專利名稱：一種啟動(dòng)子BgIosP519、其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種啟動(dòng)子，特別是一種單子葉植物例如水稻的啟動(dòng)子，以及所述啟 動(dòng)子的制備方法及用途。
背景技術(shù)：
啟動(dòng)子是基因的一個(gè)組成部分，通常位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游，是RNA聚合酶識(shí)別、 結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)全酶(holoenzyme)同模板正確結(jié)合，活 化RNA聚合酶，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，從而控制基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄)的起始時(shí)間和表達(dá)的程度。在轉(zhuǎn) 基因植物中，啟動(dòng)子是影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率的重要因素之一，選擇高效率的啟動(dòng)子是高效 率表達(dá)外源基因的關(guān)鍵。根據(jù)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為3類組成型啟動(dòng)子、組織或器官特異性啟動(dòng) 子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。所謂組成型啟動(dòng)子是指在組成型啟動(dòng)子調(diào)控下，不同組織器官和發(fā)育 階段的基因表達(dá)沒有明顯差異，因而稱之組成型啟動(dòng)子。雙子葉植物中最常使用的組成型 啟動(dòng)子是花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子。另一種高效的組成型啟動(dòng)子CsVMV是從木薯 口十JHc^E口十__ (cassava vein mosaic virus, CsVMV)巾^白勺。人們高度重視從植物本身克隆組成型啟動(dòng)子。例如肌動(dòng)蛋白(actin)和泛素 (ubiquitin)等基因的啟動(dòng)子已被克隆。用這些啟動(dòng)子代替CaMV 35S啟動(dòng)子，可以更有效 地在單子葉植物中驅(qū)動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄。Naomi等分別從擬南芥的色氨酸合酶β亞基基因 和植物光敏色素基因中克隆了相應(yīng)啟動(dòng)子，用其代替CaMV 35S啟動(dòng)子，在轉(zhuǎn)基因煙草中也 取得了很好的表達(dá)效果(Plant biotechnology, 2002,19(1) 19-26)。單子葉植物基因中常見的啟動(dòng)子有Ubi啟動(dòng)子(Plant ubiquitinpromoter)、 Actin 啟動(dòng)子(Plant Actin promoter)禾口 Adh-I 啟動(dòng)子(Maize alcohol dehydrogenase 1 promoter)。Ubi啟動(dòng)子以其啟動(dòng)效率高、甲基化程度低、遺傳性狀穩(wěn)定等因素而倍受青睞。目 前，已經(jīng)從很多泛素基因中分離得到啟動(dòng)子序列，包括玉米基因組中的Ubi-I啟動(dòng)子、水稻 泛素RUBQ2啟動(dòng)子、擬南芥泛素啟動(dòng)子、向日葵泛素UbBl啟動(dòng)子、煙草泛素Ubi. U4啟動(dòng)子、 馬鈴薯泛素Ubi7啟動(dòng)子、番茄泛素Ubil-I啟動(dòng)子，大麥泛素Mubl啟動(dòng)子。玉米泛素Ubi-I 啟動(dòng)子已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于玉米、小麥、水稻等單子葉植物中，水稻泛素RUBQ2啟動(dòng)子在水稻 和甘蔗中也有較多的應(yīng)用。Actin啟動(dòng)子1990年由康奈爾大學(xué)的McElroy等首次在水稻中發(fā)現(xiàn)，屬于強(qiáng)組成 型啟動(dòng)子。Actin啟動(dòng)子在單子葉禾本科中作用顯著，但是鄰近科屬的植物中的基因調(diào)控功 能卻十分不理想。因此，許多相關(guān)研究通過其他單子葉植物尋找Actin啟動(dòng)子，并成功在香 蕉、甜瓜、玉米和擬南芥中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。Actin啟動(dòng)子由于對(duì)基因表達(dá)的強(qiáng)調(diào)控作用，在單子葉 植物優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因中已經(jīng)得到越來越廣泛的應(yīng)用。Adh-I啟動(dòng)子調(diào)控乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase)基因，對(duì)植物在缺氧環(huán) 境下乙醇脫氫酶的表達(dá)至關(guān)重要。Adh-I啟動(dòng)子對(duì)單子葉植物特別是谷類植物如水稻、燕麥和大麥，和少部分雙子葉植物如煙草，基因的調(diào)控功能比花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動(dòng)子 提高10-50倍。Adh-I啟動(dòng)子主要應(yīng)用于單子葉植物，對(duì)絕大部分雙子葉植物基因表達(dá)的調(diào) 控效果都很有限。單子葉植物是被子植物的主要類群，單子葉植物中的禾本科、百合科、棕櫚科和天 南星等，是非常重要的農(nóng)業(yè)作物。單子葉植物基因的強(qiáng)效啟動(dòng)子，能夠調(diào)控植物高效率表達(dá) 具有特殊性狀的外源基因，對(duì)優(yōu)良作物的分子育種研究意義重大。在強(qiáng)效啟動(dòng)子相關(guān)研究領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了許多單子葉植物的啟動(dòng)子。此外，雙子 葉植物中的一些強(qiáng)效啟動(dòng)子如CsVMV啟動(dòng)子、番茄E8啟動(dòng)子、白藜蘆醇合酶基因Vstl啟動(dòng) 子等高效啟動(dòng)子，在單子葉植物中也有很強(qiáng)的基因調(diào)控作用。盡管已經(jīng)有上述已知的單子葉植物的啟動(dòng)子，本發(fā)明人通過對(duì)水稻基因組的深入 研究，提供了一種新的單子葉植物啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子能夠用于調(diào)控單子葉植物中目的基 因表達(dá)，同時(shí)為研究單子葉植物中目的基因表達(dá)提供了一種新的工具和選擇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種具有SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的單子葉植物 啟動(dòng)子。在本發(fā)明中，所述啟動(dòng)子的具體堿基序列長(zhǎng)度為616個(gè)堿基，如SEQ ID N0:1所 示TGGTAGAGTTGTCCGTTTGGATTTTGGCCTCCCTTTTTTTTTCCAATGGTTTTCTACCAAAATTGTTA CTATGTTTTAGCCAAAATATTCTCTCCACAATCCGCAATGTAAGTTACTATCCGTAAGACCCATAAAAAGACCCAT ACATATTTTACATACAGTCCTTTAATTAATTTATTATTATTATACCAGGACTTGTTTTATTTTATCTACAATTTA TCTCCAGAATTAGATTAAATTTCATAAAACTCCACCTGATCCGAATTACTCTACCAATAAGTAAAAGAAAAAGAA ATTTGGTTCCTTGGGCAACCGTGCCCTCTGCAGACTCTGGCAAGGCCCATACGCCGGAGAGCCCAATAAGGCCCA TCTCCTGAGACCGCAACCGCCACGAAACCCTAAAACCAAGCCCATCAGGCCCACCAACCCGAAGCCACACCCATC CCTCTCCCACTATAAATACCCGCACCCCCCACCCTGGAAACCCTAGGTTAAAGCGACGCCGCCGCCGCAAGCCGT CCGCCTTGCTCCTCCTCGCCGAGAGCTTGGTCCTCGCCGTCTCCTCTCCCCACGCGCAGATCTAAGCCTAGGGTT AGGGTTTGTGTAGCTCGCAGCG(SEQ ID NO 1)在本發(fā)明中，將SEQ ID NO :1所示的啟動(dòng)子序列稱為啟動(dòng)子BgIosP519，或簡(jiǎn)稱為 P519啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子，帶有該啟動(dòng)子和GUS的水稻愈傷組織經(jīng)GUS染色實(shí)驗(yàn) 后，所述水稻愈傷組織變藍(lán)色。本發(fā)明的又一方面，涉及具有與SEQ ID NO :1所示核苷酸序列互補(bǔ)的序列的啟動(dòng)子。本發(fā)明的又一方面，還涉及SEQ ID NO :1所示單子葉植物啟動(dòng)子的具有啟動(dòng)子功 能的選自如下的變體1)在高等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，2)對(duì)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修 飾的核苷酸序列，和3)與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列。典型地，“雜交條件”根據(jù)測(cè)量雜交時(shí)所用條件的“嚴(yán)緊性”程度來分類。嚴(yán)緊性程度可以以例如核酸結(jié)合復(fù)合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據(jù)。例如，“最大嚴(yán)緊性”典 型地發(fā)生在約Tm-5°C (低于探針Tm 5°C )；“高等嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約5-10°C;“中等 嚴(yán)緊性”發(fā)生在探針Tm以下約10-20°C ；“低嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約20-25°C。作為替 代，或者進(jìn)一步地，雜交條件可以以雜交的鹽或離子強(qiáng)度條件和/或一或多次的嚴(yán)緊性洗 滌為依據(jù)。例如，6XSSC =極低嚴(yán)緊性；3XSSC =低至中等嚴(yán)緊性；IXSSC =中等嚴(yán)緊性； 0. 5XSSC =高等嚴(yán)緊性。從功能上說，可以采用最大嚴(yán)緊性條件確定與雜交探針嚴(yán)緊同一 或近嚴(yán)緊同一的核酸序列；而采用高等嚴(yán)緊性條件確定與該探針有約80%或更多序列同 一性的核酸序列。對(duì)于要求高選擇性的應(yīng)用，典型地期望采用相對(duì)嚴(yán)緊的條件來形成雜交體，例如， 選擇相對(duì)低的鹽和/或高溫度條件。Sambrook等(Sambr00k，J.等(1989)分子克隆，實(shí)驗(yàn) 室手冊(cè)，Cold Spring HarborPress, Plainview, N. Y.)提供了包括中等嚴(yán)緊性和高等嚴(yán)緊 性在內(nèi)的雜交條件。為便于說明，用于檢測(cè)本發(fā)明的多核苷酸與其它多核苷酸雜交的合適的中度嚴(yán)緊 條件包括用 5XSSC、0. 5%SDS、1.0mM EDTA (pH 8.0)溶液預(yù)洗；在 50_65°C下在 5 X SSC 中 雜交過夜；隨后用含0. SDS的2X、0. 5X和0. 2XSSC在65°C下各洗滌兩次20分鐘。 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，能容易地操作雜交嚴(yán)緊性，如改變雜交溶液的含鹽量和/或雜 交溫度。例如，在另一個(gè)實(shí)施方案中，合適的高度嚴(yán)緊雜交條件包括上述條件，不同之處在 于雜交溫度升高到例如60-65°C或65-70°C。在本發(fā)明中，所述在高等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列雜交的核 苷酸序列，其具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動(dòng)子活性。在本發(fā)明中，所述對(duì)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、 缺失、添加修飾的核苷酸序列，是指分別或同時(shí)在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和 /或序列內(nèi)部進(jìn)行例如不超過2-45個(gè)，或者不超過2-30個(gè)，或者不超過3-20個(gè)，或者不超 過4-15個(gè)，或者不超過5-10個(gè)，或者不超過6-8個(gè)的分別用逐個(gè)連續(xù)整數(shù)表示的堿基的取 代、缺失、添加修飾。在本發(fā)明中，所述對(duì)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列進(jìn)行如上述一個(gè)或多個(gè)堿基 的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列具有與SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列相同或相似的 啟動(dòng)子活性。通過一種多核苷酸進(jìn)行說明，其所具有的核苷酸序列例如與SEQID NO 1的參考 核苷酸序列至少具95%的“同一性”是指在SEQ IDNO 1的參考核苷酸序列之每100個(gè)核 苷酸中，該多核苷酸的核苷酸序列除了含有多達(dá)5個(gè)核苷酸的不同外，該多核苷酸之核苷 酸序列與參考序列相同。換句話說，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95%相同 的多核苷酸，參考序列中多達(dá)5%的核苷酸可被刪除或被另一核苷酸替代；或可將一些核 苷酸插入?yún)⒖夹蛄兄校渲胁迦氲暮塑账峥啥噙_(dá)參考序列之總核苷酸的5% ；或在一些核苷 酸中，存在刪除、插入和替換的組合，其中所述核苷酸多達(dá)參考序列之總核苷酸的5%。參考 序列的這些突變可發(fā)生在參考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在這些末端位置之間的 任意地方，它們或單獨(dú)散在于參考序列的核苷酸中，或以一個(gè)或多個(gè)鄰近的組存在于參考 序列中。在本發(fā)明中，用于確定序列同一性和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法是例如BLAST和BLAST 2. 0 算法，它們分別描述在 Altschul 等(1977)Nucl. Acid. Res. 25 :3389_3402 和 Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403_410。采用例如文獻(xiàn)中所述或者默認(rèn)參數(shù)，BLAST 和BLAST 2. O可以用于確定本發(fā)明的核苷酸序列同一性百分?jǐn)?shù)。執(zhí)行BLAST分析的軟件可 以通過國立生物技術(shù)信息中心為公眾所獲得。在本發(fā)明中，所述與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一 性的核苷酸序列包括與SEQ ID NO :1所公開序列基本同一的多核苷酸序列，例如當(dāng)采用本 文所述方法(例如采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST分析)時(shí)，與本發(fā)明多核苷酸序列相比含有至少 90%序列同一性、優(yōu)選至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的 序列同一性的那些序列。在本發(fā)明中，所述與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性 的核苷酸序列具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動(dòng)子活性。本發(fā)明中，所述的啟動(dòng)子來源于單子葉植物，具體地，所述單子葉植物為水稻，例 如所述水禾S為日本睛(Oryza sativa L. ssp. japonicacv. Nipponbare) 0本發(fā)明的又一方面，還涉及一種含有本發(fā)明所述單子葉植物啟動(dòng)子的重組載體。 所述重組載體可以通過將上述啟動(dòng)子插入到克隆載體或表達(dá)載體而得到。適于構(gòu)建本發(fā)明所述重組載體的克隆載體包括但不限于，例如pUC18、pUC19、 pUC118、pUC119、pMD19-T、pMD20-T、pMD18-T SimpleVecter、pMD19_T Simple Vecter 等。適于構(gòu)建本發(fā)明所述的表達(dá)載體包括但不限于，例如pBI121、pl3W4、pGEM等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組載體為P8+P519重組載體。本發(fā)明的又一方面，還涉及含有本發(fā)明所述單子葉植物啟動(dòng)子的所述重組載體的 重組細(xì)胞。所述重組細(xì)胞可以通過將含有本發(fā)明所述單子葉植物啟動(dòng)子的所述重組載體轉(zhuǎn) 化至宿主細(xì)胞而得到。適于構(gòu)建本發(fā)明所述重組細(xì)胞的宿主細(xì)胞包括但不限于，例如根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞 LBA4404、EHA105、GV3101 等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組細(xì)胞為重組根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105-P519o本發(fā)明的又一方面，還涉及一種單子葉植物愈傷組織，所述愈傷組織轉(zhuǎn)化有本發(fā) 明所述的啟動(dòng)子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述單子葉植物為水稻。所述水稻包括但 不限于，中花9、中花10、中花11、臺(tái)北309、丹江8號(hào)、云稻2號(hào)、汕優(yōu)63、汕優(yōu)608、豐優(yōu)22， 黔優(yōu)88、11優(yōu)416、11優(yōu)107、11優(yōu)128,11優(yōu)718、準(zhǔn)兩優(yōu)527、川農(nóng)1號(hào)、雜0152、皖稻88、 皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻 195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101 (上述水稻品 種均可購自安徽徽商農(nóng)家福有限公司)等。在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，所述水稻為日本 睛。本發(fā)明的又一方面，還涉及一種制備本發(fā)明所述啟動(dòng)子的方法，包括如下步驟1)根據(jù)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物對(duì)，2)以水稻日本睛基因組DNA為模板，使用步驟1)中所設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物對(duì)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。本領(lǐng)域技術(shù)人員周知，可以根據(jù)待擴(kuò)增的目的核苷酸序列按照堿基互補(bǔ)原則設(shè)計(jì)
6相應(yīng)的PCR擴(kuò)增引物對(duì)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述PCR擴(kuò)增引物對(duì)如SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 3 所示。本發(fā)明的又一方面，還涉及一種調(diào)控單子葉植物中目的基因表達(dá)的方法，所述方 法包括用本發(fā)明所述單子葉植物啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化單子葉植物的愈傷組織的步驟。在本發(fā)明的一 個(gè)實(shí)施方案中，所述單子葉植物愈傷組織的轉(zhuǎn)化利用了含有本發(fā)明所述單子葉植物啟動(dòng)子 的重組細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述單子葉植物愈傷組織的轉(zhuǎn)化過程中利用了 前述的重組農(nóng)桿菌EHA105-P536。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述單子葉植物愈傷組織的 轉(zhuǎn)化過程中利用了前述的重組農(nóng)桿菌EHA105-P519。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述 單子葉植物的愈傷組織為水稻愈傷組織，具體地，所述水稻為日本晴。在本發(fā)明中，可采用植物基因轉(zhuǎn)化技術(shù)將目的基因插入到植物基因組中，包括農(nóng) 桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射、粒子轟擊、基因槍轉(zhuǎn)化和電穿孔等。本領(lǐng)域周 知，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化常被用于單子葉植物和雙子葉植物的基因轉(zhuǎn)化，但其它轉(zhuǎn)化技 術(shù)也可用于本發(fā)明所述單子葉植物的基因轉(zhuǎn)化。當(dāng)然，適于本發(fā)明的轉(zhuǎn)化單子葉植物的另 一種方法是粒子轟擊(顯微金或鎢粒子包覆轉(zhuǎn)化的DNA)胚性愈傷組織或胚胎開發(fā)。另外， 還可以采用的轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法是原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化?；蜣D(zhuǎn)化后，采用通用的方法來篩 選和再生整合有表達(dá)單元的植株。本發(fā)明中，可利用所述單子葉植物啟動(dòng)子調(diào)控目的基因表達(dá)的所述單子葉植物包 括但不限于，例如水稻、小麥、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麥等。本發(fā)明的又一方面，還涉及本發(fā)明所述單子葉植物啟動(dòng)子在單子葉植物中調(diào)控目 的基因表達(dá)的應(yīng)用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，利用本發(fā)明所述啟動(dòng)子調(diào)控的目的基因 是GUS。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述單子葉植物為水稻，具體地所述水稻為日本晴。為實(shí)現(xiàn)上述調(diào)控目的基因表達(dá)的目的，本發(fā)明所述啟動(dòng)子可以以單拷貝和/或多 拷貝的形式應(yīng)用，也可以與現(xiàn)有技術(shù)中已知的啟動(dòng)子聯(lián)用。本發(fā)明的又一方面，涉及本發(fā)明所述啟動(dòng)子在水稻育種中的用途。所述水稻為日 本晴、中花9、中花10、中花11、臺(tái)北309、丹江8號(hào)、云稻2號(hào)、汕優(yōu)63、汕優(yōu)608、豐優(yōu)22，黔 優(yōu)88、II優(yōu)416、II優(yōu)107、II優(yōu)128、II優(yōu)718、準(zhǔn)兩優(yōu)527、川農(nóng)1號(hào)、雜0152、皖稻88、 皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻 195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101。在本發(fā)明的 一個(gè)實(shí)施方案中，所述水稻為日本睛。本發(fā)明的啟動(dòng)子可成為一種新的啟動(dòng)子作為單子葉植物、尤其是水稻轉(zhuǎn)基因的工 具啟動(dòng)子，為開展低表達(dá)基因轉(zhuǎn)化苗篩選、植物花器官敗育等分子育種研究提供便利，從而 極大的縮短優(yōu)良品種的選育時(shí)間。本發(fā)明的啟動(dòng)子可廣泛用于培育水稻、小麥、玉米、小米、 甘蔗、高粱、大麥等單子葉植物。發(fā)明的有益效果為了尋找新的單子葉植物啟動(dòng)子，用于調(diào)控單子葉植物目的基因表達(dá)，同時(shí)為研 究單子葉植物基因表達(dá)提供新的工具和選擇，本發(fā)明人通過生物信息學(xué)研究獲得，并采用 生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了所述啟動(dòng)子BgIosP519的功能。具體地，所述啟動(dòng)子能夠在水稻中調(diào)控 ⑶S基因表達(dá)。


圖1是啟動(dòng)子BgIosP519的PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果，其中，泳道1 :lkb DNA Ladder Marker,泳道2 :PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道3 IOObp DNALadder Marker,其右側(cè)的數(shù)字700和600 表示所指向的Ladder Marker的條帶的大小，單位都是bp。圖2是用于構(gòu)建p8質(zhì)粒的pCAMBIA-1301質(zhì)粒示意圖。圖3是p8質(zhì)粒示意圖中多克隆位點(diǎn)和GUS序列部分的示意圖。圖4是p8質(zhì)粒示意圖。圖5是經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織的GUS染色結(jié)果。其中，由帶有本發(fā)明所述啟動(dòng)子 P519序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8+P519轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織(左)經(jīng)⑶S染色后呈現(xiàn)藍(lán)色； 不帶有本發(fā)明啟動(dòng)子序列的重組根癌農(nóng)桿菌p8質(zhì)粒的水稻愈傷組織(對(duì)照，右)經(jīng)⑶S染 色后顏色未發(fā)生變化。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì) 理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著， 黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用 試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1P519啟動(dòng)子片段的PCR擴(kuò)增和pMD18_T+P519重組載體的構(gòu)建PCR 擴(kuò)增使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒，目錄 號(hào)DP320-02)提取水稻日本睛(2009年12月18日保藏于湖北省武漢市武昌珞珈山武漢 大學(xué)保藏中心，即中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC-P200910)的基因 組DNA，根據(jù)該啟動(dòng)子在水稻日本睛gDNA中的序列，分別在首尾設(shè)計(jì)一對(duì)PCR特異性擴(kuò)增 引物(上游引物F1，加限制性酶切位點(diǎn)Kpn I和保護(hù)堿基，下游引物R1，加限制性酶切位點(diǎn) Sbf I和保護(hù)堿基)。以上述提取的水稻日本晴的gDNA為模板，使用高保真Ex Taq (TaKaRa, DRR100B)聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如表1所示。 表1基因啟動(dòng)子擴(kuò)增的PCR體系
權(quán)利要求
一種具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列或與其互補(bǔ)的核苷酸序列的啟動(dòng)子，或其具有啟動(dòng)子功能的選自如下的變體1)在高等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，2)對(duì)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，和3)與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列。
2.一種重組載體，其特征在于，所述重組載體含有權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子，優(yōu)選地， 所述重組載體為P8+P519重組載體。
3.一種含有權(quán)利要求2所述重組載體的重組細(xì)胞。
4.權(quán)利要求3所述的重組細(xì)胞，其為重組農(nóng)桿菌EHA105-P519。
5.一種單子葉植物愈傷組織，其特征在于，所述愈傷組織轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求1所述的啟 動(dòng)子，優(yōu)選地，所述愈傷組織為水稻愈傷組織，更優(yōu)選地，所述水稻為日本晴、中花9、中花 10、中花11、臺(tái)北309、丹江8號(hào)、云稻2號(hào)、汕優(yōu)63、汕優(yōu)608、豐優(yōu)22，黔優(yōu)88、II優(yōu)416、 II優(yōu)107、II優(yōu)128、II優(yōu)718、準(zhǔn)兩優(yōu)527、川農(nóng)1號(hào)、雜0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、 皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖 稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101，特別優(yōu)選地，所述水稻為日本 晴。
6.一種制備權(quán)利要求1中所述的啟動(dòng)子的方法，包括如下步驟1)根據(jù)SEQID NO :1所示的核苷酸序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物對(duì)，具體地，所述PCR擴(kuò)增 引物對(duì)為 SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO :3。2)以水稻日本晴基因組DNA為模板，使用步驟1)中所設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物對(duì)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。
7.—種調(diào)控單子葉植物中基因表達(dá)的方法，所述方法包括用權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子 轉(zhuǎn)化單子葉植物的愈傷組織的步驟，優(yōu)選地，所述愈傷組織為水稻愈傷組織，特別優(yōu)選地， 所述水稻為日本晴。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述單子葉植物愈傷組織的轉(zhuǎn)化過程中利用了權(quán) 利要求4所述的重組農(nóng)桿菌EHA105-P519。
9.權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子在調(diào)控單子葉植物中目的基因表達(dá)的用途，其中所述目的 基因?yàn)镚US，所述單子葉植物為水稻，優(yōu)選地，所述水稻為日本晴。
10.權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子在水稻育種中的用途，優(yōu)選地，所述水稻為日本晴、中花 9、中花10、中花11、臺(tái)北309、丹江8號(hào)、云稻2號(hào)、汕優(yōu)63、汕優(yōu)608、豐優(yōu)22，黔優(yōu)88、II 優(yōu)416、II優(yōu)107、II優(yōu)128、II優(yōu)718、準(zhǔn)兩優(yōu)527、川農(nóng)1號(hào)、雜0152、皖稻88、皖稻90、 皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻 197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101，特別優(yōu)選地，所述水稻 為日本晴。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種啟動(dòng)子，特別是一種單子葉植物例如水稻的啟動(dòng)子，以及所述啟動(dòng)子的制備方法及用途。本發(fā)明所述啟動(dòng)子具有SEQ IDNO1所示的核苷酸序列，或其具有啟動(dòng)子功能的選自如下的變體1)在高等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，2)對(duì)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，和3)與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及所述啟動(dòng)子的制備方法以及所述啟動(dòng)子在調(diào)控單子葉植物中目的基因表達(dá)和水稻育種中的用途。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101955937SQ200910249579
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2009年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者倪雪梅, 張耕耘, 費(fèi)小紅, 黃剛 申請(qǐng)人:深圳華大基因科技有限公司