專利名稱：DcR3和GAD65雙基因共表達重組腺病毒及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種重組腺病毒，特別涉及一種DcR3和GAD65雙基因共表達重組腺病 毒，還涉及該重組腺病毒的制備方法和應用。
背景技術：
隨著人民生活水平的提高以及生活方式的改變，糖尿病的發(fā)病率日益增加，已成 為繼心血管疾病和腫瘤之后影響群眾健康和生命的第三大疾病。胰島移植具有簡便、安全、 有效的特點，術后患者不需要依賴外源胰島素即能糾正體內糖代謝紊亂，明顯提高生活質 量，在糖尿病特別是1型糖尿病的治療中備受矚目。但是，由于供受體的遺傳背景差異，胰 島移植容易受到宿主的免疫排斥以致發(fā)生移植后并發(fā)癥，從而影響治療效果。而誘導特異 性T細胞耐受對胰島移植排斥是一種很有希望的治療策略。迄今報告的胰島候選自身抗原已逾20種，其中谷氨酸脫羧酶65 (glutamic acid decarboxylase 65，GAD65)被認為是最重要的自身抗原，并極有可能是1型糖尿病的始動 靶抗原，在早期的1型糖尿病患者中有大量GAD65特異性T細胞存在。因此，可以利用GAD65 誘導特異性T細胞耐受以避免胰島移植排斥。誘騙受體(decoy receptor)是指那些細胞膜 外區(qū)與功能性受體細胞外區(qū)結構相似，能結合配體，但細胞質區(qū)缺乏轉導信號能力的受體。 誘騙受體通過與功能性受體競爭性結合相同的配體，從而在受體水平對細胞活性和分化以 及免疫功能發(fā)揮調控作用。誘騙受體3 (decoy receptor, DcR3)是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因 子受體超家族成員，具有調節(jié)細胞凋亡和免疫細胞活性及分化的生物學特性，在腫瘤免疫、 自身免疫、移植免疫及抗感染免疫中發(fā)揮著重要作用。轉基因非肥胖型糖尿病大鼠模型實 驗證明，DcR3能阻止自身免疫細胞及環(huán)磷酰胺對胰島0細胞的自身免疫性損傷，防止糖尿 病的發(fā)生，還能明顯減輕胰島炎性反應。此外，動物移植模型實驗證明，DcR3轉基因胰島細 胞移植成功率明顯高于野生型胰島細胞?；蚵?lián)合治療的方式主要有兩種一是將多種分別攜帶不同基因的重組表達載體 同時轉染靶細胞，這種方式可以自由調節(jié)各重組表達載體的比例，但需要分別構建攜帶不 同基因的重組表達載體，構建工作繁瑣、費時，影響因素多；此外，由于轉染過程具有一定隨 機性，轉染后的細胞存在基因拷貝不均一的問題，既不利于目的基因的表達及后續(xù)治療，又 導致實驗結果難于評估分析；上述缺點限制了此種方式的進一步應用。二是將兩個或兩個 以上的基因由一個載體攜帶表達，這種方式可以通過多啟動子載體、多順反子載體或融合 基因等調控手段提高基因轉染效率，增加表達強度，并維持相對的表達比例，從而克服了前 一種方式的不足，近年來日益受到研究者的重視。樹突狀細胞不僅是機體內功能最強大的抗原遞呈細胞，可以有效激活初始T細胞 啟動免疫應答反應，而且樹突狀細胞本身具有調節(jié)免疫反應、誘導免疫耐受的作用。體外構 建攜帶免疫抑制分子基因的重組病毒并轉染樹突狀細胞制成樹突狀細胞疫苗，再將其回輸 體內，已廣泛應用于誘導免疫耐受等方面的治療。有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種DcR3和GAD65雙基因共表達重組腺病毒，能夠誘導特異性T細胞耐受，有效抑制胰島β細胞的破壞，并延長移植胰島的生存期； 目的之二在于提供所述DcR3和GAD65雙基因共表達重組腺病毒的制備方法；目的之三在于 提供所述DcR3和GAD65雙基因共表達重組腺病毒的應用。

發(fā)明內容
為達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案1、DcR3和GAD65雙基因共表達重組腺病毒，所述重組腺病毒基因組中包含一個 DcR3和GAD65雙基因表達盒，所述DcR3和GAD65雙基因表達盒由上游至下游依次包含CMV 啟動子、DcR3全長編碼基因、終止子、內部核糖體進入位點IRES、GAD65全長編碼基因和終
止子。 2、所述DcR3和GAD65雙基因共表達重組腺病毒的制備方法，包括以下步驟a、RT-PCR 擴增 DcR3 全長 cDNA ；b、RT-PCR 擴增 GAD65 全長 cDNA ；C、將步驟a所得DcR3全長cDNA插入pStar載體的IRES上游，步驟b所得GAD65 全長cDNA插入pStar載體的IRES下游，得重組載體pStar-DcR3-IRES_GAD65 ；d、以步驟c所得重組載體pStar-DcR3-IRES-GAD65為模板，PCR擴增 DcR3-IRES-GAD65片段并更換該片段兩端的酶切位點；e、將步驟d所得DcR3-IRES_GAD65片段插入腺病毒穿梭載體pShuttle_CMV的CMV 啟動子下游，得重組腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-DcR3-IRES-GAD65 ；f、將步驟e所得重組腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-DcR3-IRES-GAD65與腺 病毒骨架載體PAdEasy-I在大腸桿菌BJ5183中進行胞內同源重組，得重組腺病毒載體 pAd-DcR3/GAD65 ；g、將重組腺病毒載體pAd-DcR3/GAD65在293細胞中包裝成重組腺病毒Ad_DcR3/ GAD65。進一步，步驟a的具體方法為提取人肝組織總RNA，逆轉錄得到總cDNA，再以該總 cDNA為模板，以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示序列為上下游引物，PCR擴增兩端分別帶 有Pst I和EcoR I酶切位點的DcR3全長cDNA，PCR循環(huán)條件參數(shù)為94°C預變性5分鐘； 然后94°C變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30個循環(huán)；最后72°C延伸10分 鐘；PCR產物經(jīng)純化后克隆入pT-Easy載體，得重組載體pT_DcR3 ；進一步，步驟b的具體方法為提取人胰腺組織總RNA，逆轉錄得到總cDNA，再以該 總cDNA為模板，以SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示序列為上下游引物，PCR擴增兩端分 別帶有BamH I和Sal I酶切位點的GAD65全長cDNA，PCR循環(huán)條件參數(shù)為94°C預變性5 分鐘 ’然后94°C變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30個循環(huán)；最后72°C延伸 10分鐘；PCR產物經(jīng)純化后克隆入pT-Easy載體，得重組載體pT_GAD65 ；進一步，步驟c的具體方法為自重組載體pT_DcR3中用Pst I和EcoR I雙酶 切出DcR3全長cDNA，經(jīng)純化后與同樣用Pst I和EcoR I雙酶切的pStar載體連接，得重 組載體pStar-DcR3 ；再自重組載體pT_GAD65中用BamH I和Sal I雙酶切出GAD65全長 cDNA，經(jīng)純化后與同樣用BamH I和Sal I雙酶切的重組載體pStar-DcR3連接，得重組載體 pStar-DcR3-IRES-GAD65 ；進一步，步驟d的具體方法為以重組載體pStar-DcR3-IRES-GAD65為模板，以SEQID No. 7和SEQ ID No. 8所示序列為上下游引物進行PCR，將DcR3_IRES_GAD65片段兩端的 酶切位點更換為Sal I酶切位點和Not I酶切位點，PCR循環(huán)條件參數(shù)為94°C預變性5分 鐘；然后94°C變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30個循環(huán)；最后72°C延伸10 分鐘；PCR產物經(jīng)純化后克隆入pT-Easy載體，得重組載體pT-DcR3-IRES_GAD65 ；進一 步，步驟e的具體方法為自重組載體pT-DcR3-IRES-GAD65中用Sal I和 Not I雙酶切出DcR3-IRES-GAD65片段，經(jīng)純化后與同樣用Sal I和Not I雙酶切的腺病毒 穿梭載體pShuttle-CMV連接，得重組腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-DcR3-IRES-GAD65 ；進一步，步驟f的具體方法為將重組腺病毒穿梭載體 pShuttle-CMV-DcR3-IRES-GAD65用Pme I酶切線性化，再與腺病毒骨架載體pAdEasy-Ι同 時電轉化大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細胞，進行胞內同源重組，得重組腺病毒載體pAd-DcR3/ GAD65 ；進一步，步驟g的具體方法為將人胚胎腎293細胞以40% 60%的細胞密度接 種至培養(yǎng)瓶中，待細胞生長至30 % 50 %融合時，采用Lipofectamine 2000試劑將重組腺 病毒載體pAd-DcR3/GAD65轉染293細胞，待細胞出現(xiàn)明顯病變時離心收集細胞，用磷酸鹽 緩沖液重懸后，反復凍融使細胞裂解，離心去除細胞碎片，收集含病毒的上清液，即得重組 腺病毒 Ad-DcR3/GAD65。3、所述DcR3和GAD65雙基因共表達重組腺病毒在制備抗胰島移植排斥的樹突狀 細胞疫苗中的應用。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明將胰島特異性抗原GAD65與新型免疫抑制分子 DcR3進行聯(lián)合表達，可以誘導GAD65特異性的淋巴細胞免疫耐受，使胰島細胞能局部性 逃逸免疫系統(tǒng)的識別和攻擊，而其他正常組織和器官不會受到影響。將本發(fā)明的DcR3和 GAD65雙基因共表達重組腺病毒體外轉染樹突狀細胞再回輸糖尿病易患性NOD小鼠并同 時進行胰島移植，結果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的重組腺病毒能夠降低糖尿病易患性NOD小鼠淋巴細 胞的增殖能力和細胞因子分泌能力，能夠延遲NOD小鼠糖尿病的發(fā)病時間并降低發(fā)病率， 而且能夠延長移植胰島的生存期，表明本發(fā)明的重組腺病毒能夠有效誘導特異性T細胞耐 受，有效抑制胰島β細胞的破壞，并延長移植胰島的生存期，可以用于制備抗胰島移植排 斥的樹突狀細胞疫苗，在1型糖尿病治療領域具有良好的開發(fā)應用前景。同時，本發(fā)明重組 腺病毒的制備方法簡單，成本低。為了使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結合附圖對本發(fā)明作進 一步的詳細描述，其中


圖1顯示了 DcR3全長cDNA PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果(1泳道為DNA分子 量標準，2泳道為PCR產物)；圖2顯示了 GAD65全長cDNA PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果(1泳道為DNA分子 量標準，2泳道為PCR產物)；圖3顯示了 DcR3和GAD65雙基因共表達的免疫印跡(Western Blot)結果(1泳 道為Ad-DcR3/GAD65病毒轉染樹突狀細胞的總蛋白，2泳道為空病毒轉染樹突狀細胞的總 蛋白)；圖4顯示了淋巴細胞增殖能力的檢測結果；
圖5顯示了淋巴細胞分泌細胞因子能力的檢測結果；圖6顯示了 NOD小鼠糖尿病的平均發(fā)病率；圖7顯示了胰島平均生存期檢測結果。以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。優(yōu)選實施例中未注明 具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克 等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
具體實施例方式一、重組腺病毒Ad_DcR3/GAD65的制備1、DcR3 全長 cDNA 的克隆按Trizol試劑盒說明書提取人肝組織總RNA，逆轉錄得到總cDNA，再以該總cDNA 為模板，以 F1 :5，-aat￡i￡^gtcgcgagcggccgcacaacttt-3，(SEQ ID No. 1，下劃線部分為 Pst I 酶切位點)禾口 R1 5' -tacgaattcgtgcacagggaggaagcgctcacg-3' (SEQID No. 2，下劃 線部分為EcoR I酶切位點)為上下游引物，PCR擴增DcR3全長cDNA，PCR體系為50iU，循 環(huán)條件參數(shù)為94°C預變性5分鐘；然后94°C變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘， 共30個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。PCR產物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、凝膠回收試劑盒切 膠回收純化后，與pT-Easy載體連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞，用含有氨 芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質粒，測序鑒定，將陽性克隆質粒命名為pT-DcR3。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示PCR產物在約900bp處呈單一特異性條帶(圖1)，與預 期結果相符；測序結果顯示陽性克隆質粒的插入基因序列(SEQ ID No. 3)與GenBank登錄 號為NM_003823的DcR3全長cDNA序列一致。2、GAD65 全長 cDNA 的克隆按Trizol試劑盒說明書提取人胰腺組織總RNA，反轉錄得到總cDNA，再以該 總 cDNA 為模板，以 F2 :5，-gatcggatcctaccgtagaggccc-3‘ (SEQ ID No. 4，下劃線部分為 BamH I 酶切位點)禾口 R2 :5，-acgcgtcgacaatatttagaacaggttcc-3‘ (SEQ ID No. 5,下劃線 部分為Sal I酶切位點)為上下游引物，PCR擴增GAD65全長cDNA，PCR體系為50iU，循環(huán) 條件參數(shù)為94°C預變性5分鐘；然后94°C變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共 30個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。PCR產物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、凝膠回收試劑盒切膠 回收純化后，與pT-Easy載體連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞，用含有氨芐 青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質粒，測序鑒定，將陽性克隆質粒命名為PT-GAD65。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示PCR產物在約1800bp處呈單一特異性條帶(圖2)，與預 期結果相符；測序結果顯示陽性克隆質粒的插入基因序列(SEQ ID No. 6)與GenBank登錄 號為NM_000818的GAD65全長cDNA序列一致。3、重組載體 pStar-DcR3-IRES_GAD65 的構建根據(jù)DcR3和GAD65全長cDNA兩端所設計的酶切位點，首先將DcR3全長cDNA插 入pStar載體的IRES上游，再將GAD65全長cDNA插入pStar載體的IRES下游。具體方 法為先將pT-DcR3載體用Pst I和EcoR I雙酶切，雙酶切產物經(jīng)凝膠回收試劑盒切膠 回收純化后，與同樣經(jīng)Pst I和EcoR I雙酶切的pStar載體連接，連接產物轉化大腸桿菌 DH5a感受態(tài)細胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質粒，Pst I和EcoR I 雙酶切鑒定，將陽性克隆質粒命名為pStar-DcR3 ；再將pT-GAD65載體用BamH I和Sal I雙酶切，雙酶切產物經(jīng)凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，與同樣經(jīng)BamH I和Sal I雙酶切 的pStar-DCR3載體連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞，用含有氨芐青霉素 的LB平板篩選陽性克隆，提取質粒，BamH I和Sal I雙酶切鑒定，將陽性克隆質粒命名為 pStar-DcR3-IRES-GAD65。4、重組載體 pShuttle-CMV-DcR3-IRES_GAD65 的構建以 pStar-DcR3-IRES-GAD65 載體為模板，以 F3 5‘ -acgcgtcgactcgcgagcggccg-ca caacttt-3，(SEQ ID No. 7，下劃線部分為 Sal I 酶切位點)和 R3 :5，-agaatcgcggccgc-aa tatttagaacaggttcc-3，(SEQ ID No. 8，下劃線部分為Not I酶切位點)為上下游引物，PCR 擴增DcR3-IRES-GAD65片段并將該片段兩端的酶切位點更換為Sal I酶切位點和Not I 酶切位點，PCR體系和循環(huán)條件參數(shù)同前。PCR產物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、凝膠回收試 劑盒切膠回收純化后，與pT-Easy載體連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞， 用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質粒，測序鑒定，將陽性克隆質粒命名為 pT-DcR3-IRES-GAD65。將pT-DcR3-IRES_GAD65載體用Sal I和Not I雙酶切，雙酶切產物經(jīng)凝膠回收試 劑盒切膠回收純化后，與同樣經(jīng)Sal I和Not I雙酶切的pShuttle-CMV載體連接，連接產 物轉化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質粒， Sal I和Not I雙酶切鑒定，將陽性克隆質粒命名為pShuttle-CMV-DcR3-IRES-GAD65。5、重組腺病毒載體pAd_DcR3/GAD65的構建將pShuttle-CMV-DcR3-IRES_GAD65 載體用 Pme I 酶切線性化，再與 pAdEasy-1 載 體同時電轉化大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細胞，進行胞內同源重組，用含有卡那霉素的LB平板 培養(yǎng)，挑取較小菌落，用含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，提取質粒，Pac I酶切鑒 定，將陽性質粒命名為pAd-DcR3/GAD65。6、重組腺病毒載體pAd_DcR3/GAD65的包裝將人胚胎腎293細胞以40% 60%的細胞密度接種至T_25培養(yǎng)瓶中，待細胞生 長至30 % 50 %融合時棄去培養(yǎng)液，用Lipofectamine 2000試劑將pAd_DcR3/GAD65載體 轉染293細胞，通過顯微鏡觀察細胞病理改變，待出現(xiàn)明顯細胞病變效應時離心收集細胞， 細胞沉淀用PBS重懸后，反復凍融4次使細胞裂解，離心去除細胞碎片，收集含病毒的上清 液，即得Ad-DcR3/GAD65病毒原液；將病毒原液按1 10的比例重新感染293細胞，收集含 病毒的上清液，重復上述操作3次，得第四代重組腺病毒Ad-DcR3/GAD65。二、重組腺病毒Ad-DcR3/GAD65轉染樹突狀細胞疫苗的制備1、樹突狀細胞的分選取4周齡Balb/c小鼠，脫頸處死，用體積分數(shù)為75%的乙醇溶液浸泡5分鐘，無 菌條件下切開皮膚及皮下組織，分離小鼠股骨和脛骨，用濃度為0. Olmol/L的無菌PBS清洗 3 5次，剪斷股骨和脛骨兩端，用濃度為0. 01mol/L的無菌PBS反復沖洗骨髓腔，制成單 細胞懸液，1000r/min離心5分鐘去掉脂肪層，細胞用濃度為0. 01mol/L的無菌PBS重懸， 再緩慢加入等體積Percoll細胞分離液，3000r/min離心30分鐘，收集單核細胞，用濃度為 0. 01mol/L的無菌PBS洗滌2次，再用含血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，所得單細胞懸液接種于 T-25培養(yǎng)瓶內，并補充粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4 (IL-4)，置溫 度為37°C、C02氣體體積分數(shù)為5%和飽和濕度的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，隔日半量換液補充細胞因
8子，第7天收獲細胞，即得樹突狀細胞。2、重組腺病毒Ad_DcR3/GAD65轉染樹突狀細胞將樹突狀細胞以細胞濃度為1X106個/ml接種于6孔板，按感染復數(shù)(M0I)為100 加入第四代重組腺病毒Ad-DcR3/GAD65，感染后48小時收集細胞，用PBS洗滌并重懸，即得 Ad-DcR3/GAD65病毒轉染樹突狀細胞。Western Blot檢測分別超聲裂解Ad_DcR3/GAD65病毒轉染樹突狀細胞和空病毒 轉染樹突狀細胞，收集細胞總蛋白進行SDS-PAGE，電泳完畢后電轉印PVDF膜，洗膜，封閉， 加入兔抗人DcR3或GAD65多克隆抗體，37°C孵育1小時，洗膜，再加入羊抗兔IgG，37°C孵 育1小時，洗膜，顯色。結果見圖3，Ad-DcR3/GAD65病毒在樹突狀細胞中可以表達DcR3和 GAD65。三、重組腺病毒Ad_DcR3/GAD65轉染樹突狀細胞疫苗抗胰島移植排斥能力檢測取2月齡糖尿病易患性NOD小鼠，隨機分為兩組實驗組和對照組，實驗組尾靜脈 回輸Ad-DcR3/GAD65病毒轉染樹突狀細胞疫苗，連續(xù)回輸3次，每周1次，每次輸入1 X 106 個細胞；對照組正常飼養(yǎng)。1、淋巴細胞增殖能力檢測末次回輸后1周，斷頸處死兩組小鼠，無菌條件下取小鼠脾臟，用100目篩網(wǎng)碾 磨成細胞懸液，用常規(guī)聚蔗糖-泛影葡胺分層液梯度離心法分離獲得脾淋巴細胞，用含有 體積分數(shù)為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調整細胞濃度為1X106個/ml，接種至 96孔板，每孔100 iU，每組設3個復孔，每孔加入GAD65重組蛋白至終濃度為lmg/ml，置 溫度為37°C、0)2氣體體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)96小時，再每孔加入0. lml濃度為 1X10、Ci/L的3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)12小時，用PBS漂洗細胞3次， 甲醛固定10分鐘，再用溫度4°C預冷的體積分數(shù)為5%的三氯醋酸溶液漂洗3次，每孔加入 0. 5ml濃度為0. 3mol/L的NaOH溶液，60°C水浴反應30分鐘，冷卻至室溫，轉移入閃爍瓶中， 加入5ml閃爍液，用液體閃爍計數(shù)器計數(shù)每分鐘的閃爍次數(shù)(cpm)，測定DPM值(反映細胞 DNA合成速率)，重復測定3次。結果見圖4，實驗組小鼠淋巴細胞的cpm值為38000士3100，而對照組小鼠淋巴細 胞的cpm值為54000 士6500，證實Ad-DcR3/GAD65病毒轉染樹突狀細胞疫苗能夠有效降低淋 巴細胞的增殖能力。2、淋巴細胞分泌細胞因子能力檢測末次回輸后1周，斷頸處死兩組小鼠，無菌條件下取小鼠脾臟，用100目篩網(wǎng)碾磨 成細胞懸液，用常規(guī)聚蔗糖-泛影葡胺分層液梯度離心法分離獲得脾淋巴細胞，用含有體 積分數(shù)為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調整細胞濃度為1 X 106個/ml，接種至96孔 板，每孔100 u 1，每組設3個復孔，每孔加入GAD65重組蛋白至終濃度為lmg/ml，置溫度為 371、0)2氣體體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)96小時，用￡1^154法檢測白介素2(11^2)和 干擾素-Y (IFN-y)的含量。結果見圖5，實驗組小鼠淋巴細胞的IL-2和IFN-y含量分別為51. 3 士 5. 7pg/ ml和45. 6 士4. 9pg/ml,而對照組小鼠淋巴細胞的的IL-2和IFN- y含量分別為 114. 8 士 12. 3pg/ml和99. 3 士 102pg/ml，證實Ad_DcR3/GAD65病毒轉染樹突狀細胞疫苗能夠 有效降低淋巴細胞分泌細胞因子的能力。
3、NOD小鼠糖尿病發(fā)病率檢測監(jiān)測實驗組和對照組小鼠的血糖水平。結果見圖6，實驗組小鼠18周齡開始出現(xiàn)血糖異常，30周齡的糖尿病發(fā)病率為 30%，而對照組小鼠14周齡開始出現(xiàn)血糖異常，30周齡的糖尿病發(fā)病率高達80% ；證實 Ad-DcR3/GAD65病毒轉染樹突狀細胞疫苗能夠有效延遲NOD小鼠糖尿病的發(fā)病時間，并降 低糖尿病的發(fā)病率。4、移植胰島生存期檢測胰島細胞分離和純化將C57BL/6J小鼠頸椎脫臼處死后，用體積分數(shù)為75%的乙 醇溶液浸泡消毒，無菌條件下打開腹腔，暴露膽總管，在解剖顯微鏡下結扎膽胰管在十二指 腸的開口，沿膽總管逆行灌注Hank' s液(含有濃度為0. lg/L的膠原酶P和濃度為10mg/ L的DNase-I)，待胰腺膨脹后，立即摘除胰腺組織，置溫度4°C預冷的Hank' s液中清洗2 次，剪成0. 5 1mm3的小塊，溫度37°C振蕩消化10 15分鐘至成絮狀，立即加入溫度4°C 預冷的Hank' s液終止消化，用Hank' s液洗滌2次，細胞沉淀用Hank' s液重懸，再依 次加入質量分數(shù)為84%、67%、50%的Histopaque，1500g離心10分鐘，吸取84% 67% 和67% 50%層面的細胞沉淀，用Hank' s液洗滌2次，再用DMEM培養(yǎng)基(含有濃度為 5. 6mmol/L的葡萄糖、體積分數(shù)為10%的胎牛血清、濃度為100000U/L的青霉素和濃度為 100mg/L的鏈霉素)重懸，取樣進行胰島細胞計數(shù)。胰島細胞移植分別在實驗組和對照組N0D小鼠檢測到血糖異常后1周，將5X105 個C57BL/6J小鼠的胰島細胞移植至N0D小鼠的腹膜下，每天檢測小鼠血糖，當血糖水平恢 復到11. ImM時認為移植成功，考察兩組小鼠移植胰島的生存期。結果如圖7所示，實驗組小鼠移植胰島的平均生存期為11天，而對照組小鼠移植 胰島的平均生存期為4天，證實Ad-DcR3/GAD65病毒轉染樹突狀細胞疫苗能夠有效延長N0D 小鼠移植胰島的生存期。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管通過參 照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可 以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發(fā)明 的精神和范圍。序列表<110>中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學<120>DcR3和GAD65雙基因共表達重組腺病毒及其制備方法和應用<160>8<210>1<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物 F1<400>1
aatctgcagt cgcgagcggc cgcacaactt31<210>2<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物 Rl<400>2tacgaattcg tgcacaggga ggaagcgctc acg 39<210>3<211>903<212>DNA<213> 智人(homo sapiens)<400>3atgagggcgc tggaggggcc aggcctgtcg ctgctgtgcc tggtgttggc gctgcctgcc 60ctgctgccgg tgccggctgt acgcggagtg gcagaaacac ccacctaccc ctggcgggac 120gcagagacag gggagcggct ggtgtgcgcc cagtgccccc caggcacctt tgtgcagcgg 180ccgtgccgcc gagacagccc cacgacgtgt ggcccgtgtc caccgcgcca ctacacgcag 240ttctggaact acctggagcg ctgccgctac tgcaacgtcc tctgcgggga gcgtgaggag 300gaggcacggg cttgccacgc cacccacaac cgtgcctgcc gctgccgcac cggcttcttc 360gcgcacgctg gtttctgctt ggagcacgca tcgtgtccac ctggtgccgg cgtgattgcc 420ccgggcaccc ccagccagaa cacgcagtgc cagccgtgcc ccccaggcac cttctcagcc 480agcagctcca gctcagagca gtgccagccc caccgcaact gcacggccct gggcctggcc 540ctcaatgtgc caggctcttc ctcccatgac accctgtgca ccagctgcac tggcttcccc 600ctcagcacca gggtaccagg agctgaggag tgtgagcgtg ccgtcatcga ctttgtggct 660ttccaggaca tctccatcaa gaggctgcag cggctgctgc aggccctcga ggccccggag 720ggctggggtc cgacaccaag ggcgggccgc gcggccttgc agctgaagct gcgtcggcgg 780ctcacggagc tcctgggggc gcaggacggg gcgctgctgg tgcggctgct gcaggcgctg 840cgcgtggcca ggatgcccgg gctggagcgg agcgtccgtg agcgcttcct ccctgtgcac 900tga903<210>4<211>24<212>DNA<213>人工 序列<220><223> 引物 F2<400>4gatcggatcc taccgtagag gccc24<210>5
<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物 R2<400>5acgcgtcgac aatatttaga acaggttcc29<210>6<211>1758<212>DNA<213> 智人(homo sapiens)<400>6
0136]atggcatctccgggctctggcttttggtctttcgggtcgg aagatggctctggggattcc600137]gagaatcccggcacagcgcgagcctggtgccaagtggctcagaagttcacgggcggcatc1200138]ggaaacaaactgtgcgccctgctctacggagacgccgagaagccggcggagagcggcggg1800139]agccaacccccgcgggccgccgcccggaaggccgcctgcgcctgcgaccagaagccctgc2400140]agctgctccaaagtggatgtcaactacgcgtttctccatgcaacagacctgctgccggcg3000141]tgtgatggagaaaggcccactttggcgtttctgcaagatgttatgaacattttacttcag3600142]tatgtggtgaaaagtttcgatagatcaaccaaagtgattg atttccattatcctaatgag4200143]cttctccaagaatataattgggaattggcagaccaaccacaaaatttggaggaaattttg4800144]atgcattgccaaacaactctaaaatatgca attaaaacagggcatcctag atacttcaat5400145]caactttctactggtttggatatggttggattagcagcag actggctgacatcaacagca6000146]￡1 ￡11 ￡1C t ￡1 ￡1C ￡1tgttcacctatgaaattgctccagtatttgtgcttttgga atatgtcaca6600147]ctaaagaaaatgagagaaatcattggctggccagggggctctggcgatgggatattttct7200148]cccggtggcgccatatctaacatgtatgccatgatgatcgcacgctttaagatgttccca7800149]gaagtcaaggagaaaggaatggctgctcttcccaggctcattgccttcacgtctgaacat8400150]agtcatttttctctcaagaagggagctgcagccttagggattggaacagacagcgtgatt9000151]ctgattaaatgtgatgagagagggaaaatg attccatctg atcttgaaag aaggattctt9600152]gaagccaaacagaaagggtttgttcctttcctcgtgagtgccacagctgg aaccaccgtg10200153]tacggagcatttgaccccctcttagctgtcgctgacatttgcaaaaagtataagatctgg10800154]atgcatgtggatgcagcttggggtgggggattactgatgtcccgaaaacacaagtggaaa11400155]ctgagtggcgtggagagggccaactctgtg acgtggaatccacacaagatgatgggagtc12000156]cctttgcagtgctctgctctcctggttagagaagagggattgatgcagaattgcaaccaa12600157]atgcatgcctcctacctctttcagcaagataaacattatg acctgtcctatgacactgga13200158]gacaaggccttacagtgcggacgccacgttgatgtttttaaactatggctgatgtggagg13800159]gcaaaggggactaccgggtttgaagcgcatgttgataaatgtttggagttggcagagtat14400160]ttatacaacatcataaaaaaccgagaaggatatgagatggtgtttgatgggaagcctcag15000161]cacacaaatgtctgcttctggtacattcctccaagcttgcgtactctgga agacaatgaa15600162]gagagaatgagtcgcctctcgaaggtggctccagtgatta aagccagaatgatggagtat1620
ggaaccacaa tggtcagctaccaacccttgggagacaaggtcaatttcttccgcatggtc 1680
atctcaaacc cagcggcaactcaccaagacattgacttcctgattgaagaaatagaacgc 1740
cttggacaag atttataa1758
<210>7
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物 F3
<400>7
acgcgtcgac tcgcgagcggccgcacaacttt32
<210>8
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物 R3
<400>8
agaatgcggc cgcaatatttagaacaggttcc3權利要求
DcR3和GAD65雙基因共表達重組腺病毒，其特征在于所述重組腺病毒基因組中包含一個DcR3和GAD65雙基因表達盒，所述DcR3和GAD65雙基因表達盒由上游至下游依次包含CMV啟動子、DcR3全長編碼基因、終止子、內部核糖體進入位點IRES、GAD65全長編碼基因和終止子。
2.權利要求1所述DcR3和GAD65雙基因共表達重組腺病毒的制備方法，其特征在于 包括以下步驟a、RT-PCR擴增 DcR3 全長 cDNA ；b、RT-PCR擴增 GAD65 全長 cDNA ；C、將步驟a所得DcR3全長cDNA插入pStar載體的IRES上游，步驟b所得GAD65全長 cDNA插入pStar載體的IRES下游，得重組載體pStar-DcR3-IRES_GAD65 ；d、以步驟c 所得重組載體 pStar-DcR3-IRES-GAD65 為模板，PCR 擴增 DcR3_IRES_GAD65 片段并更換該片段兩端的酶切位點；e、將步驟d所得DcR3-IRES-GAD65片段插入腺病毒穿梭載體pShuttle_CMV的CMV啟 動子下游，得重組腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-DcR3-IRES-GAD65 ；f、將步驟e所得重組腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-DcR3-IRES-GAD65與腺病毒骨架 載體pAdEasy-Ι在大腸桿菌BJ5183中進行胞內同源重組，得重組腺病毒載體pAd_DCR3/ GAD65 ；g、將重組腺病毒載體pAd-DcR3/GAD65在293細胞中包裝成重組腺病毒Ad_DcR3/ GAD65。
3.根據(jù)權利要求2所述DcR3和GAD65雙基因共表達重組腺病毒的制備方法，其特征 在于步驟a的具體方法為提取人肝組織總RNA，逆轉錄得到總cDNA，再以該總cDNA為模 板，以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示序列為上下游引物，PCR擴增兩端分別帶有Pst I 和EcoR I酶切位點的DcR3全長cDNA，PCR循環(huán)條件參數(shù)為94°C預變性5分鐘；然后94°C 變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘；PCR產 物經(jīng)純化后克隆入pT-Easy載體，得重組載體pT_DcR3。
4.根據(jù)權利要求3所述DcR3和GAD65雙基因共表達重組腺病毒的制備方法，其特征在 于步驟b的具體方法為提取人胰腺組織總RNA，逆轉錄得到總cDNA，再以該總cDNA為模 板，以SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示序列為上下游引物，PCR擴增兩端分別帶有BamH I 和Sal I酶切位點的GAD65全長cDNA，PCR循環(huán)條件參數(shù)為94°C預變性5分鐘；然后94°C 變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘；PCR產 物經(jīng)純化后克隆入pT-Easy載體，得重組載體pT_GAD65。
5.根據(jù)權利要求4所述DcR3和GAD65雙基因共表達重組腺病毒的制備方法，其特 征在于步驟c的具體方法為自重組載體pT-DcR3中用Pst I和EcoR I雙酶切出DcR3 全長cDNA，經(jīng)純化后與同樣用Pst I和EcoR I雙酶切的pStar載體連接，得重組載體 pStar-DcR3 ；再自重組載體pT_GAD65中用BamH I和Sal I雙酶切出GAD65全長cDNA， 經(jīng)純化后與同樣用BamH I和Sal I雙酶切的重組載體pStar-DcR3連接，得重組載體 pStar-DcR3-IRES-GAD65。
6.根據(jù)權利要求5所述DcR3和GAD65雙基因共表達重組腺病毒的制備方法，其特征在 于步驟d的具體方法為以重組載體pStar-DcR3-IRES-GAD65為模板，以SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示序列為上下游引物進行PCR，將DcR3-IRES-GAD65片段兩端的酶切位點更 換為Sal I酶切位點和Not I酶切位點，PCR條件為94°C預變性5分鐘；然后94°C變性50 秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘；PCR產物經(jīng)純化 后克隆入pT-Easy載體，得重組載體pT-DcR3-IRES_GAD65。
7.根據(jù)權利要求6所述DcR3和GAD65雙基因共表達重組腺病毒的制備方法，其特征 在于步驟e的具體方法為自重組載體pT-DcR3-IRES-GAD65中用Sal I和Not I雙酶 切出DcR3-IRES-GAD65片段，經(jīng)純化后與同樣用Sal I和Not I雙酶切的腺病毒穿梭載體 pShuttIe-CMV 連接，得重組腺病毒穿梭載體 pShuttle-CMV-DcR3-IRES_GAD65。
8.根據(jù)權利要求7所述DcR3和GAD65雙基因共表達重組腺病毒的制備方法，其特征 在于步驟f的具體方法為將重組腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-DcR3-IRES-GAD65用 Pme I酶切線性化，再與腺病毒骨架載體pAdEasy-Ι同時電轉化大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細 胞，進行胞內同源重組，得重組腺病毒載體pAd-DcR3/GAD65。
9.根據(jù)權利要求8所述DcR3和GAD65雙基因共表達重組腺病毒的制備方法，其特征 在于步驟g的具體方法為將人胚胎腎293細胞以40% 60%的細胞密度接種至培養(yǎng) 瓶中，待細胞生長至30 % 50 %融合時，采用Lipofectamine 2000試劑將重組腺病毒載 體pAd-DcR3/GAD65轉染293細胞，待細胞出現(xiàn)明顯病變時離心收集細胞，用磷酸鹽緩沖液 重懸后，反復凍融使細胞裂解，離心去除細胞碎片，收集含病毒的上清液，即得重組腺病毒 Ad-DcR3/GAD65。
10.權利要求1所述DcR3和GAD65雙基因共表達重組腺病毒在制備抗胰島移植排斥的 樹突狀細胞疫苗中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種DcR3和GAD65雙基因共表達重組腺病毒及其制備方法和應用，該重組腺病毒基因組中包含一個DcR3和GAD65雙基因表達盒，該表達盒由上游至下游依次包含CMV啟動子、DcR3全長編碼基因、終止子、內部核糖體進入位點IRES、GAD65全長編碼基因和終止子；該重組腺病毒的制備方法簡單；將其體外轉染樹突狀細胞再回輸體內，能夠誘導特異性T細胞耐受，有效抑制胰島β細胞的破壞，并延長移植胰島的生存期，可用于制備抗胰島移植排斥的樹突狀細胞疫苗，在1型糖尿病治療領域具有良好的開發(fā)應用前景。
文檔編號C12N15/85GK101875920SQ20091025108
公開日2010年11月3日 申請日期2009年12月29日 優(yōu)先權日2009年12月29日
發(fā)明者吳玉章, 楊曌 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學