床標(biāo)本中HCMV毒株的不同或病毒基因組中極微 小變異(及病毒拷貝數(shù)太低)所致。此外，即使引物設(shè)計所選的序列針對HCMV同一基因的 不同部位，其PCR擴增結(jié)果也有明顯差異.。因此，巢式PCR常被用于HCMV的檢測。但與 此同時，操作步驟和檢測時間均較長，而且實驗容易造成污染，很難在臨床上進行廣泛的推

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種含內(nèi)參的HCMV熒光定量PCR檢測試劑盒，用于檢測標(biāo)本 中HCMVDNA的含量，同時通過內(nèi)參體系的設(shè)置，對檢測過程中的假陰性進行有效防控。為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
1、使用一對特異性引物和一條特異性探針，與人巨細(xì)胞病毒(HCMV)基因組的 UL122基因保守序列完全匹配，擴增一段長度為96bp的靶序列。引物探針序列如下引物 1 :5~-GACTTCTTCACCCTGTTCTTCC-3~ (Seq No. 1)引物 2 :5:GAGCCCGACTTTACCATCCA-3、(Seq No. 2)探針1 :5~-CTATCAGAGATCACGATACAGCCGG_3~ (Seq No. 3)2、設(shè)計一條內(nèi)參探針，該探針與HCMV基因組DNA無同源性，并且能與引物1和引 物2組合成擴增效率高、非特異性擴增低的熒光PCR檢測體系，即內(nèi)參檢測體系。內(nèi)參探針 序列如下探針2 :5:CACTCAACCTACACGTCAACGCTA-3~ (Seq No. 4)3、根據(jù)靶序列以及引物1、引物2和內(nèi)參探針的序列，將靶序列中探針1的結(jié)合部 位更換成內(nèi)參探針的相同或互補序列，人工合成DNA片段，作為內(nèi)參陽模。內(nèi)參陽模及擴增 靶序列片段的核苷酸序列如下內(nèi)參陽模5:GACTTCTTCA CCCTGTTCTT CCTCGCACTC AACCTACACG TCAACGCTAC GGTATCGATAATCTTGTTGC GGTACTGGAT GGTAAAGTCG GGCTC-3"(Seq No. 5)靶基因序列5~-GACTTCTTCACCCTGTTCTT CCTCGCTATC AGAGATCACG ATACAGCCGG CGGTATCGATAATCTTGTTG CGGTACTGGA TGGTAAAGTC GGGCTC-3" (Seq No. 6)4、根據(jù)不同的熒光定量PCR儀器，從以下熒光基團中選擇兩個分布于不同的儀器 檢測通道的兩種熒光進行組合，熒光種類為FAM、ΤΕΤ、JOE、Cy3、Cy5、Cy5. 5、Fluorescein、 Rhodamine、Rhodamine RecURhodamine Green、Rhodamine 6G、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange 和ROX ；熒光淬滅基團根據(jù)選擇的熒光發(fā)光基團的種類和組合從DABCYL、DABSYL、TAMRA、 BHQ-U BHQ-2或BHQ-3中的選擇一種或兩種淬滅基團。優(yōu)選的方案為兩條探針分別用 FAM-BHQl 和 TET-BHQl 進行標(biāo)記。5、上述試劑盒，其特征在于采用多重?zé)晒釶CR檢測技術(shù)，內(nèi)參陽模DNA片段預(yù)先加 入到含探針1和探針2的組成成分“探針”中，試劑盒的組成成分包括PCR反應(yīng)緩沖液、探 針、Taq酶、核酸提取液、校準(zhǔn)品1、校準(zhǔn)品2、校準(zhǔn)品3、陽性對照品和陰性對照品。6、上述試劑盒，其特征在于PCR反應(yīng)體系包含Tris-HCl (PH 8. 3)、KCl、d(AGC)TP、 dUTP、MgC12、引物1和引物2、探針1和探針2、Taq酶、UNG酶以及適當(dāng)濃度的內(nèi)參陽模，試 劑盒校準(zhǔn)品為已知核酸DNA濃度并包含引物1和引物2擴增片段的人工合成DNA片段，陽 性對照品為適當(dāng)濃度的AD169標(biāo)準(zhǔn)病毒株，陰性對照品為超純水。7、上述的檢測方法和試劑盒，可以按如下程序進行實時熒光PCR檢測反應(yīng)管先 在50°C反應(yīng)2分鐘，然后95°C保溫5分鐘，再按94°C 20秒一60°C 45秒循環(huán)40次(60°C退 火條件下采集相應(yīng)探針標(biāo)記通道的熒光)。本發(fā)明與現(xiàn)有HCMV核酸PCR檢測方法相比，具有以下有益的技術(shù)效果(1)檢測 HCMV 基因組即刻早期基因(immediate-early transcriptional regulator ；IE2)中的U122基因，預(yù)測性較強。(2)在檢測HCMV靶基因U122的同一管PCR反應(yīng)液中，同時對內(nèi)參陽模進行擴增與檢測，能有效監(jiān)控PCR反應(yīng)體系的有效性，較好的降低假陰性率。


圖1為2倍梯度稀釋的人巨細(xì)胞病毒臨床分離標(biāo)本使用本發(fā)明試劑盒在ABI公司 ABI7500熒光擴增儀上檢測的FAM通道(檢測HCMV靶基因的反應(yīng)體系)的擴增曲線；圖2為2倍梯度稀釋的人巨細(xì)胞病毒臨床分離標(biāo)本使用本發(fā)明試劑盒在ABI公司 ABI7500熒光擴增儀上檢測的JOE通道(內(nèi)參檢測反應(yīng)體系)的擴增曲線；
具體實施例方式設(shè)計和制備引物、探針序列(針對HCMV標(biāo)準(zhǔn)株-Human herpesvirus 5 strain AD169基因〈GeneBank序列號為BK000394〉序列設(shè)計)引物 1 :5~-GACTTCTTCACCCTGTTCTTCC-3~(Seq No. 1)引物 2 :5:GAGCCCGACTTTACCATCCA-3、(Seq No. 2)探針1 :5~-CTATCAGAGATCACGATACAGCCGG_3~ (Seq No. 3)探針2 :5:CACTCAACCTACACGTCAACGCTA-3~(Seq No. 4)上述引物和探針均在寶生物工程(大連)有限公司合成。內(nèi)參陽模5:GACTTCTTCA CCCTGTTCTT CCTCGCACTC AACCTACACG TCAACGCTAC GGTATCGATAATCTTGTTGC GGTACTGGAT GGTAAAGTCG GGCTC-3"(Seq No. 5)校準(zhǔn)品5~-GACTTCTTCACCCTGTTCTT CCTCGCTATC AGAGATCACG ATACAGCCGG
CGGTATCGATAATCTTGTTG CGGTACTGGA TGGTAAAGTC GGGCTC-3"(Seq No. 6)含內(nèi)參的HCMV熒光定量PCR檢測試劑盒的組成為(20人份)組成成份名稱體積核酸提取液ImlPCR反應(yīng)緩沖液400 μ 1探針60 μ 1Taq 酶40 μ 1校準(zhǔn)品120 μ 1校準(zhǔn)品220 μ 1校準(zhǔn)品320 μ 1陽性對照品50 μ 1陰性對照品50 μ 1 其中，PCR反應(yīng)緩沖液(使用終濃度)包括10mM Tris-HCl (PH 8. 3)、50mM KCl、 300 μ Md(AGC)TP、300 μ MdUTP、5mM MgC12、200nM 引物 1 和 200nM 引物 2 ；熒光探針(終濃 度)包括200nM探針1和200nM探針2以及l(fā)E+4copies/ml濃度的內(nèi)參陽模；Taq酶(終 濃度)包括1U Taq酶、0. 05U UNG酶；3個校準(zhǔn)品均為靶序列片段kq No. 6，其濃度分別依 次為 lE+7copies/ml、lE+6copies/ml 和 lE+5copies/ml ；陽性對照品為 HCMV DNA 陽性臨床 血清，陰性對照品為HCMV DNA陰性的血清。
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試劑盒的操作步驟如下(1)病毒核酸提取取待測血清樣本200 μ 1 (或尿液、乳汁Iml) 3，OOOrpm離心5min，取上清， 40C 13，OOOrpm離心lOmin，棄上清，加入核酸提取液50 μ 1 (陽性和陰性對照品直接加入核 酸提取液50 μ 1)，振蕩混勻15s，100°C保溫lOmin，取出至4°C或室溫冷卻，13，OOOrpm離心 :3min。取上清供PCR擴增用。(2)熒光PCR反應(yīng)液的配制按每人份PCR反應(yīng)緩沖液20ul、探針!3ul、Taq酶2ul的配方配制PCR反應(yīng)液，并 按25ul/管分裝到0. 2ml PCR管中，然后加入5ul待檢的核酸提取產(chǎn)物，按如下程序進行 實時熒光PGR檢測反應(yīng)管先在50°C反應(yīng)2分鐘，然后94°C保溫3分鐘，再按94°C 20秒 —600C 45秒循環(huán)40次(60°C退火條件下采集FAM和JOE通道熒光)。(3)質(zhì)量監(jiān)控與結(jié)果分析
權(quán)利要求
1.含內(nèi)參的HCMV熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于包含一對特異性引物、一條 HCMV特異性檢測探針和內(nèi)參探針，分別用于檢測HCMV病毒核酸DNA和人工合成的內(nèi)參DNA 片段，其中，用于檢測HCMV病毒DNA的擴增片段長度為96bp，引物和探針序列如下引物 1 :5~-GACTTCTTCACCCTGTTCTTCC-3~(Seq No. 1)引物 2 5~-GAGCCCGACTTTACCATCCA-3~(Seq No. 2)探針 1 :5~-CTATCAGAGATCACGATACAGCCGG-3~ (Seq No. 3)探針 2 5~ -CACTCAACCTACACGTCAACGCTA-3~ (Seq No. 4)或者上述引物序列的互補序列，或者上述序列同源性大于75 %的序列。
2.含內(nèi)參的HCMV熒光定量PCR檢測試劑盒其特征在于使用人工合成的內(nèi)參DNA片段， 內(nèi)參DNA片段除探針1的結(jié)合區(qū)域更換成探針2的結(jié)合區(qū)域外，其余部分與HCMV DNA的擴 增序列最好完全相同，但亦可完全不同。內(nèi)參DNA片段序列如下內(nèi)參陽模5、-GACTTCTTCA CCCTGTTCTT CCTCGCACTC AACCTACACG TCAACGCTAC GGTATCGATA ATCTTGTTGCGGTACTGGAT GGTAAAGTCG GGCTC-3"(Seq No. 5)
3.含內(nèi)參的HCMV熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于內(nèi)參DNA片段預(yù)先加入到含 探針1和探針2的組成成分“探針”中，試劑盒的組成成分包括PCR反應(yīng)緩沖液、探針、Taq 酶、核酸提取液、校準(zhǔn)品1、校準(zhǔn)品2、校準(zhǔn)品3、陽性對照品和陰性對照品。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于兩條標(biāo)記探針的熒光發(fā)光基團不同，根 據(jù)不同的熒光定量PCR儀器，從以下熒光基團中選擇兩個分布于不同的儀器檢測通道的兩 種熒光進行組合，熒光種類為 FAM、ΤΕΤ、JOE、Cy3、Cy5、Cy5. 5、Fluorescein、Rhodamine, Rhodamine RecURhodamine Green、Rhodamine 6G、Oregon Green 488、Oregon Green 500、 Oregon Green 514> Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange 禾口 ROX ；焚光 淬滅基團根據(jù)選擇的熒光發(fā)光基團的種類和組合從DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-U BHQ-2 或BHQ-3中的選擇一種或兩種淬滅基團。優(yōu)選的方案為兩條探針分別用FAM-BHQl和 TET-BHQl進行標(biāo)記。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于PCR反應(yīng)體系包含Tris-HCl(PH 8.3)、 KCl、d (AGC) TP、dUTP、MgCl2、引物1和引物2、探針1和探針2、Taq酶、UNG酶以及適當(dāng)濃度 的內(nèi)參陽模，試劑盒校準(zhǔn)品為已知核酸DNA濃度并包含引物1和引物2擴增片段的人工合 成DNA片段，陽性對照品為適當(dāng)濃度的AD169標(biāo)準(zhǔn)病毒株，陰性對照品為超純水。校準(zhǔn)品序 列如下5-GACTTCTTCA CCCTGTTCTT CCTCGCTATC AGAGATCACG ATACAGCCGG CGGTATCGAT AATCTTGTTGCGGTACTGGA TGGTAAAGTC GGGCTC-3"(Seq No. 6)
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒其特征在于，按如下程序進行實時熒光PCR檢測反 應(yīng)管先在50°C反應(yīng)2分鐘，然后95°C保溫5分鐘，再按94°C 20秒一60°C 45秒循環(huán)40次 (60°C退火條件下采集相應(yīng)探針標(biāo)記通道的熒光)。
全文摘要
本發(fā)明涉及含內(nèi)參的HCMV熒光定量PCR檢測試劑盒。本發(fā)明針對人巨細(xì)胞病毒(HCMV)基因組的UL122基因設(shè)計了檢測引物和探針，通過設(shè)計內(nèi)參探針和內(nèi)參陽模，引入競爭性內(nèi)參擴增體系，與HCMV DNA檢測體系存在于同一反應(yīng)管中，通過引入內(nèi)參擴增體系，能有效降低因試劑盒實效或?qū)嶒灢僮魇д`等原因?qū)е碌募訇幮缘陌l(fā)生。本發(fā)明技術(shù)能快速、簡便的對HCMV DNA進行定性和定量檢測，具有較高的特異性和靈敏性。
文檔編號C12Q1/70GK102115794SQ20091024753
公開日2011年7月6日 申請日期2009年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者何劍軍, 吳大治, 夏懿, 沈維祥, 韓倩 申請人:上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司, 上海復(fù)星醫(yī)藥(集團)股份有限公司