專利名稱：一種同時(shí)檢測(cè)三類鐮刀菌毒素的快速分子檢測(cè)方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明“ 一種同時(shí)檢測(cè)三類鐮刀菌毒素的快速分子檢測(cè)方法與應(yīng)用”，專用于檢測(cè) 三種類鐮刀菌毒素，屬于植物檢疫技術(shù)領(lǐng)域，與分子檢測(cè)技術(shù)有關(guān)。
背景技術(shù)：
由鐮刀菌引起的赤霉病(Fusarium head blight or scab)是危害小麥、大麥、燕 麥、玉米、水稻、黑麥等多種禾谷類作物的一種重要病害，廣泛分布于世界溫暖潮濕地區(qū)。19 世紀(jì)90年代，北美、歐洲、亞洲等地大麥、小麥赤霉病暴發(fā)成災(zāi)；近些年來，我國(guó)小麥赤霉病 也越來越嚴(yán)重，幾乎蔓延到全國(guó)所有的小麥種植區(qū)，造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失和品質(zhì)的大幅下 降。除此之外，更為重要的是鐮刀菌產(chǎn)生的毒素能夠使人畜中毒，嚴(yán)重威脅人畜健康，造成 食品安全上的重大隱患。歐美許多國(guó)家的啤酒和飼料加工企業(yè)明確提出所收購(gòu)的大麥容忍 零毒素，我國(guó)也明確規(guī)定收購(gòu)的大、小麥赤霉病粒率不得超過4%。鐮刀菌可以產(chǎn)生單端孢霉烯族毒素(trichothecene)，他可以抑制真核細(xì)胞蛋白 質(zhì)的合成，破壞人畜的免疫系統(tǒng)，使中毒者出現(xiàn)腹瀉、嘔吐和頭暈等癥狀，而赤霉病麥中毒 是我國(guó)最主要的真菌毒素導(dǎo)致的食物中毒之一。在我國(guó)，禾谷鐮刀菌是赤霉病的主要病原 菌(Fusariumgraminearum Schwabe)，近些年石if究表明F. graminearum是一個(gè)含有許多特 定種系的復(fù)合種(Fg complex)，0’ Donnell通過宗系譜法將Fg complex劃分成12個(gè)特定 的正式命名的種。禾谷鐮刀菌產(chǎn)生B型單端孢霉烯族毒素毒素，主要包括雪腐鐮刀菌烯醇 (nivalenol，簡(jiǎn)稱NIV)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，簡(jiǎn)稱DON)，其中DON毒素 又具有兩種衍生物，分別為3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-Acetyldeoxynivalenol，簡(jiǎn) 稱3AD0N)和15-乙?；撗跹└牭毒┐?15-Acetyldeoxynivalenol，簡(jiǎn)稱15AD0N)。 由于這三種鐮刀菌毒素嚴(yán)重威脅到人類和動(dòng)物的安全，國(guó)內(nèi)外育種界、病理學(xué)界、醫(yī)學(xué)界以 及各國(guó)政府檢驗(yàn)檢疫部門對(duì)這三種毒素的監(jiān)測(cè)監(jiān)控研究十分重視。鐮刀菌毒素的檢測(cè)主要有生物測(cè)定法、化學(xué)測(cè)定法、酶聯(lián)免疫吸附法、特異性聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等手段。生物測(cè)定法由于沒有統(tǒng)一的規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)，并且有易污染、檢測(cè)分析不 準(zhǔn)確以及與毒素互作機(jī)制復(fù)雜等缺點(diǎn)，所以在實(shí)際鐮刀菌毒素含量檢測(cè)中未能得到廣泛應(yīng) 用?；瘜W(xué)測(cè)定法是目前用于鐮刀菌毒素定量測(cè)定的主要方法，具有是快速、準(zhǔn)確、重演性 好的優(yōu)點(diǎn)。但其純化程序比較費(fèi)時(shí)和復(fù)雜，技術(shù)含量要求也較高，不能滿足口岸快速檢測(cè) 的要求。酶聯(lián)免疫吸附法操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用較低，但因?yàn)闄z測(cè)出的毒素中常含有一些其它衍 生物，所以測(cè)定的結(jié)果往往偏高。而且目前已有商品化的只有快速檢測(cè)DON毒素的ELISA 試劑盒，還沒有檢測(cè)OTV的試劑盒問世，也不能區(qū)分DON毒素的兩種衍生物。根據(jù)美國(guó)農(nóng) 業(yè)部Ward博士的最新報(bào)道，產(chǎn)生3AD0N的鐮刀菌具有更強(qiáng)的產(chǎn)孢率和生長(zhǎng)速率，對(duì)麥類 作物的危害更為嚴(yán)重，并且正在取代產(chǎn)生其他毒素的鐮刀菌，表現(xiàn)出更強(qiáng)的適應(yīng)性(Ward， Τ.J. et al. 2008. An adaptiveevolutionary shift in Fusarium head blight pathogen populations is driving the rapid spread of moretoxigenic Fusarium graminearum in North America. Fungal Genet. Biol. 45 :473-484.)。在中國(guó)，我們也發(fā)現(xiàn)了類似的情況(Zhang et al. 2009. Population genetic analysis of Fusarium asiaticumpopulations from barley suggest a recent shift favoring 3ADON producers in southern China. Unpublished)。所以對(duì)于3AD0N和15AD0N的檢測(cè)也是十分必要的。隨著近年來國(guó)際貿(mào)易 中各國(guó)之間糧食進(jìn)出口規(guī)模不斷擴(kuò)大，各國(guó)口岸都加強(qiáng)了對(duì)糧食作物的出入境管理，檢疫 實(shí)踐中急需一種套快速、簡(jiǎn)單、靈敏的檢測(cè)方法來檢測(cè)進(jìn)出口糧食是否存在毒素污染。近年來隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，在鐮刀菌毒素合成的基因表達(dá)調(diào)控方面取得 了一系列的重要進(jìn)展，揭示了 trichothecen毒素合成途徑中多個(gè)基因的作用。因此，國(guó)內(nèi) 外研究者都希望通過這些分子生物學(xué)結(jié)果和相關(guān)基因的序列信息，找到一種簡(jiǎn)便、快速、 低成本的鐮刀菌毒素檢測(cè)方法。Kim等通過Tri5、Tril3和Tri7基因序列，檢測(cè)分別來 自大麥、小麥和棉花的禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的毒素DON和NIV(Kim et al. 2003. Polymorphism of trichothecenebiosynthesis genes in deoxynivalenol-and nivalenol-producing Fusarium graminearum isolates. Myco 1. Res. 107 :190-197.)，但其中 Tri5 檢測(cè)法涉 及Southern雜交，費(fèi)用高，耗時(shí)長(zhǎng)，難以在實(shí)際中推廣應(yīng)用。Chandler等通過Tri7和 Tril3基因檢測(cè)了三種鐮刀菌F. graminearu, F. cuImorum和F. cereali產(chǎn)毒情況，應(yīng)用 了 10對(duì)引物，但DON和NIV特異片段長(zhǎng)度不確定，而且較多的毒素檢測(cè)結(jié)果相互之間 不吻合(Chandler et al. 2003. Development of PCR assays toTri 7 and Tri13 and characterisation of chemotypes of Fusarium graminearum， Fusarium culmorum， and Fusarium cerealis. Physiol. Mol. Plant Pathol. 62 :355-367.)。李和平等利用 Tri5_Tri6 基因間隔區(qū)序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，能夠穩(wěn)定的檢測(cè)出禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的NIV和DON毒素 (Li et al. 2005. Development of a generic PCR detection of deoxynivalenol-and ηivalenol-chemotypes ofFusarium graminearum. FEMS Microbiol. Lett. 243 505-511.)，同時(shí)能夠應(yīng)用于小麥、玉米籽粒的檢測(cè)，但仍然不能檢測(cè)出DON毒素的兩種衍 生物，并且只適用于禾谷鐮刀菌，對(duì)于產(chǎn)生此類毒素的其他鐮刀菌的檢測(cè)并無說明。并且以 上方法由于DNA提取方法的限制，并不能真正滿足快速檢測(cè)的需求。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是研制一種能夠快速準(zhǔn)確檢測(cè)鐮刀菌本身產(chǎn)生毒素和 糧食、食品安全中鐮刀菌毒素污染的分子檢測(cè)方法，已達(dá)到快速、準(zhǔn)確、低成本并且能夠同 時(shí)檢測(cè)出三種重要鐮刀菌毒素(NIV，3AD0N和15AD0N)的目的，適用于禾谷鐮刀菌復(fù)合種 (Fgcomplex)下的全部12個(gè)種和同樣產(chǎn)生trichothecen毒素的四個(gè)近緣種(F. culmorum, F. cerealis, F. pseudograminearum, F. lunulosporum)。同時(shí)，本方法米用多重 PCR 技術(shù)，四 對(duì)引物在同一反應(yīng)體系中同時(shí)高效擴(kuò)增三種類型毒素的特異片段，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性， 結(jié)合DNA快速提取技術(shù)，無需繁雜耗時(shí)的傳統(tǒng)DNA提取步驟，大大節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間，并且需 要樣品量極少，只要5mg菌絲或單個(gè)小麥病籽粒即可完成檢測(cè)，非常適合檢驗(yàn)檢疫的需要， 可以試劑盒的形式在我國(guó)大規(guī)模推廣。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的利用已經(jīng)公開發(fā)表的多個(gè)鐮刀菌毒素合成調(diào)控基因Trill 的序列信息，通過序列比對(duì)，找到產(chǎn)生不同類型毒素菌株的特異性單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn) (SNP)，設(shè)計(jì)一組復(fù)合引物。經(jīng)過一次PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)產(chǎn)物大 小可直接檢測(cè)出鐮刀菌本身產(chǎn)生的毒素NIV、3AD0N和15AD0N，同時(shí)可用于田間小麥籽粒中三種毒素的檢測(cè)。技術(shù)方案用于檢測(cè)三種重要鐮刀菌毒素的復(fù)合PCR方法，包括1)用于檢測(cè)鐮刀菌毒素的樣品制備a)菌絲DNA的快速提取技術(shù)將保存的赤霉病菌活化，首先挑取菌絲在PDA培養(yǎng)基(去皮馬鈴薯200g，葡萄糖 20g,瓊脂20g，蒸餾水1000ml)上，28°C，培養(yǎng)3天，用槍頭挑取少量菌絲，放入PCR管，加入 50 μ 1 Buffer A 溶液(IOOmM NaOH，2%Tween 20，Buffer A 用 IOM NaOH 和 20%Tween 20 現(xiàn)配)，95°C溫育 10 分鐘。再加入 50 μ 1 Buffer B 溶液(IOOmM Tris_HCl，2mM EDTA)， 振蕩混勻，12000rpm離心15秒，取1 μ 1上清液做PCR擴(kuò)增的模板，直接加到PCR反應(yīng)體系 中。DNA提取過程耗時(shí)15分鐘。本實(shí)驗(yàn)采用菌株見表1.b)單個(gè)小麥赤霉病籽粒DNA的快速提取技術(shù)取小麥赤霉病籽粒一粒，液氮冷凍，用Biospec公司的MiniBeadbeater-96珠磨式 組織研磨儀進(jìn)行高速振蕩研磨40秒。加入50 μ 1 Buffer A溶液，振蕩混勻2分鐘，再加入 50 μ 1 Buffer B溶液，震蕩混勻1分鐘，12000rpm離心15秒，取1 μ 1上清液做PCR擴(kuò)增的 模板，直接加到PCR反應(yīng)體系中。DNA提取過程耗時(shí)5分鐘。2)用于檢測(cè)鐮刀菌毒素的特異性引物四條引物序列為Primer A :5’ -CTTGTCAGGCGGCACAGTAG-3’Primer B :5’ -AAGTATGGTCCAGTTGTCCGTATT-3’Primer C :5’ -GCAAGTCTGGCGAGGCC-3’Primer D :5，-TCAAAGGCCAGAGCAACCC-3，其中primer A/D引物對(duì)在產(chǎn)生雪腐鐮刀菌烯醇(NIV)毒素的鐮刀菌中特異性擴(kuò) 增出64;3bp的產(chǎn)物，primer B/D引物對(duì)產(chǎn)生15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15AD0N)毒 素的鐮刀菌中特異性擴(kuò)增出424bp的產(chǎn)物，primer C/D引物對(duì)產(chǎn)生3-乙?；撗跹└?刀菌烯醇(3AD0N)毒素的鐮刀菌中特異性擴(kuò)增出342bp的產(chǎn)物。3) PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系^ 20μ 1 JxIS^Φ, 1 - - 0. 3μΜ primer A,0. 1 μ M primer B,0. 15μΜ primer C 禾口 0· 3 μ Mprimer D, 10μ 1 2 X TaqMix (包含 0· IU Taq Polymerase/μ 1,500 μ M dNTP,20mM Tris-HCl, IOOmM KCl,3mM MgCl2)，1 μ 1菌絲DNA或小麥赤霉病籽粒DNA做模板。4) PCR擴(kuò)增程序94°C 預(yù)變性 3min，94°C 變性 40min，69°C 退火 Imin，72°C 延伸 Imin，30 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸IOmin。整個(gè)PCR過程用時(shí)2小時(shí)。4) PCR產(chǎn)物的鑒定取5 μ 1 PCR產(chǎn)物用1. 5 % (重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分離30分鐘，經(jīng)溴化乙 錠染色后于紫外燈下根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果。有益效果本發(fā)明根據(jù)已發(fā)現(xiàn)的鐮刀菌毒素生物合成調(diào)控基因序列信息，設(shè)計(jì)一套引物，僅 僅通過一步PCR反應(yīng)，即可簡(jiǎn)單快速可靠的鑒定出多個(gè)種下的鐮刀菌產(chǎn)生的毒素類型NIV、3AD0N和15AD0N，與化學(xué)分析法檢測(cè)菌株本身產(chǎn)生的毒素類型完全吻合。與國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有方 法相比，本發(fā)明具有以下的技術(shù)優(yōu)勢(shì)1)檢測(cè)毒素更多。本方法根據(jù)Trill基因內(nèi)三種不同毒素類型菌株的單核苷酸多 態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。通過擴(kuò)增一個(gè)基因同時(shí)檢測(cè)到三種重要的鐮刀菌毒素OTV、 3AD0N 和 15AD0N。2)操作簡(jiǎn)便快捷。本發(fā)明采用復(fù)合PCR技術(shù)，四對(duì)引物在同一反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò) 增，同時(shí)采用新的DNA快速提取技術(shù)，省去了傳統(tǒng)DNA制備的繁瑣過程。整個(gè)過程簡(jiǎn)單、快 速、高效。一般整個(gè)檢測(cè)過程可在3個(gè)小時(shí)內(nèi)完成。3)特異性強(qiáng)，應(yīng)用范圍廣。本方法適用于禾谷鐮刀菌復(fù)合種(Fg complex)下 的全部12個(gè)種和同樣產(chǎn)生trichothecen毒素的四個(gè)近緣種(F. culmorum, F. cerealis, F. pseudograminearum,F. lunulosporum)的檢測(cè)。同時(shí)，既可檢測(cè)鐮刀菌本身產(chǎn)生的毒素， 也可用于田間小麥籽粒中三種毒素的檢測(cè)，與植物基因組DNA無交叉擴(kuò)增反應(yīng)。4)成本低。本方法所用DNA快速提取和PCR過程均為常規(guī)試劑，價(jià)格低廉，每個(gè)樣 品的檢測(cè)成本約為1元人民幣。因此本方法實(shí)用性強(qiáng)，可滿足植物檢疫及病害監(jiān)測(cè)的需要。


圖1 本發(fā)明技術(shù)流程2 對(duì)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株的PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果M 分子量標(biāo)準(zhǔn) IOObp ；1-8,產(chǎn)生 NIV 毒素菌株NRRL13818，NRRL25797, NRRL29297, NRRL38380, NRRL28721, NRRL28723, NRRL13393, NRRL13721 ；9-12，產(chǎn)生 15AD0N 毒素菌株:NRRL38208, NRRL46722, NRRL5883, NRRL 29020 ；13-17，產(chǎn)生 3AD0N 毒素菌株 NRRL6101, NRRL31281, NRRL2903, NRRL3288, NRRL28338。圖3 對(duì)中國(guó)采集菌株的PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果M 分子量標(biāo)準(zhǔn) IOObp ；18-20，產(chǎn)生 NIV 毒素菌株:13033,7071,7069 ；21-25，產(chǎn) 生 15AD0N 毒素菌株:7076,3002,5226,4021,5167 ；26-34,產(chǎn)生 3AD0N 毒素菌株:13082, 13081,5039,4022,7107,7092,11036，1009，8003。圖4 田間接種小麥赤霉病籽粒的PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果M 分子量標(biāo)準(zhǔn)IOObp ； 1，健康小麥籽粒；2，接種菌株13033 (NIV)的小麥病籽粒；3 接種菌株7076(15AD0N)的小麥病籽粒；4，接種菌株13082 (3AD0N)的小麥病籽粒；5，接種 混合菌株13033、7076和13082的小麥病籽粒圖5 田間自然發(fā)病小麥赤霉病籽粒的PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果M 分子量標(biāo)準(zhǔn)IOObp ；1，健康小麥籽粒；2，四川宣漢采集病粒，3，河北邯鄲采集病 粒，4-6湖北荊州采集病粒。
具體實(shí)施例方式實(shí)施實(shí)例1 :NRRL國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株的產(chǎn)生毒素的檢測(cè)鑒定1)菌株DNA的快速提取NRRL菌株由美國(guó)農(nóng)業(yè)部0’ Donnell博士提供(表1)，其毒素類型已知。將NRRL菌株活化，首先挑取菌絲在PDA培養(yǎng)基(去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水 1000ml)上J8°C，培養(yǎng)3天，用槍頭挑取少量菌絲，放入PCR管，加入50 μ 1 BufferA溶液 (IOOmM Na0H，2%Tween 20，Buffer A 用 IOM NaOH 和 20%Tween 20 現(xiàn)配)，95°C溫育 10 分鐘。再加入 50 μ 1 Buffer B 溶液(IOOmM Tris_HCl，2mM EDTA)，振蕩混勻，12000rpm 離 心15秒，取1 μ 1上清液做PCR擴(kuò)增的模板，直接加到PCR反應(yīng)體系中。表1本發(fā)明采用的不同國(guó)家和地區(qū)產(chǎn)毒素的鐮刀菌菌株
權(quán)利要求
1.用于檢測(cè)三類鐮刀菌毒素的特異性引物四條，primerΑ/Β和primier E/F，其引物 序列為Primer A :5’ -CTTGTCAGGCGGCACAGTAG-3’Primer B :5’ -AAGTATGGTCCAGTTGTCCGTATT-3’Primer C :5’ -GCAAGTCTGGCGAGGCC-3’Primer D :5’ -TCAAAGGCCAGAGCAACCC-3，其中primer A/D引物對(duì)在產(chǎn)生雪腐鐮刀菌烯醇(OTV)毒素的鐮刀菌中特異性擴(kuò)增出 643bp的產(chǎn)物，primer B/D引物對(duì)產(chǎn)生15-乙?；撗跹└牭毒┐?15AD0N)毒素的鐮 刀菌中特異性擴(kuò)增出424bp的產(chǎn)物，primer C/D引物對(duì)產(chǎn)生3-乙?；撗跹└牭毒?醇(3AD0N)毒素的鐮刀菌中特異性擴(kuò)增出342bp的產(chǎn)物。
2.一種同時(shí)檢測(cè)三類鐮刀菌毒素的快速分子檢測(cè)方法，其步驟包括1)從被測(cè)生物材料中抽提DNA，得到DNA樣品；2)用權(quán)利要求1中的所示的引物對(duì)步驟1)中的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到權(quán)利要求 1中的特異性大小的DNA片段。3)用步驟2)的到的DNA片段，檢測(cè)所述生物材料重視否存在所述的毒素3AD0N和/或 15AD0N 禾口 / 或 NIV。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述鐮刀菌毒素特異性檢測(cè)方法，其中的PCR步驟包括1)擴(kuò)增反應(yīng)體系在20μ 1反應(yīng)液中，包含50ng模板DNA，0. 3μΜ primerA,0. ΙμΜ primerB,0. 15 μ M primer C 禾口 0· 3 μ M primer D, 10μ 1 2 X TaqMix (包含 0. IU Taq Polymerase/μ 1,500 μ M dNTP,20mM Tris-HCl,IOOmM KCl,3mM MgCl2)。2)PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?41預(yù)變性31^11，941變性401^11，691退火 lmin，72°C 延伸 Imin， 30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。3)電泳檢測(cè)反應(yīng)完成后，取7μ 1 PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像系統(tǒng) 中紫外燈下照相，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物大小判定結(jié)果。
4.一種同時(shí)檢測(cè)三類鐮刀菌毒素的快速分子檢測(cè)方法在檢測(cè)鐮刀菌毒素中的應(yīng)用。
5.一種同時(shí)檢測(cè)三類鐮刀菌毒素的快速分子檢測(cè)方法在檢測(cè)籽粒，飼料或食品安全中 鐮刀菌毒素的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明專用于檢測(cè)三類最常見的鐮刀菌毒素，屬于植物檢疫技術(shù)領(lǐng)域，具體的說涉及一種鐮刀菌毒素的分子檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。該方法根據(jù)鐮刀菌基因組內(nèi)與毒素合成密切相關(guān)的Tri11基因，自行設(shè)計(jì)一組復(fù)合引物，從中國(guó)和國(guó)外采集得到的鐮刀菌中檢測(cè)分離得到鐮刀菌毒素NIV、15ADON和3ADON的特異片段，該片段全長(zhǎng)分別為643bp、424bp和342bp。本發(fā)明僅僅采用一組特異性引物，進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增反應(yīng)，利用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，直接根據(jù)產(chǎn)物片斷的長(zhǎng)度，即可檢測(cè)出禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的三種B型毒素的類型，本發(fā)明可應(yīng)用于谷物、飼料和食品安全中毒素DON和NIV污染的檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102094080SQ200910250238
公開日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2009年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月9日
發(fā)明者馮潔, 張力勍, 張昊, 徐進(jìn), 潘哲超, 田茜, 許景升 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所