專利名稱：編碼新蛋白水解酶的新基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新鑒定的多核苷酸序列，該序列包含編碼從黑曲霉(Aspergillus niger)中分離的新蛋白酶的基因。本發(fā)明描述了新基因的全長(zhǎng)核苷酸序列、包含新蛋白酶 的全長(zhǎng)編碼序列的cDNA序列及全長(zhǎng)功能蛋白質(zhì)的氨基酸序列及其片段和變體。本發(fā)明也 涉及在工業(yè)過程中使用這些酶的方法和診斷真菌感染的方法。同樣包括在本發(fā)明中的是用 根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和在其中根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶被遺傳修飾以增強(qiáng)或減 少其活性和/或表達(dá)水平的細(xì)胞。
背景技術(shù)：
蛋白水解酶可將蛋白質(zhì)視為由以肽鍵連接的氨基酸構(gòu)建塊組成的雜聚物。蛋白質(zhì)中的重復(fù)單 位是具有氨基基團(tuán)和羧基基團(tuán)的中心α碳原子。除甘氨酸之外，所謂的氨基酸側(cè)鏈替代了 兩個(gè)剩余的α碳?xì)湓又械囊粋€(gè)。氨基酸側(cè)鏈?zhǔn)沟弥行摩撂荚硬粚?duì)稱。通常，在蛋白 質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的是氨基酸的L-對(duì)映異構(gòu)體。下面的術(shù)語描述了多種類型的多聚氨基酸。肽是 具有確定序列的氨基酸殘基短鏈。盡管對(duì)于殘基的數(shù)目實(shí)際上沒有最大值，但該術(shù)語通常 指示其性質(zhì)主要由其氨基酸組成確定且不具有固定的三維構(gòu)象的鏈。術(shù)語多肽通常用于更 長(zhǎng)的鏈、通常具有確定的序列和長(zhǎng)度且原則上具有適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)度以折疊為三維結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì) 指天然存在且展示確定三維結(jié)構(gòu)的多肽。倘若蛋白質(zhì)主要發(fā)揮催化化學(xué)反應(yīng)的功能，那么 它通常被稱為酶。蛋白酶是催化(多)肽和蛋白質(zhì)中肽鍵水解的酶。在生理學(xué)條件下，蛋白酶催化肽鍵的水解。國際生物化學(xué)和分子生物學(xué)協(xié)會(huì) (International Union of Biochemistry andMolecular Biology) (1984)推薦對(duì)于肽鍵 水解酶亞型(亞類E.C3.4.)使用術(shù)語肽酶。術(shù)語蛋白酶與肽水解酶與肽酶是同義的且也 可用于此處。蛋白酶包含2類酶內(nèi)肽酶和外肽酶，它們分別在蛋白質(zhì)內(nèi)的位點(diǎn)切割肽鍵 和連續(xù)地從N或C-末端去除氨基酸。蛋白酶用作內(nèi)肽酶的同義詞。肽鍵可發(fā)生于2-、3_、 4-肽、肽、多肽、或蛋白質(zhì)的情況下。通常，天然肽和多肽的氨基酸組成包含20個(gè)不同的氨 基酸，該氨基酸展示L-構(gòu)型(除不具有手性中心的甘氨酸之外)。然而蛋白酶的蛋白水解 活性不局限于僅含有20個(gè)天然氨基酸的肽。在所謂的非天然氨基酸之間的肽鍵及在修飾 的氨基酸或氨基酸類似物之間的肽鍵也可被切割。一些蛋白酶的確接受某些位置的氨基酸 的D-構(gòu)象。通常，蛋白酶顯著的立體選擇性使得它們?cè)诨瘜W(xué)分解的過程中是非常有用的。 許多蛋白酶展示有趣的副活性，如酯酶活性、巰基酯酶活性和(脫)酰胺酶活性。這些副活 性通常不僅局限于氨基酸，且可證實(shí)為在精細(xì)化學(xué)藥品領(lǐng)域的生物轉(zhuǎn)化中是非常有用的。絲狀真菌、真核微生物具有特殊的重要性有許多原因。如果不適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行控制， 那么蛋白質(zhì)中肽鍵水解切割的基本過程代價(jià)很大，且對(duì)生物潛在有害。對(duì)蛋白水解作用的 所需限制是通過蛋白酶的特異性、通過使蛋白酶和底物在細(xì)胞內(nèi)的區(qū)室化、通過對(duì)底物進(jìn) 行修飾以使得其能被個(gè)別的蛋白酶識(shí)別、通過由酶原活化和特定抑制劑存在或不存在的調(diào) 節(jié)、以及通過對(duì)蛋白酶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)而實(shí)現(xiàn)。在真菌中，蛋白酶也涉及其他基本的細(xì)胞過 程，該過程包括細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)更新、加工、轉(zhuǎn)位、孢子形成、萌發(fā)和分化。事實(shí)上，已將構(gòu)巢曲
5霉(Aspergillus nidulans)和粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)用作分析生理學(xué)和發(fā)育 過程范圍的分子基礎(chǔ)的模式生物。它們的遺傳特性使得在確定的養(yǎng)分和培養(yǎng)條件下能夠直 接進(jìn)入生物化學(xué)和遺傳學(xué)研究。此外，已分離了大量使人、牲畜和農(nóng)作物致病的真菌，且已 認(rèn)為蛋白水解在它們的致病性(宿主侵入，在感染中對(duì)抗宿主的防御機(jī)制和/或營養(yǎng))中 起作用。蛋白酶也經(jīng)常用于實(shí)驗(yàn)、臨床和工業(yè)過程中；微生物和非微生物的蛋白酶兩者均廣 泛應(yīng)用于也可見食品工業(yè)(烘焙、釀造、干酪制造、肉類嫩化)、鞣革工業(yè)和生物去污劑的制 造中(Aimstrup，1980)。開發(fā)某些絲狀真菌，尤其是黑曲霉屬作為同源或異源蛋白質(zhì)兩者的 生產(chǎn)宿主的商業(yè)重要性最近使真菌蛋白酶的重要性恢復(fù)了(van Brimt，1986ab)。蛋白酶在 真菌的蛋白質(zhì)異源表達(dá)和同源過量表達(dá)中經(jīng)常引起問題。特別是，異源表達(dá)受同源蛋白酶 對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的蛋白水解降解的妨礙。這些商業(yè)利益導(dǎo)致對(duì)蛋白水解譜和蛋白酶缺陷品系構(gòu) 建的詳細(xì)研究，并改進(jìn)了有關(guān)這些生物中蛋白酶表達(dá)及調(diào)節(jié)的知識(shí)。隨后就很需要在絲狀 真菌中鑒定和消除新蛋白酶。微生物如真菌在大規(guī)模蛋白質(zhì)生產(chǎn)中特別有用。特別地當(dāng)這種蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng) 基中時(shí)。蛋白水解酶在這些生產(chǎn)過程中起作用。在一方面，通常具體的蛋白水解酶對(duì)于目 標(biāo)蛋白質(zhì)的正確加工和生產(chǎn)宿主的代謝健康是必需的。另一方面，蛋白水解降解可顯著減 少分泌的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。在分泌途徑中的不良折疊可導(dǎo)致被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶降解。這對(duì)生產(chǎn) 異源蛋白質(zhì)可能是一個(gè)特別的問題。蛋白水解過程的詳情并不完全已知，該過程負(fù)責(zé)降解 從真菌分泌過程中轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)。在真核生物中，細(xì)胞蛋白質(zhì)的降解是由蛋白酶體實(shí)現(xiàn)的， 并通常涉及對(duì)要降解的蛋白質(zhì)進(jìn)行泛素標(biāo)記。在真菌中蛋白酶體的和液泡蛋白酶也可能對(duì) 不良折疊的分泌蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白水解降解。該蛋白水解降解可能在胞質(zhì)中，但不可排除常 駐于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白酶。從生產(chǎn)宿主品系改進(jìn)的方面看，蛋白水解系統(tǒng)可為基因工程和生產(chǎn) 品系改進(jìn)的有趣目標(biāo)。蛋白酶基因的額外拷貝、某些蛋白酶的過量表達(dá)、轉(zhuǎn)錄控制的修飾及 使蛋白酶基因缺失的基因敲除程序可對(duì)給定蛋白酶的功能提供更詳細(xì)的認(rèn)識(shí)。為了改進(jìn)同 源及異源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，蛋白酶編碼基因的缺失是宿主品系改進(jìn)的有價(jià)值的策略。真核微生物蛋白酶已由North(1982)進(jìn)行了綜述。更近地，Suarez Rendueles和 Wolf (1988)已綜述了釀酒酵母(S. cerevisiae)蛋白酶及其功能。除對(duì)鍵的水解切割之外，蛋白酶也可應(yīng)用于鍵的形成中。這里的鍵不僅包括肽和 酰胺鍵也包括酯鍵。蛋白酶是催化特定鍵的切割還是形成的確首先依賴于該反應(yīng)的熱力 學(xué)。酶如蛋白酶不影響反應(yīng)平衡。該平衡依賴于反應(yīng)所發(fā)生的特別的條件。在生理學(xué)條件 下，反應(yīng)的熱力學(xué)由于產(chǎn)生的兼性離子在熱力學(xué)上非常穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)而有利于肽的水解。通 過應(yīng)用物理_化學(xué)原理以影響平衡，或者通過操縱反應(yīng)物和產(chǎn)物的濃度或特性，或者通過 利用酶反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，可能將蛋白酶用于肽鍵合成的目的。水混合有機(jī)溶劑的加入減 少了羧基成分的電離程度，借此增加了反應(yīng)可用的底物的濃度。經(jīng)常采用兩相系統(tǒng)、水模擬 物(water mimetics)、反向微團(tuán)(reverse micelles)、無水介質(zhì)或修飾的氨基和羧基基團(tuán) 以引起產(chǎn)物的沉淀來增加產(chǎn)量。當(dāng)具有正確性質(zhì)的蛋白酶可利用時(shí)，該蛋白酶在合成中的 應(yīng)用提供了實(shí)質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)。由于蛋白酶是立體選擇性及區(qū)域選擇性的，所以反應(yīng)物上的敏感 基團(tuán)通常不需保護(hù)，且反應(yīng)物不需為光學(xué)純的。由于酶促合成的條件是溫和的，所以可避免 不穩(wěn)定的反應(yīng)物或產(chǎn)物的外消旋化和分解。除氨基酸之間的鍵之外，其他展示伯氨基基團(tuán)、 巰基基團(tuán)或羧基基團(tuán)的化合物也可由適當(dāng)選擇的蛋白酶進(jìn)行連接。此外，酯、巰基酯和酰胺可由某些蛋白酶進(jìn)行合成。已顯示蛋白酶在單、二-和三-糖、核苷和核黃素的?；饔弥?展示區(qū)域選擇性。在有時(shí)的苛刻反應(yīng)條件下穩(wěn)定性的問題可由適當(dāng)?shù)闹苿﹣眍A(yù)防。膠囊化 和固定不僅穩(wěn)定了酶，而且使得從反應(yīng)培養(yǎng)基中回收和分離便利。廣泛的交聯(lián)、用醛進(jìn)行處 理或用某些多聚體如葡聚糖、聚乙二醇、聚亞胺(polyimines)覆蓋表面本質(zhì)上可延伸生物 催化劑的壽命。蛋白酶的天然作用傳統(tǒng)上，蛋白酶被視為降解酶，該酶能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)切割為小肽和/或氨基酸，且其 作用為消化養(yǎng)分蛋白質(zhì)或參與細(xì)胞蛋白質(zhì)的更新。此外，已顯示蛋白酶通過以有限蛋白水 解進(jìn)行選擇性修飾的機(jī)制也在廣泛的細(xì)胞過程中起關(guān)鍵的作用，并因而具有基本的調(diào)節(jié)功 能(Holzer和Tschensche 1979 ;Holzer和Heinrich，1980)。蛋白酶的特異性被認(rèn)為與其 生理學(xué)功能和其表達(dá)模式緊密相關(guān)。至于具體蛋白酶的功能，其定位經(jīng)常是非常重要的；例 如，許多液泡和周質(zhì)蛋白酶參與蛋白質(zhì)降解，而許多膜結(jié)合蛋白酶在蛋白質(zhì)加工中很重要 (Suarez Rendueles和Wolf，1988)。在許多細(xì)胞過程中的蛋白酶的不同作用可分為4個(gè)主 要的蛋白酶功能1)蛋白質(zhì)降解，2)翻譯后加工和特定蛋白質(zhì)的(失)活化，3)形態(tài)發(fā)生， 和4)發(fā)病機(jī)理。利用蛋白質(zhì)作為養(yǎng)分來源的生物中蛋白酶的明顯作用是對(duì)養(yǎng)分的水解。在真菌 中，這將包括由細(xì)胞外的廣泛特異性的蛋白酶在細(xì)胞外進(jìn)行的降解。蛋白質(zhì)降解對(duì)于細(xì)胞 蛋白質(zhì)的快速更新也重要，并使得細(xì)胞能夠去除異常蛋白質(zhì)及對(duì)于變化的生理學(xué)條件適應(yīng) 性改變其蛋白質(zhì)的補(bǔ)充。通常地，為了保護(hù)細(xì)胞免受除正確目標(biāo)蛋白質(zhì)之外的隨機(jī)降解，具 有相當(dāng)廣泛特異性的蛋白酶也應(yīng)進(jìn)行非常好的控制。與水解相反，多肽的合成在體內(nèi)通過ATP驅(qū)動(dòng)的過程在核糖體上發(fā)生。最后氨基 酸連接的序列由源自基因組的信息支配。該過程已知為翻譯。初級(jí)翻譯產(chǎn)物經(jīng)常比最終的 功能產(chǎn)物長(zhǎng)，且在翻譯后這種蛋白質(zhì)前體通常必需由蛋白酶進(jìn)一步加工。蛋白酶在這種前 體蛋白質(zhì)成熟以獲得最終的功能蛋白質(zhì)中起關(guān)鍵的作用。與完全受控制的蛋白質(zhì)修剪和重 構(gòu)形相反，蛋白酶也可為非常破壞性的，并可將多肽完全降解為肽和氨基酸。為了避免蛋白 水解活性在需要之前釋放，對(duì)蛋白酶進(jìn)行了廣泛的調(diào)控。許多蛋白酶是作為已知為酶原的 前體合成的，該前體當(dāng)需要時(shí)變?yōu)榛罨?。該活化顯著地總是通過蛋白水解而發(fā)生。除直 接涉及該過程之外，單個(gè)蛋白質(zhì)的選擇性活化和失活是眾所周知的由特定蛋白酶催化的現(xiàn) 象。有限蛋白水解的選擇性顯得更直接地存在于蛋白酶-底物的相互作用中。特異性 可源自僅識(shí)別特定氨基酸靶序列的蛋白水解酶。另一方面，它也可為“加工位點(diǎn)”在某些條 件如PH、離子強(qiáng)度或次級(jí)修飾下的選擇性暴露的結(jié)果，因而使得另外的非特異性蛋白酶催 化高度特異性的事件。液泡酶原由有限蛋白水解的活化給出了后一類型的例子。形態(tài)發(fā)生或分化可定義為受調(diào)控的一系列事件，該事件導(dǎo)致生物體從一個(gè)狀態(tài)改 變到另一個(gè)狀態(tài)。盡管在許多情況下不能確立蛋白酶和形態(tài)結(jié)果之間的直接關(guān)系，但現(xiàn)在 的證據(jù)認(rèn)為在真菌形態(tài)發(fā)生中有顯著的蛋白酶的參與；除觀察到分化中廣泛的蛋白質(zhì)更 新、孢子形成和孢子萌發(fā)之外，認(rèn)為蛋白酶直接參與正常過程，如菌絲尖端分枝和隔片形成 (Deshpande,1992)。曲霉屬物種特別是煙曲霉(A. fumigatus)和黃曲霉(A. flavus)可能是人和動(dòng)物中稱為曲霉病的許多疾病的病原體(Bodey和Vartivarian，1989)。已多次認(rèn)為蛋白 酶與煙曲霉和黃曲霉的毒性有關(guān)，其如同有許多研究將分泌的蛋白酶與細(xì)菌的毒性相聯(lián) 系。事實(shí)上，大多數(shù)曲霉感染的人的特征在于其主要由膠原蛋白和彈性蛋白構(gòu)成的肺實(shí) 質(zhì)被廣泛降解(Campbell等人，1994)。研究已集中于所分泌的蛋白酶在煙曲霉和黃曲霉 毒性中的假定作用上，該煙曲霉和黃曲霉是主要的人病原體，并已知具有彈性蛋白裂解活 性(elastinolytic)和膠原蛋白酶(collagenic)活性(Kolattukudy 等人，1993)。這些 彈性蛋白裂解(elastinolytic)活性在體外顯示與對(duì)小鼠的感染性相關(guān)(Kothary等人， 1984)。已知兩種分泌型蛋白酶由煙曲霉和黃曲霉生產(chǎn)，即堿性絲氨酸蛋白酶(ALP)和中性 金屬蛋白酶(MEP)。在煙曲霉中，將編碼這些蛋白酶的兩個(gè)基因進(jìn)行分離、特征記述和破壞 (Reicherd等人，1990 ；Tang等人，1992，1993 Jaton-Ogay 等人，1994)。然而，當(dāng)與野生型品 系相比時(shí)，alp mep雙突變體在致病性上不顯示差異。因此，可得出肯定結(jié)論認(rèn)為在體外鑒 定的分泌型煙曲霉蛋白酶對(duì)于組織侵入不是必須因子(Jaton Ogay等人，1994)。盡管煙曲 霉僅占空氣傳播的霉菌孢子的一小部分，但它是從肺和隔片中最經(jīng)常分離的真菌(Schmitt 等人，1991)。對(duì)真菌毒性的其他解釋可為支氣管中的條件(溫度和養(yǎng)分)有利于煙曲霉的 寄生生長(zhǎng)。結(jié)果，當(dāng)宿主的致病防御被免疫抑制處理和疾病如AIDS消弱時(shí)，侵入性曲霉病 則可為依照情況的事件。已知有4個(gè)主要的蛋白酶種類，且該種類以其活性位點(diǎn)的主要功能基團(tuán)來命名 ‘絲氨酸’、‘巰基’或‘半胱氨酸’、‘天冬氨酸’或‘羧基’和‘金屬’蛋白酶。對(duì)這些蛋白 酶的主要種類、次要種類和未分類的蛋白酶詳細(xì)的當(dāng)前綜述可見酶學(xué)方法(Methodsin Enzymology)的第 244 和 248 部分(A. J. Barrett ed, 1994 和 1995)。蛋白酶的特異性除蛋白酶的催化機(jī)制之外，蛋白水解酶的其他重要方面是蛋白酶的特異性。蛋白 酶的特異性顯示該蛋白酶可能水解哪一種底物。20個(gè)天然氨基酸提供了構(gòu)成肽的很多可能 性。例如用20個(gè)氨基酸人們可構(gòu)成400個(gè)二肽和800個(gè)不同的三肽等。關(guān)于更長(zhǎng)的肽，可 能的數(shù)目將變?yōu)閹缀鯚o限的。某些蛋白酶僅在非常特定的位置水解特別的序列。蛋白酶與 肽底物的相互作用可包含肽底物的1至10個(gè)氨基酸殘基。關(guān)于大的蛋白質(zhì)底物有甚至更 多的與蛋白酶相互作用的底物的殘基。然而，這可能包含在活性位點(diǎn)結(jié)合裂縫(cleft)之 外與蛋白酶殘基的較低特異性的相互作用。通常，特異性識(shí)別是限定于線形肽的，該肽在蛋 白酶的活性位點(diǎn)結(jié)合。描述底物與蛋白酶相互作用的命名法已由Schechter和Berger于1967年提出 (Biochem. Biophys. Res. Com.，1967，27，157-162)，且現(xiàn)在廣泛用于文獻(xiàn)中。在該系統(tǒng)中，認(rèn) 為多肽底物的氨基酸殘基在活性位點(diǎn)與所謂的亞位點(diǎn)(sub-sites)結(jié)合。按慣例，這些蛋 白酶上的亞位點(diǎn)被稱為S (代表亞位點(diǎn))，而相應(yīng)的氨基酸殘基被稱為P (代表肽)。將易裂 的鍵的N-末端側(cè)的氨基酸殘基編號(hào)為P3、P2、P1，且將那些C-末端側(cè)的氨基酸殘基編號(hào)為 P3’、P2’、P1’。Pl和ΡΓ是位于靠近易裂的鍵處的氨基酸殘基。然后可將切割位點(diǎn)周圍的 底物殘基編號(hào)為直到Ρ8。將與底物結(jié)合殘基互補(bǔ)的蛋白酶上相應(yīng)的亞位點(diǎn)編號(hào)為S3、S2、 Si、Si’、S2’、S3’等。肽結(jié)合位點(diǎn)中亞位點(diǎn)的優(yōu)選性確定了對(duì)在特別的位點(diǎn)切割某些特定 的氨基酸序列的蛋白酶的優(yōu)選性。底物的氨基酸序列應(yīng)該與由亞位點(diǎn)展示的優(yōu)選性一致。 對(duì)某些底物的特異性明顯依賴于對(duì)底物的結(jié)合親和力和隨后易裂的鍵水解速度兩者。因此，蛋白酶對(duì)某些底物的特異性通常由其kcat/Km比例顯示，該比例更好地已知為特異性 常數(shù)。在該特異性常數(shù)中，kcat代表轉(zhuǎn)換率，且Km是解離常數(shù)。除參與催化和結(jié)合的氨基酸殘基之外，蛋白酶含有許多其他的必要氨基酸殘基。 一些殘基在折疊中是關(guān)鍵的，一些殘基維持蛋白酶總的三維結(jié)構(gòu)，一些殘基可能涉及蛋白 水解活性的調(diào)節(jié)，且一些殘基可使蛋白酶定位于特別的位置。許多蛋白酶在活性位點(diǎn)之外 含有一個(gè)或多個(gè)金屬離子的結(jié)合位點(diǎn)。這些金屬離子經(jīng)常起使結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用。此外，分 泌的真核微生物蛋白酶可廣泛糖基化。N-和0-連接的糖基化兩者均有發(fā)生。糖基化可輔 助蛋白質(zhì)的折疊、可增加可溶性、防止聚集及穩(wěn)定成熟蛋白質(zhì)。此外，糖基化的程度可影響 分泌以及蛋白質(zhì)的水結(jié)合。蛋白水解活性的調(diào)節(jié)相當(dāng)數(shù)目的蛋白酶的蛋白水解活性受到廣泛調(diào)節(jié)以避免不利的蛋白水解損害。在 某些程度上，該調(diào)節(jié)發(fā)生于轉(zhuǎn)錄水平。例如在真菌中，分泌型蛋白酶基因的轉(zhuǎn)錄對(duì)于外部的 碳和氮源敏感，而編碼細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的基因卻不敏感。細(xì)胞外PH由真菌感覺，且一些基因 由PH調(diào)節(jié)。在該過程中，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物蛋白質(zhì)起關(guān)鍵的作用。這種調(diào)節(jié)物蛋白質(zhì)的蛋白水解 過程經(jīng)常是使調(diào)節(jié)物蛋白質(zhì)開啟或關(guān)閉的開關(guān)。將蛋白酶進(jìn)行分子內(nèi)及分子間調(diào)節(jié)。這意味著蛋白水解酶分子中的某些氨基酸對(duì) 于這種調(diào)節(jié)是必須的。蛋白酶一般以較大的已知為酶原的前體合成，該前體催化上無活性。 通常使得前體蛋白酶無活性的肽鏈在蛋白酶的氨基末端延伸。該前體更好地已知為前蛋白 質(zhì)(pro-protein)。許多由這種途徑加工的蛋白質(zhì)將從細(xì)胞分泌出，所以它們另外含有一 個(gè)信號(hào)序列(前序列)，從而完全的前體以前蛋白質(zhì)原形式合成。除使得蛋白酶無活性之 外，前肽對(duì)于介導(dǎo)有效的折疊經(jīng)常是必須的。蛋白酶的例子包括絲氨酸蛋白酶(α裂解蛋 白酶、枯草桿菌蛋白酶、aqualysin、激素原轉(zhuǎn)化酶)、巰基蛋白酶(組織蛋白酶L和克魯?shù)?白酶)、天冬氨酸蛋白酶(蛋白酶A和組織蛋白酶D)和金屬蛋白酶。此外，前肽可單獨(dú)地或 與信號(hào)肽一起在細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)中起作用。它可促進(jìn)與細(xì)胞侶伴蛋白的相互作用或它可促進(jìn)跨膜 的轉(zhuǎn)運(yùn)。前體前蛋白質(zhì)原的延伸的大小在短肽和多肽的范圍內(nèi)變動(dòng)有相當(dāng)程度的變化，其 中的多肽可作為自主折疊的單位而存在。特別地，經(jīng)常觀察到這些較大的延伸即使在蛋白 酶切割之后仍然是強(qiáng)的蛋白酶抑制劑。觀察到即使在切割之后，這種前肽也可輔助蛋白酶 的正確折疊?？烧J(rèn)為這種前肽發(fā)揮分子侶伴蛋白的功能，且這種前肽的分離或額外的共表 達(dá)對(duì)于蛋白酶的生產(chǎn)可能有利。在分泌到培養(yǎng)基中的蛋白酶和保持在細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶之間的調(diào)節(jié)水平上有實(shí)質(zhì) 的差異。分泌到培養(yǎng)基中的蛋白酶通常在活化后不再進(jìn)行控制，并因此通常在其由一個(gè)球 狀模塊組成的分子結(jié)構(gòu)上是相對(duì)簡(jiǎn)單的。對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白酶必須進(jìn)行連續(xù)的控制以避免對(duì)細(xì) 胞的損害。與分泌型蛋白酶的酶原相反，在更復(fù)雜的調(diào)節(jié)性蛋白酶中，可將非常大的多肽區(qū) 段插入在蛋白水解模塊的信號(hào)和酶原活化結(jié)構(gòu)域之間。結(jié)構(gòu)功能研究顯示這種非蛋白酶部 分可參與與宏觀結(jié)構(gòu)、膜、輔因子、底物、效應(yīng)物、抑制劑、離子的相互作用，這些相互作用調(diào) 節(jié)蛋白水解模塊或其(它們的)酶原的活性和活化。非蛋白水解模塊在大小和結(jié)構(gòu)上展示 顯著變化。許多模塊可不依賴于蛋白水解模塊而存在。因此可認(rèn)為這種模塊相應(yīng)于折疊自 主的獨(dú)立的結(jié)構(gòu)和功能單位。這種模塊組織的價(jià)值是新模塊的獲得可賦予受體蛋白質(zhì)新的 結(jié)合特異性，且可導(dǎo)致其活性、調(diào)節(jié)和靶向中的顯著變化。為了形成新的相互作用、調(diào)節(jié)、特異性和/或靶向可通過模塊改組，應(yīng)用分子生物學(xué)工具來充分利用模塊組織蛋白水解酶的 原理。盡管通常這種額外的模塊為N或C末端延伸，也已觀察到在催化結(jié)構(gòu)域的外部環(huán)中 的大段的插入。人們認(rèn)為同樣在這種情況下，蛋白酶的主要折疊仍然代表形成功能蛋白水 解實(shí)體的基本拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，且可將該插入看作是折疊在蛋白水解模塊表面的亞結(jié)構(gòu)。分子結(jié)構(gòu)原則上較大蛋白質(zhì)的模塊組織本質(zhì)上具有一般規(guī)律。特別在較大的多模塊構(gòu)架 中，一般的蛋白水解模塊顯示平均大小為100 400個(gè)氨基酸。這與分泌到培養(yǎng)基中的大 多數(shù)球狀蛋白水解酶的大小一致。如在上面所討論的，多肽模塊是多肽片段，該片段可折疊 并發(fā)揮獨(dú)立實(shí)體的功能。這種模塊的另一個(gè)術(shù)語是結(jié)構(gòu)域。然而結(jié)構(gòu)域在比模塊更廣的情 況中使用。如在此處所用的術(shù)語結(jié)構(gòu)域通常指多肽鏈的一部分，該多肽鏈在三維結(jié)構(gòu)中描 述了一般的折疊拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。在一個(gè)蛋白質(zhì)中，結(jié)構(gòu)域在多種程度上相互作用，但比結(jié)構(gòu)域中 的結(jié)構(gòu)元件的相互作用較不廣泛。其他的術(shù)語如亞結(jié)構(gòu)域和折疊單位也用于文獻(xiàn)中。同樣 地，可觀察到許多具有同一特別功能性的蛋白質(zhì)可具有相同的結(jié)構(gòu)域。這種結(jié)構(gòu)域可從顯 示某些序列模式的一級(jí)結(jié)構(gòu)中識(shí)別，該序列模式對(duì)于特別的結(jié)構(gòu)域是典型的。典型的例子 為單核苷酸結(jié)合折疊、纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、螺旋_轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合基元、鋅指、EF手、膜 錨形體。模塊指那些預(yù)期能夠折疊和自主發(fā)揮功能的結(jié)構(gòu)域。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道如何 從其他生物或物種中通過應(yīng)用對(duì)該結(jié)構(gòu)和同源序列通?？捎玫挠?jì)算機(jī)軟件在一級(jí)結(jié)構(gòu)中 鑒定特別的結(jié)構(gòu)域。盡管多模塊或多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)可呈現(xiàn)為一串珠子，但已經(jīng)觀察到實(shí)質(zhì)上更復(fù)雜的 結(jié)構(gòu)的裝配。在多種珠子位于相同多肽鏈上的情況下，這些珠子通常被稱為模塊或結(jié)構(gòu)域。 當(dāng)珠子不位于一個(gè)和相同的多肽鏈上，而是通過非共價(jià)相互作用形成集合時(shí)，那么將術(shù)語 亞基用于指該珠子。亞基可由一個(gè)或相同的基因轉(zhuǎn)錄，或者由不同的基因轉(zhuǎn)錄。該多模塊 蛋白質(zhì)在導(dǎo)致多個(gè)亞基的轉(zhuǎn)錄之后可變?yōu)榈鞍姿饧庸さ?。單?dú)的亞基可由多個(gè)結(jié)構(gòu)域組 成。一般地，100-300個(gè)氨基酸的較小的球狀蛋白質(zhì)通常僅由一個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。蛋白水解酶的分子分類通常蛋白酶根據(jù)其分子性質(zhì)或根據(jù)其功能性質(zhì)進(jìn)行分類。分子分類基于蛋白酶的 一級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)代表其氨基酸序列，該序列可源自相應(yīng)基因的核苷酸序列。廣 泛探索一級(jí)結(jié)構(gòu)中的相似性可注意到催化機(jī)制和其他性質(zhì)中的相似性，這甚至可延伸到功 能性質(zhì)。術(shù)語家族用于描述一組蛋白酶，這些蛋白酶基于其一級(jí)結(jié)構(gòu)間的相似性而顯示進(jìn) 化關(guān)系。人們認(rèn)為這樣一個(gè)家族的成員通過從相同的祖先通過趨異的進(jìn)化而出現(xiàn)。在一個(gè) 家族中，基于序列更精細(xì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)比較進(jìn)一步劃分出了亞家族。根據(jù)三維折疊的分類蛋 白酶可包含二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。通常，二級(jí)結(jié)構(gòu)上的分類局限于二級(jí)結(jié)構(gòu)元件 的含量和總方向。三級(jí)結(jié)構(gòu)的相似性已導(dǎo)致對(duì)超家族或特異集團(tuán)的識(shí)別。超家族或特異集 團(tuán)認(rèn)為是具有共同祖先的一組家族，這是因?yàn)樗鼈兌硷@示共同的3-維折疊。通常，三級(jí)結(jié) 構(gòu)比一級(jí)結(jié)構(gòu)更保守。結(jié)果，一級(jí)結(jié)構(gòu)的相似性不總反映相似的功能性質(zhì)。事實(shí)上，功能性 質(zhì)可基本地趨異從而導(dǎo)致有趣的新性質(zhì)。目前四級(jí)結(jié)構(gòu)尚未用于對(duì)多種蛋白酶進(jìn)行分類。 這可能是由于結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫對(duì)于簡(jiǎn)單的球狀蛋白質(zhì)的偏愛。進(jìn)行活化、調(diào)節(jié)或復(fù)雜反應(yīng)級(jí)聯(lián) 的許多蛋白水解系統(tǒng)可能由多個(gè)結(jié)構(gòu)域或亞基組成。這種蛋白酶系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組織中的一般 規(guī)律可導(dǎo)致新型的分類。
根據(jù)特異性的分類在不存在序列信息時(shí)，已將蛋白酶進(jìn)行了多種類型的功能分類。參考所催化的 反應(yīng)對(duì)酶進(jìn)行的分類和命名是酶命名法中的一般原則。該方法也是對(duì)酶的EC編號(hào)中 (酶命名法(EnzymeNomenclature)，1992Academic Press, Orlando)的根本原則。在酶 命名法(Enzyme Nomenclature) 1992中可識(shí)別兩類蛋白酶(EC3. 4)，即那些外肽酶(EC 3. 4. 11-19)和那些內(nèi)肽酶(EC 3. 4. 21-24，3. 4. 99)。內(nèi)肽酶在遠(yuǎn)離末端的肽鏈內(nèi)部區(qū)域切 割肽鍵。外肽酶僅從肽鏈的末端切割殘基。在N-末端作用的外肽酶可釋放一個(gè)氨基酸殘 基、一個(gè)二肽或一個(gè)三肽，并各自被稱為氨基肽酶(EC3. 4. 11)、二肽基肽酶(EC 3. 4. 14)和 三肽基肽酶(EC 3.3.14)。從羧基末端開始肽加工釋放一個(gè)氨基酸的蛋白酶被稱為羧肽酶 (EC3. 4. 16-18)。肽基二肽酶(EC 3. 4. 15)從羧基末端去除一個(gè)二肽。外-和內(nèi)-肽酶成 為一體則為二肽酶(EC 3.4. 13)，它在其氨基酸半分子中僅特定地切割二肽。ω肽酶(EC 3. 4. 19)去除替代、環(huán)化或由異肽鍵連接的末端殘基。除了蛋白酶切割肽鏈的位置之外，對(duì)于每一個(gè)類型的蛋白酶，可基于底物中優(yōu)選 的氨基酸殘基的特性的進(jìn)一步的區(qū)分。通常人們可區(qū)分具有廣泛的、中等的和狹窄的特異 性的蛋白酶。一些蛋白酶簡(jiǎn)單地以它們水解的特定蛋白質(zhì)或多肽而命名，如角蛋白酶、膠原 酶、彈性蛋白酶。狹窄的特異性可約束為分別去除或切割的一個(gè)特別的氨基酸或一個(gè)特別 的序列。當(dāng)?shù)鞍酌笇?duì)Pi或ΡΓ位置的一個(gè)氨基酸顯示特別的優(yōu)選性時(shí)，該氨基酸的名字可 為限定者(qualifier)。例如，脯氨酰氨肽酶從肽的氨基末端去除脯氨酸(脯氨酸是Pl殘 基)。當(dāng)切割了脯氨酸的亞氨基側(cè)的鍵時(shí)使用了 X-Pro或脯氨酸(脯氨酸是ΡΓ殘基)，如 脯氨酸羧肽酶從羧基末端去除脯氨酸。脯氨酰內(nèi)肽酶(或Pro-Χ)在脯氨酸后面進(jìn)行切割， 而脯氨酸內(nèi)肽酶(X-Pro)在脯氨酸前面進(jìn)行切割。易裂的肽鍵前面的氨基酸殘基指使羧基 基團(tuán)對(duì)肽鍵有貢獻(xiàn)的氨基酸殘基。易裂的肽鍵后面的氨基酸殘基指使氨基基團(tuán)對(duì)肽鍵有貢 獻(xiàn)的氨基酸殘基。根據(jù)通常的慣例，氨基酸鏈為從氨基末端(起始)到羧基末端(終止) 并從而進(jìn)行編號(hào)。內(nèi)切蛋白酶對(duì)于Pl和ΡΓ位置的特別的氨基酸也顯示明顯的優(yōu)選性，如 甘氨酰內(nèi)肽酶、肽酰賴氨酸內(nèi)肽酶、谷氨酰內(nèi)肽酶。此外蛋白酶可對(duì)共享某些類似之處的某 組氨基酸顯示優(yōu)選性。這樣一組優(yōu)選的氨基酸可包含疏水氨基酸、僅僅體積大的疏水氨基 酸、小的疏水或僅為小的氨基酸、大的正電荷的氨基酸等。除對(duì)Pl和ΡΓ殘基的優(yōu)選性之 外，由蛋白酶上其他亞位點(diǎn)優(yōu)選的殘基也存在特別的優(yōu)選或排除。這些多重優(yōu)選可導(dǎo)致僅 對(duì)那些同時(shí)可滿足多重結(jié)合需要的序列非常特異性的蛋白酶。通常應(yīng)該認(rèn)識(shí)到蛋白酶是相 當(dāng)混雜的酶。即使非常特異性的蛋白酶也可能切割不遵從通常觀察的該蛋白酶的優(yōu)選性的 肽。此外，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到環(huán)境條件如PH、溫度、離子強(qiáng)度、水活性、是否存在溶劑、競(jìng)爭(zhēng)性底物或 抑制劑這些都可影響蛋白酶的優(yōu)選性。環(huán)境條件不僅影響蛋白酶，而且影響蛋白質(zhì)底物呈 現(xiàn)給蛋白酶的途徑。以催化機(jī)制分類。蛋白酶可在其催化機(jī)制的基礎(chǔ)上進(jìn)行細(xì)分。需知對(duì)于上述分類所基于的每一種 催化機(jī)制，特異性都導(dǎo)致對(duì)每一類機(jī)制的進(jìn)一步細(xì)分。已知有4個(gè)主要的蛋白酶種類，并 通過其活性位點(diǎn)的主要功能基團(tuán)進(jìn)行命名絲氨酸蛋白酶(EC 3. 4. 21內(nèi)肽酶，EC 3. 4. 16 羧肽酶)、巰基或半胱氨酸蛋白酶(EC 3. 4. 22內(nèi)肽酶，EC 3. 4. 18羧肽酶)、羧基或天冬 氨酸蛋白酶(EC 3.4.23內(nèi)肽酶)和金屬蛋白酶(EC 3.4.24內(nèi)肽酶，EC 3. 4. 18羧肽
11酶)。對(duì)蛋白酶每一個(gè)催化類型的成員都有特有的抑制劑。這些小的抑制劑不可逆地修 飾蛋白酶活性位點(diǎn)的氨基酸殘基。例如，絲氨酸蛋白酶被與活性絲氨酸反應(yīng)的苯甲基磺酰 氯(PMSF)和二異丙基氟磷酸(DFP)失活，然而氯甲基酮(chloromethylketone)衍生物 與催化三聯(lián)體的組氨酸進(jìn)行反應(yīng)。磷酰二肽和1，10 二氮雜菲一般抑制金屬蛋白酶。由 胃蛋白酶抑制通常顯示為天冬氨酸蛋白酶。E64特異性地抑制巰基蛋白酶。氨肽酶抑制 劑和苯丁抑制素抑制多種氨肽酶。即使在一個(gè)催化種類中也觀察到了蛋白酶對(duì)抑制劑的 易感性的相當(dāng)變化。在某種程度上，這可與蛋白酶的特異性相關(guān)。在結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)防止 基于機(jī)制的抑制劑接近催化位點(diǎn)的情況下，這種蛋白酶從抑制中逃脫，且阻止了對(duì)基于抑 制作用的機(jī)制類型的鑒定。例如胰凝乳蛋白酶抑制劑是具有胰凝乳蛋白酶樣活性的絲氨 酸蛋白酶的有力的抑制劑，彈性蛋白酶抑制劑抑制彈性蛋白酶如絲氨酸蛋白酶而不與胰 蛋白酶或胰凝乳蛋白酶反應(yīng)，4酰胺PMSF(APMSF)僅抑制具有胰蛋白酶樣特異性的絲氨酸 蛋白酶。對(duì)抑制劑在蛋白酶分類中用途的廣泛說明包括Barret和Salvesen，蛋白酶抑 齊Ll (Proteinase Inhibitors), Elsevier Amstardam，1986 ;Bond 禾口 Beynon (eds)，蛋白 7jC解酶，一種實(shí)際的方法(Proteolytic Enzymes, A Practical Approach), IRL Press, Oxford，1989 ；酶學(xué)方法(Methods in Enzymology), eds E. J. Barret，1994年 244卷和 1995 年248卷；Ε. Shaw，半胱氨酰蛋白酶及其選擇性失活(Cysteinyl proteinase and their selectiveinactivation), Adv Enzymo1. 63 :271_347(1990)。根據(jù)最適作用條件分類蛋白酶的催化機(jī)制和其構(gòu)象完整性的需要主要地決定了該蛋白酶可在何種條件 下使用。在應(yīng)用條件下發(fā)現(xiàn)最適作用的蛋白酶是一個(gè)主要的挑戰(zhàn)。通常蛋白酶必須作用的 條件不是最適的，且的確代表了具體應(yīng)用的理想條件和蛋白酶的最適條件之間的折中。除 蛋白酶的特別性質(zhì)之外，應(yīng)認(rèn)識(shí)到蛋白質(zhì)底物的呈遞也依賴于條件，并同樣也確定了何種 條件對(duì)于蛋白水解最有效。與應(yīng)用有關(guān)的酶的規(guī)格包含如PH依賴性、溫度依賴性、對(duì)金屬 離子的靈敏度或依賴性、離子強(qiáng)度、鹽濃度、溶劑相容性。主要重要性的另一個(gè)因素是蛋白 酶的特異性活性。蛋白酶的特異性活性越高，特定的轉(zhuǎn)變所需酶越少。較低的酶需要意味 著較低的成本和較低的蛋白質(zhì)污染水平。pH是確定應(yīng)用中蛋白酶性能的一個(gè)主要的參數(shù)。因此，pH依賴性是分類蛋白酶的 重要參數(shù)。認(rèn)識(shí)到的主要類群為酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和高堿性蛋白酶。最 適的PH僅與蛋白水解機(jī)制匹配一定程度，如天冬氨酸蛋白酶經(jīng)常在酸性時(shí)顯示最適值，金 屬蛋白酶和巰基蛋白酶經(jīng)常在中性PH到微堿性時(shí)最適地發(fā)揮，絲氨酸蛋白酶主要在堿性 和高堿性區(qū)域?yàn)榛钚缘?。?duì)于每一個(gè)種類均已知有例外。此外，系統(tǒng)的總的水活性起作用。 蛋白酶的PH最適值定義為一個(gè)pH范圍，在該范圍內(nèi)，蛋白酶在特別的條件下的特別環(huán)境中 對(duì)大多數(shù)其底物展示最適的水解速率。該范圍可為狹窄的，如一個(gè)PH單位，以及相當(dāng)寬的 3-4個(gè)pH單位。通常pH最適值也依賴于蛋白質(zhì)底物的特性。轉(zhuǎn)換率及特異性兩者可作為 PH的函數(shù)而變化。對(duì)于確定的功效，可以在遠(yuǎn)離其最適值時(shí)使用蛋白酶，因?yàn)椴幌胍碾牡?生產(chǎn)被避免了。不想要的肽可為如非常短的肽或?qū)е驴辔兜碾?。此外，更狹窄的特異性可 為選擇條件的原因，該條件在關(guān)于轉(zhuǎn)化率上偏離最適的條件。依賴于PH，特異性可為狹窄 的，如僅在一個(gè)特別的氨基酸前或后的一個(gè)特別的位置切割肽鏈，或者是較寬的，如在多個(gè) 位置切割肽鏈或在更多不同類型氨基酸的前或后進(jìn)行切割。事實(shí)上，PH依賴性可為在應(yīng)用
12中調(diào)節(jié)蛋白水解活性的重要工具。在PH在過程中變化的情況下，蛋白水解可自發(fā)地停止， 而無需進(jìn)一步處理以使蛋白酶失活。在一些情況下，蛋白水解本身可為PH變化的驅(qū)動(dòng)物。對(duì)蛋白酶的應(yīng)用非常關(guān)鍵的是其處理和操作的穩(wěn)定性。由于蛋白酶穩(wěn)定性受工 作溫度強(qiáng)烈影響，所以通常也將穩(wěn)定性稱為熱穩(wěn)定性。通常蛋白酶的穩(wěn)定性顯示在多長(zhǎng)時(shí) 間內(nèi)蛋白酶在特別的條件下保持其蛋白水解活性。特別的條件可包含發(fā)酵條件、在酶的分 離和下游加工中的條件、貯藏條件、制劑和操作或應(yīng)用條件。當(dāng)特別的條件包含升高的溫度 時(shí)，穩(wěn)定性通常指熱穩(wěn)定性。除酶失活的一般原因如化學(xué)修飾、解折疊、聚集等之外，蛋白酶 的主要問題是它們易于進(jìn)行自降解。尤其對(duì)于蛋白酶的利用，溫度最適值是蛋白酶分類的 有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。盡管有不同的定義，但商業(yè)上最有用的定義是蛋白酶在某些應(yīng)用中最有效的溫 度或溫度范圍。蛋白酶生產(chǎn)力是穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)換率兩者的函數(shù)。在此升高的溫度通常將增加 轉(zhuǎn)換率，快速的失活將抵消轉(zhuǎn)換率的增加，并最終導(dǎo)致低的生產(chǎn)力。在給定過程的條件中蛋 白酶的構(gòu)象穩(wěn)定性將確定其操作溫度最大值。蛋白酶放松其活性構(gòu)象時(shí)的溫度即顯示為解 折疊或熔點(diǎn)，可根據(jù)多種方法確定，如NMR、圓二色性、光譜學(xué)、差異掃描量熱器等。對(duì)于蛋白 酶，解折疊通常伴隨自降解速率的極大增加。在需要低溫的應(yīng)用中，蛋白酶可以在低到中等溫度時(shí)高的內(nèi)在活性而進(jìn)行選擇。 因?yàn)樵谶@種條件下失活是相對(duì)低的，所以在這種條件下活性可在很大程度上確定其生產(chǎn) 力。在僅在短的時(shí)期內(nèi)需要蛋白酶活性的過程中，蛋白酶的穩(wěn)定性可用作使該蛋白酶關(guān)閉 的開關(guān)。在這種情況下，可優(yōu)選更不穩(wěn)定的而不是非常熱穩(wěn)定的蛋白酶。其他可在選擇適當(dāng)?shù)牡鞍酌钢衅鹱饔玫沫h(huán)境參數(shù)可為其對(duì)鹽的敏感性。與金屬離 子的相容性對(duì)于某些應(yīng)用是關(guān)鍵的，該金屬離子經(jīng)常以低的濃度發(fā)現(xiàn)于多種天然材料中。 特別地就金屬蛋白酶而言，某些離子可替代催化性金屬離子并減少或甚至完全破壞活性。 在一些應(yīng)用中，為了防止與蛋白酶配位的金屬離子的沖失，必須故意地加入金屬離子。眾所 周知的是為了酶穩(wěn)定性和壽命，必須提供鈣離子以防止蛋白質(zhì)結(jié)合的鈣的解離。多數(shù)微生物顯示適應(yīng)環(huán)境條件變化的某些耐受性。結(jié)果至少該生物能夠產(chǎn)生的蛋 白水解譜就可能顯示相似的耐受性。這樣一種蛋白水解譜可由許多蛋白水解酶一起覆蓋或 者只由少數(shù)具有廣泛水解譜的蛋白酶覆蓋?？紤]微生物的全部蛋白水解譜，非常重要的是 考慮位置。蛋白水解過程和降解的細(xì)胞內(nèi)定位和特征記述從工業(yè)視點(diǎn)看，從細(xì)胞分泌的蛋白酶具有大規(guī)模生產(chǎn)力和應(yīng)激耐受性的特定的優(yōu) 點(diǎn)，這是因?yàn)樗鼈儽仨氃诓皇芗?xì)胞保護(hù)下存活。大組的細(xì)胞蛋白酶可進(jìn)一步細(xì)分為可溶性 的和膜結(jié)合的。膜結(jié)合的可包含位于膜內(nèi)側(cè)及外側(cè)的蛋白酶。細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白酶可根據(jù) 它們所發(fā)生的特定細(xì)胞區(qū)室進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)分。由于細(xì)胞在一些程度上將蛋白酶與環(huán)境進(jìn) 行屏蔽，且因?yàn)榧?xì)胞控制細(xì)胞內(nèi)的條件，所以細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)對(duì)于大的環(huán)境變化更敏感，且其 最適值可與特定的細(xì)胞內(nèi)條件更相關(guān)。獲知蛋白酶所存在的細(xì)胞區(qū)室的條件可顯示其優(yōu)選 性。當(dāng)細(xì)胞外蛋白酶在從細(xì)胞分泌之后通常不再需要任何調(diào)節(jié)，細(xì)胞內(nèi)蛋白酶則經(jīng)常受到 復(fù)雜的控制和調(diào)節(jié)。關(guān)于特別的蛋白酶的功能，其定位經(jīng)常是非常重要的；例如，許多液泡和周質(zhì)蛋白 酶參與蛋白質(zhì)降解，而許多膜結(jié)合蛋白酶在蛋白質(zhì)加工中是重要的(Suarez Rendeules和 Wolf,1988)。
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對(duì)蛋白酶生物學(xué)性質(zhì)和進(jìn)化的詳盡的綜述已發(fā)表于van denHombergh =Thesis Landbouwuniversiteit Wageningen 在曲霉屬中為改進(jìn)蛋白質(zhì)生產(chǎn)而對(duì)蛋白水解系 統(tǒng)的分析(An analysis of theproteolytic system in Aspergillus in order to improv印rotein production) ISBN 90-5485-545-2，在此處將其整體引用作為參考。蛋白酶問題對(duì)微生物蛋白酶感興趣的一個(gè)重要原因是蛋白酶相關(guān)的表達(dá)問題，該問題發(fā)現(xiàn) 于幾個(gè)用于生物加工工業(yè)中的表達(dá)宿主中。異源宿主通過重組DNA技術(shù)對(duì)于蛋白質(zhì)生產(chǎn) 增加的利用最近已將這個(gè)問題帶到焦點(diǎn)上，這是因?yàn)榭磥懋愒吹鞍踪|(zhì)是更易被蛋白水解掉 (Archer 等人，1992 ；van den Hormbergh 等人，1996b)。在釀酒酵母中，在[20世紀(jì)]80年代早期已經(jīng)認(rèn)識(shí)到了蛋白酶問題和幾個(gè)蛋白酶 的參與，因而使定向基因破壞方法復(fù)雜化以解決該問題。在分泌中，蛋白質(zhì)暴露于存在于分 泌途徑中的幾種蛋白水解活性中。此外，在原養(yǎng)型微生物如曲霉屬中，分泌的蛋白質(zhì)可暴露 于幾種細(xì)胞外蛋白水解活性中。異源表達(dá)的蛋白質(zhì)降解的問題在曲霉屬中進(jìn)行了很好的證明(van den Hombergh Thesis LandbouwuniversiteitWageningen 在曲霉屬中為改進(jìn)蛋白質(zhì)生產(chǎn)而對(duì) 蛋白水角軍系統(tǒng)的分析(An analysis of the proteolytic system in Aspergillus inorder to improve protein product ion) ISBN 90-5485-545-2)，且已經(jīng)報(bào)道了母牛凝乳酶原、人 干擾素α-2tPA、GMCSF、IL6、乳鐵蛋白、雞蛋清溶菌酶(lysosyme)、豬plA2、黑曲霉果膠溶 解酶(lySaSe)B、大腸桿菌(E. coli)腸毒素B和β-glucoronidase和胡蘿卜軟腐歐文氏菌 (Erwinia carotovora)果膠酸鹽溶解酶(pectate lysase) 3的表達(dá)中的這類問題。蛋白水解的問題可在蛋白質(zhì)生產(chǎn)的幾個(gè)階段進(jìn)行解決。生物加工工程師可通過在 低溫進(jìn)行下游加工、通過早期分離產(chǎn)物和蛋白酶或通過使用蛋白酶抑制劑而解決蛋白水解 問題。這些可都導(dǎo)致成功地減少該問題。然而問題當(dāng)然沒有消除，這是因?yàn)樵诘鞍踪|(zhì)生產(chǎn) 過程中在體內(nèi)發(fā)生了許多水解。理解蛋白水解在細(xì)胞內(nèi)是如何控制的，主要的問題涉及觸發(fā)蛋白水解的識(shí)別機(jī) 制。在何種程度上將蛋白水解易感的(異源的)蛋白質(zhì)因?yàn)殄e(cuò)折疊而識(shí)別為異常，或者 如果正確折疊了卻因?yàn)樗鼈儾粨碛兴奚禺惖膶?duì)穩(wěn)定性很關(guān)鍵的性質(zhì)而被識(shí)別為“外源 的”。已知增加蛋白水解速率的因素包括養(yǎng)分缺乏和多種其他類型的逆境壓力(即溫度的 升高、滲透壓力、毒性物質(zhì)和某些異源蛋白質(zhì)的表達(dá))。為了在體內(nèi)處理蛋白水解相關(guān)的表 達(dá)問題，如將在下文描述的幾個(gè)方法已證明是成功的。然而，我們必須牢記真正的“非蛋白 水解的細(xì)胞”不存在，這是因?yàn)橛杉?xì)胞內(nèi)蛋白酶的蛋白水解參與許多基本的代謝和“管家 (housekeeping) ”反應(yīng)。因此在減少蛋白水解的過程中，必須分析導(dǎo)致蛋白水解減少的遺傳 背景潛在的次級(jí)作用，該次級(jí)作用可導(dǎo)致蛋白質(zhì)生產(chǎn)減少(如生長(zhǎng)速率減少或孢子形成)。在絲狀真菌表達(dá)宿主中破壞蛋白酶Berka及其同事(1990)描述了泡盛曲霉(A. awamori)p印A基因的克隆和破壞。最 近，已描述了黑曲霉中3個(gè)破壞的天冬氨酰蛋白酶。對(duì)主要細(xì)胞外天冬氨酰蛋白酶和主要 液泡天冬氨酰蛋白酶兩者的破壞劑(disruptant)進(jìn)行了描述。通過重組生成了二重和三 重破壞劑，并檢驗(yàn)了黑曲霉果膠溶解酶PELB蛋白質(zhì)的蛋白酶譜和表達(dá)和分泌，該P(yáng)ELB蛋白 質(zhì)對(duì)于蛋白水解降解非常易感(van denHombergh等人，1995)。ρ印A和ρ印B的破壞導(dǎo)致細(xì)
14胞外蛋白酶的活性分別減少80%和6%。在Δ ρ印E破壞劑中，同樣其他的(液泡的)蛋白 酶活性也由于對(duì)其他液泡蛋白酶的蛋白水解級(jí)聯(lián)而受到嚴(yán)重的影響。減少的細(xì)胞外活性與 減少的PELB體外降解和pelB改進(jìn)的體內(nèi)表達(dá)相關(guān)(van den Hombergh等人，1996f)。蛋白酶缺陷型(prt)突變體絲狀真菌已研究了幾種曲霉屬蛋白酶缺陷型突變體中蛋白質(zhì)生產(chǎn)是否得到改進(jìn)。Archer 及其同事描述了母雞蛋清溶菌酶在由Mattern及其同事(1992)生成的黑曲霉prt雙突 變體上清液中減少的蛋白水解，并推斷盡管降解仍然存在，但該降解顯著地減少了。Van denHombergh等人(1995)顯示黑曲霉PELB的體外降解在他們分離的所有7個(gè)prt互補(bǔ)群 中均減少了。事實(shí)上在prtB、prtF和prtG突變體中未觀察到降解。最近，在6個(gè)檢驗(yàn)的互 補(bǔ)群(prtA-F)中均顯示pelB基因表達(dá)的改進(jìn)，且在prtB、prtF和prtG突變體中觀察到了 最大的表達(dá)水平。除單一突變體之外，其含有與野生型活性相比在2-80%的殘留的細(xì)胞外 蛋白水解活性，通過重組和通過另一輪誘變生成雙突變體。經(jīng)過這種方法，對(duì)幾個(gè)prt雙突 變體進(jìn)行了選擇和進(jìn)一步的特征記述，這顯示與其親代品系相比PELB降解的進(jìn)一步減少。不經(jīng)過破壞或誘變消除蛋白酶活性，減少蛋白水解也可通過對(duì)相干蛋白水解活 性減量調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)。這可通過遺傳地改變啟動(dòng)子或基因的其他調(diào)節(jié)序列而實(shí)現(xiàn)。如由 Fraissinet-Tachet及其同事(1996)所示，黑曲霉的細(xì)胞外蛋白酶全部由碳分解代謝物抑 制和氮代謝物抑制調(diào)節(jié)。營養(yǎng)缺乏也導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)總的蛋白水解速率激烈增加，這也適用于 缺乏養(yǎng)分但擁有蛋白質(zhì)的細(xì)胞，其在饑餓條件下不需要或僅需要較少量營養(yǎng)。在使得在含 有高的葡萄糖和銨濃度的培養(yǎng)基上能夠高表達(dá)的表達(dá)策略中已報(bào)道了蛋白水解的減少。幾 個(gè)組成型糖酵解啟動(dòng)子(gpd和pkiA)在這些條件下高度表達(dá)，并也可用于驅(qū)動(dòng)連續(xù)發(fā)酵中 的(異源的)基因表達(dá)。所強(qiáng)加的養(yǎng)分缺乏類型可以變化的程度影響不同的蛋白酶，這意 味著在給定過程中養(yǎng)分條件的重要性依賴于涉及的蛋白水解的類型。因此特定的蛋白水解 可由底物限制的條件進(jìn)行誘導(dǎo)，該底物限制經(jīng)常用于許多大規(guī)模發(fā)酵過程。蛋白酶問題現(xiàn)在可部分地由一種上述或多種策略來解決。然而，仍未鑒定的蛋白 水解酶殘留的蛋白水解活性仍然構(gòu)成了本領(lǐng)域中的主要問題。為了進(jìn)一步減少不利的蛋白 水解的水平，本領(lǐng)域中非常需要對(duì)新的蛋白酶進(jìn)行鑒定，該蛋白酶負(fù)責(zé)同源和異源表達(dá)的 蛋白質(zhì)的降解。本發(fā)明提供了這種編碼蛋白酶的新蛋白酶基因序列。一旦已知新蛋白酶基 因的一級(jí)序列，則可采用一種或多種上述的重組DNA策略以生產(chǎn)(基因敲除)減少蛋白水 解活性的突變體。盡管蛋白酶在大多數(shù)工業(yè)過程中有廣泛應(yīng)用，但是現(xiàn)有的酶也在至少一種下述性 質(zhì)中具有顯著缺點(diǎn)。當(dāng)加入到動(dòng)物飼料中時(shí)，現(xiàn)有的蛋白酶不足以抵抗存在于如豬和家禽胃腸(GI) 道中的消化酶。在另一方面，現(xiàn)有可用的酶在擠出或?；^程中不足以抵抗采用的特定的(高) 溫度和(高)壓力條件。同樣，現(xiàn)有的酶在pH范圍3-7時(shí)不具有足夠的活性，該條件在許多食品、飲料產(chǎn)品 及在大多數(shù)動(dòng)物的GI道中是普遍的。根據(jù)另外一個(gè)方面，現(xiàn)有可用的蛋白酶的特異性非常有限，這導(dǎo)致現(xiàn)有的酶不能 降解或溶解某些“蛋白酶抗性”蛋白質(zhì)，從而導(dǎo)致肽或氨基酸產(chǎn)量低。此外，具有新特異性的蛋白酶使得新肽能夠合成?，F(xiàn)有可用的酶的另外一個(gè)缺點(diǎn)是其低的特異性活性。因此對(duì)于大量的應(yīng)用顯然存在對(duì)蛋白酶的大量需要，該蛋白酶對(duì)消化酶、高溫和/ 或壓力更具有抗性，且表現(xiàn)對(duì)其水解位點(diǎn)的新的特異性。本發(fā)明提供這種酶。發(fā)明目的本發(fā)明目的是提供編碼新蛋白酶的新的多核苷酸。進(jìn)一步的目的是提供天然和重 組生產(chǎn)的蛋白酶及生產(chǎn)這些酶的重組菌株。這種菌株也可用于更快地或以更高的產(chǎn)量生產(chǎn) 傳統(tǒng)的發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供在生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶中有缺陷的絲 狀真菌菌株。這種菌株可用于更有效地生產(chǎn)異源或同源蛋白質(zhì)。同樣抗體和融合多肽以及 制備和使用根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸和多肽的方法是本發(fā)明的部分。發(fā)明_既述本發(fā)明提供了編碼新蛋白酶的新的多核苷酸。更具體地，本發(fā)明提供多核苷酸，該多核苷酸具有(優(yōu)選地在高度嚴(yán)緊性條件下) 與根據(jù)選自SEQ ID NO 1 SEQ ID NO 57的序列或者選自SEQ ID NO 58 SEQ ID NO 114的序列的序列雜交的核苷酸序列。因此，本發(fā)明提供核酸，該核酸與根據(jù)選自SEQ IDNO 1 SEQ ID NO 57的序列或者選自SEQ ID NO 58 SEQ IDNO 114的序列的序列具有約 60%、優(yōu)選為 65%、更優(yōu)選為 70%，更加優(yōu)選為 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98%或99%的同源性。在一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸，該多核苷酸可從 絲狀真菌中，優(yōu)選地為曲霉屬中獲得，特別優(yōu)選黑曲霉。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的多核苷酸，該多核苷酸包含編碼多肽的核 酸序列，該多肽具有選自SEQ ID NO 115 SEQ IDNO 171或其功能等價(jià)物的氨基酸序列。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的多核苷酸，該多核苷酸編碼根據(jù) 選自SEQ ID N0:115 SEQ ID NO :171或其功能等價(jià)物的序列的多肽的至少一個(gè)功能結(jié)構(gòu) 域。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)選自SEQ IDNO :1 SEQ ID NO 57 的序列的蛋白酶基因。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了多核苷酸，優(yōu)選為編碼選自SEQ ID NO 115 SEQ ID NO :171的黑曲霉蛋白酶或該多肽的變體或片段的cDNA。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施 方案中，該cDNA具有選自SEQ ID NO 58 SEQ ID NO 114或其功能等價(jià)物的序列。編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽的基因組克隆也可通過下面方法獲得，即選擇適當(dāng)?shù)奶?針，用來特異性地?cái)U(kuò)增相應(yīng)于根據(jù)SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :57或其片段的任何一個(gè)序 列的基因組區(qū)域、將該探針在適當(dāng)條件下與適當(dāng)?shù)纳锶缜箤偃绾谇怪蝎@得的基因組 DNA進(jìn)行雜交、通過如PCR(聚合酶鏈反應(yīng))擴(kuò)增目的片段之后對(duì)擴(kuò)增的片段的純化和克隆。在更進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了多核苷酸，該多核苷酸包含根據(jù)本 發(fā)明的基因組多核苷酸的編碼序列，優(yōu)選為選自SEQ ID N0:58 SEQ ID N0:114的多核苷 酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了 cDNA，該cDNA可通過將選自SEQ ID NO 1 SEQ ID NO 57的序列在適當(dāng)?shù)乃拗魃锶绾谇怪锌寺『捅磉_(dá)而獲得。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)多肽也可通過將選自SEQ ID NO :1 SEQ IDNO :57的序列在適當(dāng)?shù)乃拗魃锶绾谇怪锌寺『捅磉_(dá)而獲得。本發(fā)明也涉及包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸序列和可用于擴(kuò)增或探測(cè)根據(jù)本發(fā)明 的DNA的引物、探針和片段的載體。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供載體，其中根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸序列功能性 地與調(diào)節(jié)序列相連接，該調(diào)節(jié)序列適合于編碼的氨基酸序列在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞如黑曲霉或 米曲霉(A.0ryZea)中表達(dá)。本發(fā)明也提供了制備根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸和載體的方法。本發(fā)明也涉及重組生產(chǎn)的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞含有根據(jù)本發(fā)明的異源或同源的多核 苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了重組宿主細(xì)胞，其中根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶的表 達(dá)顯著減少，或者其中蛋白酶的活性減少，或者其中蛋白酶甚至失活。這種重組體對(duì)于同源 或異源蛋白質(zhì)的表達(dá)尤其有用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了重組宿主細(xì)胞，其中根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶的 表達(dá)顯著增加，或者其中蛋白酶的活性增加。這種重組體對(duì)于同源或異源蛋白質(zhì)的表達(dá)尤 其有用，在此如果必需的蛋白水解切割變?yōu)橄匏俨襟E，那么成熟則嚴(yán)重地受到妨礙。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種重組生產(chǎn)的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞含有根據(jù) 本發(fā)明的異源和同源DNA，優(yōu)選為編碼帶有信號(hào)序列的蛋白質(zhì)的DNA，且其中該細(xì)胞能夠生 產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的功能蛋白酶，優(yōu)選為能夠使根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶過量表達(dá)的細(xì)胞，例如包 含根據(jù)本發(fā)明的基因或cDNA增加的拷貝數(shù)目的曲霉屬菌株。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種重組生產(chǎn)的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞含有根據(jù) 本發(fā)明的異源和同源DNA，且其中該細(xì)胞能夠分泌根據(jù)本發(fā)明的功能蛋白酶，優(yōu)選地為能夠 過量表達(dá)和分泌根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶的細(xì)胞，例如包含根據(jù)本發(fā)明的基因或cDNA增加的 拷貝數(shù)目的曲霉屬菌株。在本發(fā)明的另外一個(gè)方面，提供了純化的多肽。根據(jù)本發(fā)明的多肽包括由根據(jù)本 發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽。尤其優(yōu)選根據(jù)選自SEQ ID N0:115 SEQ ID N0:171或其功 能等價(jià)物的序列的多肽。本發(fā)明也提供了可與根據(jù)本發(fā)明的多肽反應(yīng)的抗體。這些抗體可為多克隆的，但 尤其優(yōu)選單克隆抗體。這種抗體對(duì)于純化根據(jù)本發(fā)明的多肽特別有用。包含根據(jù)本發(fā)明多肽的融合蛋白質(zhì)也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明也提供了制備 根據(jù)本發(fā)明的多肽的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明的多肽或其功能等價(jià)物是否存在，或者通 過檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明的DNA或其片段或功能等價(jià)物是否存在而診斷曲霉病。本發(fā)明也涉及根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶在此處所描述的工業(yè)過程中的用途。發(fā)明詳述多核苷酸本發(fā)明提供了編碼蛋白酶的多核苷酸，該蛋白酶具有序列選自SEQ ID N0:115 SEQ ID NO :171的氨基酸序列或其功能等價(jià)物。這些基因的序列通過對(duì)從黑曲霉獲得的基 因組克隆的測(cè)序確定。本發(fā)明提供了包含編碼這些蛋白酶的編碼基因及其完整cDNA序列 和其編碼序列的多核苷酸序列。因此，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，該多核苷酸包含選自 SEQ ID NO :1 SEQ ID NO 57 的核苷酸序列或選自 SEQID NO 58 SEQ ID NO 114 或其功能等價(jià)物的序列。更具體地，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，該多核苷酸在嚴(yán)緊性條件下與選自SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :57的多核苷酸序列或選自SEQ ID N0:58 SEQ ID NO: 114的序列 可進(jìn)行雜交，優(yōu)選為在高度嚴(yán)緊性條件下。有利地，這種多核苷酸可從絲狀真菌特別是從黑 曲霉中獲得。更具體地，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，該多核苷酸具有根據(jù)選自SEQ ID NO 1 SEQ ID NO 57的序列或選自SEQ ID NO 58 SEQID NO 114的序列的核苷酸序列。本發(fā)明也涉及分離的多核苷酸，該多核苷酸編碼至少一種根據(jù)選自SEQ ID NO 115 SEQ ID NO 171的序列或其功能等價(jià)物的多肽的功能結(jié)構(gòu)域。如在此處所用的，術(shù)語“基因”和“重組基因”指可從染色體DNA分離的核酸分子， 該分子包括編碼蛋白質(zhì)如黑曲霉蛋白酶的可讀框?；蚩砂ň幋a序列、非編碼序列、內(nèi)含 子和調(diào)節(jié)序列。此外，基因指如在此處定義的分離的核酸分子。本發(fā)明的核酸分子可用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)和此處提供的序列信息進(jìn)行分離， 該核酸分子如具有選自SEQ ID NO 1 SEQ IDNO 57的序列或選自SEQ ID NO 58 SEQ ID NO :114的序列或其功能等價(jià)物的核酸分子的核苷酸序列。例如，利用所有或部分的選 自SEQID NO 1 SEQ ID NO 57的序列的核苷酸序列或選自SEQ IDNO 58 SEQ ID NO 114的序列的核苷酸序列作為雜交探針，根據(jù)本發(fā)明的核酸分子可用標(biāo)準(zhǔn)的雜交和克隆技 術(shù)進(jìn)行分離(如描述于Sambrook，J.，F(xiàn)ritsh，E.F.和Maniatis，T.，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè) (Molecular Cloning :A Laboratory Manual), 2nd,ed. ,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)。此外，包含所有或部分選自SEQ ID NO :1 SEQ ID NO 57的序列或選自SEQ ID N0:58 SEQ ID NO :114的序列的核酸分子可用合成的寡核苷酸引物通過聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)進(jìn)行分離，該引物基于在選自SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :57的序列或選自SEQ ID NO 58 SEQ ID NO 114的序列中含有的序列信息而設(shè)計(jì)。本發(fā)明的核酸可用cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板和適當(dāng)?shù)墓押塑账嵋锔?據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。這樣擴(kuò)增的核酸可克隆入適當(dāng)?shù)妮d體中并用DNA序列分 析進(jìn)行表征。此外，相應(yīng)于或與根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列雜交的寡核苷酸可通過標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù) 進(jìn)行制備，如利用自動(dòng)DNA合成儀。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明分離的核酸分子包含選自SEQID NO 58 SEQ ID NO 114的序列中所示的核苷酸序列。選自SEQID NO 58 SEQ ID NO 114的序列的序 列相應(yīng)于黑曲霉蛋白酶cDNA的編碼區(qū)。該cDNA包含編碼根據(jù)選自SEQ ID NO :115 SEQ IDNO 171的序列的黑曲霉蛋白酶多肽的序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明分離的核酸分子包含與選自SEQ ID NO 1 SEQ ID NO 57的序列或選自SEQ ID NO 58 SEQID NO 114的序列所示的核苷酸序列或 其功能等價(jià)物互補(bǔ)核苷酸序列。與另一個(gè)核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分子與其足夠互補(bǔ)，從而可以與其進(jìn)行雜交，并 借此形成穩(wěn)定的雙鏈體。本發(fā)明的一個(gè)方面關(guān)于分離的核酸分子，該核酸分子編碼本發(fā)明的多肽或其功能 等價(jià)物如生物活性片段或結(jié)構(gòu)域，以及足以用作雜交探針以鑒定編碼本發(fā)明的多肽的核酸分子的核酸序列，和這種核酸分子適合于用作PCR引物以使核酸分子擴(kuò)增或突變的片段。“分離的多核苷酸”或“分離的核酸”是DNA或RNA，該DNA或RNA不與兩個(gè)編碼序 列直接鄰接，而在它所源自的生物體的天然存在的基因組中它與該編碼序列直接鄰接(一 個(gè)在5’端，一個(gè)在3’端)。因而，在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的核酸包括一些或全部與編碼序 列直接鄰接的5’非編碼(如啟動(dòng)子)序列。因此該術(shù)語包括如插入載體、自主復(fù)制的質(zhì)粒 或病毒、或原核生物或真核生物的基因組DNA中的重組DNA，或者作為獨(dú)立與其他序列的相 分離的分子(如由PCR或限制性內(nèi)切核酸酶處理產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段)。它也包 括一種重組DNA，該重組DNA是編碼額外的多肽的雜交基因的部分，該多肽基本不含細(xì)胞材 料、病毒材料或培養(yǎng)物培養(yǎng)基(當(dāng)由重組DNA技術(shù)生產(chǎn)時(shí))、或者化學(xué)前體或其他的化學(xué)藥 品(當(dāng)化學(xué)地合成時(shí))。此外，“分離的核酸片段”不作為一個(gè)天然存在的核酸片段且不發(fā) 現(xiàn)于天然狀態(tài)中。如在此處所用的，術(shù)語“多核苷酸”或“核酸分子”意指包括DNA分子(如cDNA或 基因組DNA)和RNA分子(如mRNA)和用核苷酸類似物生成的DNA或RNA類似物。核酸分 子可為單鏈的或雙鏈的，但優(yōu)選地為雙鏈的DNA。核酸可用寡核苷酸類似物或衍生物(如肌 苷或硫代磷酸核苷酸)進(jìn)行合成。這種寡核苷酸可用于如制備具有改變的堿基配對(duì)能力或 增加的核酸酶抗性的核酸。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供分離的核酸分子，該核酸分子與蛋白酶核酸分子如 蛋白酶核酸分子的編碼鏈反義。同樣包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是此處所描述的核酸分子的 互補(bǔ)鏈。測(cè)序錯(cuò)誤此處所提供的序列信息不應(yīng)該被這樣狹窄地解釋為需要包含錯(cuò)誤鑒定的堿基。此 處所公開的特定序列可方便地用于從絲狀真菌特別是黑曲霉中分離完整的基因，這反過來 可使其易于進(jìn)行進(jìn)一步的序列分析并借此鑒定測(cè)序錯(cuò)誤。除非另外指示，此處所有由對(duì)DNA分子測(cè)序所確定的核苷酸序列都是用自動(dòng)DNA 測(cè)序儀確定的，且所有由在此處確定的DNA分子編碼的多肽的氨基酸序列都是通過對(duì)如上 所確定的DNA序列進(jìn)行翻譯而預(yù)測(cè)的。因此，如本領(lǐng)域所公知的，任何由該自動(dòng)方法確定的 DNA序列、任何在此處確定的核苷酸序列都可含有一些錯(cuò)誤。由自動(dòng)裝置確定的核苷酸序列 與測(cè)序的DNA分子的實(shí)際核苷酸序列一般是至少約90%—致的，更一般地為至少約95% 至少約99. 9% —致的。實(shí)際序列可通過其他方法而更精確地確定，該方法包括本領(lǐng)域中眾 所周知的人工DNA測(cè)序方法。如同樣在本領(lǐng)域中公知的，與實(shí)際序列相比在確定的核苷酸 序列中單個(gè)的插入或缺失就將導(dǎo)致核苷酸序列翻譯中的移碼，從而由確定的核苷酸序列編 碼的預(yù)測(cè)的氨基酸序列將在這種插入或缺失位點(diǎn)開始與由測(cè)序的DNA分子實(shí)際編碼的氨 基酸完全不同。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠鑒定這種錯(cuò)誤鑒定的堿基并知道如何校正這種錯(cuò)誤。核酸片段、探針和引物根據(jù)本發(fā)明的核酸分子可僅包含核酸分子的一部分或一個(gè)片段，該核酸分子選自 SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :57 的序列或選自 SEQID N0:58 SEQ ID NO: 114 的序列，例如 可用作探針或引物或編碼該蛋白酶基因的一部分的片段的片段。從對(duì)蛋白酶基因和cDNA 確定的核苷酸序列使得能夠生成設(shè)計(jì)用于鑒定和/或克隆其他蛋白酶家族成員以及來自
19其他物種的蛋白酶同系物的探針和引物。該探針/引物一般包含基本純化的寡核苷酸，該 寡核苷酸一般包含優(yōu)選在高度嚴(yán)緊性條件下與一個(gè)核苷酸序列的至少約12或15、優(yōu)選為 約18或20、優(yōu)選為約22或25，更優(yōu)選為約30、35、40、45、50、55、60、65或75或更多連續(xù)的 核苷酸進(jìn)行雜交的核苷酸序列區(qū)域，其中的核苷酸序列在選自SEQ ID NO :1 SEQ ID NO 57的序列或選自SEQ IDNO 58 SEQ ID NO 114的序列或其功能等價(jià)物中顯示?；诘鞍酌负塑账嵝蛄械奶结樋捎糜谔綔y(cè)如在其他生物中編碼相同或同源蛋白 質(zhì)的轉(zhuǎn)錄物或基因組蛋白酶序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該探針進(jìn)一步包含在其上附著的 標(biāo)記基團(tuán)，如該標(biāo)記基團(tuán)可為放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子。這種探針也可用 作鑒定表達(dá)蛋白酶蛋白質(zhì)的細(xì)胞的診斷檢驗(yàn)試劑盒的部分。同一性和同源性術(shù)語“同源性”和“同一性百分比”在此處互換使用。對(duì)于本發(fā)明的目的，為了確定 兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸序列的同一性百分比，為了進(jìn)行最適比較將序列進(jìn)行比對(duì)(如 為了進(jìn)行與第二個(gè)氨基酸或核酸序列的最適比對(duì)，在第一個(gè)氨基酸或核酸序列的序列中引 入了缺口)。然后對(duì)相應(yīng)的氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸進(jìn)行了比較。 當(dāng)?shù)谝粋€(gè)序列中的位置由與第二個(gè)序列中相應(yīng)位置上相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)， 那么該分子在該位置上為同一的。兩個(gè)序列間的同一性百分比為序列共有的相同位置數(shù)目 的函數(shù)(即，％同一性=相同位置的數(shù)目/位置的總數(shù)目(即重疊位置)χ100)。優(yōu)選，該 兩個(gè)序列等長(zhǎng)。技術(shù)人員將知道幾個(gè)不同的計(jì)算機(jī)軟件可用于確定兩個(gè)序列間的同源性。例 如，兩個(gè)序列間序列比較和同一性百分比的確定可用數(shù)學(xué)算法來實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí) 施方案中，兩個(gè)氨基酸序列間的同一性百分比用Needleman和WunschCJ. Mol. Biol. (48) 444-453(1970))算法確定，該算法已并入到GCG軟件包的GAP程序中(從http://WWW. gcg. com可獲得)，使用Blossom 62矩陣或者PAM250矩陣和16、14、12、10、8、6或4的缺口權(quán)數(shù) (gap weight)和1、2、3、4、5或6的長(zhǎng)度權(quán)數(shù)(length weight) 0技術(shù)人員可以理解所有這 些不同的參數(shù)將產(chǎn)生稍微不同的結(jié)果，但是當(dāng)使用不同的算法時(shí)兩個(gè)序列的總同一性百分 比并不顯著地改變。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)核苷酸序列間的同一性百分比用GCG軟件包中的 GAP 程序(從 http //www. gcg. com 可獲得)確定，使用 NWSgapdna. CMP 矩陣和 40、50、60、70 或80的缺口權(quán)數(shù)和1、2、3、4、5或6的長(zhǎng)度權(quán)數(shù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)氨基酸或核苷 酸序列的同一性百分比用E.Meyers和W. Miller (CABI0S，4 11-17 (1989))的算法確定，該 算法已并入到 ALIGN 程序(2. 0 版)(從 http://vega/igh. cnrs. fr/bin/align-guess. cgi 可獲得)中，使用PAM120權(quán)數(shù)(weight)殘基表、缺口長(zhǎng)度罰分12和缺口罰分4。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列可進(jìn)一步用作“查詢序列”以進(jìn)行對(duì)公共數(shù)據(jù)庫的搜 索，從而如鑒定其他家族成員或相關(guān)的序列。這種搜索可用Altschul等人，(1990)J.Mol. Biol. 215 403-10的NBLAST和XBLAST程序(2. 0版)來進(jìn)行。BLAST核苷酸搜索可用 NBLAST程序、分?jǐn)?shù)=100、字長(zhǎng)=12進(jìn)行以獲得與本發(fā)明的蛋白酶核酸分子同源的核苷酸 序列。BLAST蛋白質(zhì)搜索可用XBLAST程序、分?jǐn)?shù)=50、字長(zhǎng)=3進(jìn)行以獲得與本發(fā)明的蛋 白酶蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的有缺口的比對(duì)，可利用在 Altschul 等人，(1997) Nucleic Acids Res. 25(17) :3389_3402 中描述的 Gapped BLAST。當(dāng)利用BLAST和Gapped BLAST程序時(shí)，可使用各個(gè)程序(如XBLAST和NBLAST)缺省的參數(shù)。 參見 http://www. ncbi. nlm. nih. gov。雜交如在此處所用的，術(shù)語“雜交”意指描述用于雜交和洗滌的條件，在該條件下相互 為至少約50 %的、至少約60 %的、至少約70 %的、更優(yōu)選為至少約80 %的、甚至更優(yōu)選為至 少約85% 90%的、更優(yōu)選為至少約95%的同源的核苷酸序列一般保持相互雜交。這種雜交條件的一個(gè)優(yōu)選的非限制性例子是6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中于 45°C的雜交，伴隨著一次或多次在IX SSC、0. 1% SDS中的洗滌，溫度為50°C，優(yōu)選55°C，優(yōu) 選60°C，且更加優(yōu)選65°C。高度嚴(yán)緊性的條件包括如于68°C在5x SSC/5x Denhardt，s溶液/1. 0% SDS中的 雜交，及于室溫在0. 2x SSC/0. 1% SDS中的洗滌?；蛘?，洗滌可以在42°C進(jìn)行。技術(shù)人員將知道對(duì)于嚴(yán)緊性和高度嚴(yán)緊性雜交條件應(yīng)使用的條件。關(guān)于這種 條件的額外的指南易于從本領(lǐng)域獲得，如在Sambrook等人，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手 冊(cè)(Molecular Cloning :ALaboratory Manual), Cold Spring Harbor Press, N. Y.； 和 Ausubel 等人(eds.)，1995，分子生物學(xué)當(dāng)前規(guī)程(CurrentProtocoIs in Molecular Biology), (John Wiley & Sons, N.Y.)。當(dāng)然，僅與聚腺苷酸序列(如mRNA的3’末端聚腺苷酸區(qū)域)或與互補(bǔ)的T (或U) 殘基區(qū)段雜交的多核苷酸不包括于本發(fā)明中用于特異性地與本發(fā)明的核酸部分雜交的的 多核苷酸中，這是因?yàn)檫@樣一種多核苷酸可與含有聚腺苷酸區(qū)段或其補(bǔ)體的任何核酸分子 進(jìn)行雜交(如實(shí)際上任何雙鏈的cDNA克隆)。從其他生物中獲得全長(zhǎng)的DNA在一般方法中，可對(duì)由其他生物構(gòu)建的cDNA文庫進(jìn)行篩選，如來自絲狀真菌的， 特別是來自曲霉屬物種的。例如，曲霉屬菌種可通過RNA印跡分析來篩選同源的蛋白酶多核苷酸。在對(duì)根據(jù) 本發(fā)明的多核苷酸的同源轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行探測(cè)后，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可 從分離自適當(dāng)?shù)钠废档腞NA構(gòu)建cDNA文庫?；蛘撸偟幕蚪MDNA文庫可用與根據(jù)本發(fā)明 的蛋白酶多核苷酸雜交的探針進(jìn)行篩選。例如，同源基因序列可通過進(jìn)行PCR來分離，該P(yáng)CR使用在所述核苷酸序列基礎(chǔ)上 設(shè)計(jì)的兩個(gè)寡核苷酸引物或兩個(gè)簡(jiǎn)并的寡核苷酸引物庫。反應(yīng)的模板可為通過對(duì)mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄而獲得的cDNA，該mRNA從已知或猜測(cè)可 表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的菌種中制備。可對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行亞克隆和測(cè)序以確保擴(kuò)增的 序列代表新蛋白酶的核酸序列或其功能等價(jià)物的序列。然后PCR片段可通過多種已知的方法用于分離全長(zhǎng)的cDNA克隆。例如，可對(duì)擴(kuò)增 的片段進(jìn)行標(biāo)記并用于篩選噬菌體或粘粒cDNA文庫?；蛘撸蓪?biāo)記的片段用于篩選基因 組文庫。也可將PCR技術(shù)用于從其他生物中分離全長(zhǎng)cDNA序列。例如，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序，可 從適當(dāng)?shù)募?xì)胞或組織來源分離RNA?？捎霉押塑账嵋镌赗NA上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以引發(fā)第 一鏈的合成，其中的寡核苷酸引物特異于大多數(shù)所擴(kuò)增片段的5’端。然后可將結(jié)果所得的RNA/DNA雜交物用標(biāo)準(zhǔn)的末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)進(jìn)行“加尾(tailed)”(如用鳥嘌呤)，該雜交物可用RNase H進(jìn)行消化，且然后可引發(fā)第二鏈合成(如 用聚胞嘧啶引物)。因而，所擴(kuò)增片段上游的cDNA序列可易于進(jìn)行分離。有用的克隆策略 的綜述，參見如Sambrook等人，見上；Ausubel等人，見上。載體本發(fā)明的另一個(gè)方面關(guān)于載體，優(yōu)選為表達(dá)載體，該載體含有編碼蛋白酶蛋白質(zhì) 或其功能等價(jià)物的核酸。如在此處所用的，術(shù)語“載體”指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與它相連接的另一個(gè) 核酸的核酸分子。一類載體是“質(zhì)粒”，它指在其中可連接額外的DNA區(qū)段的圓形雙鏈DNA 環(huán)。另一類載體是病毒載體，其中額外的DNA區(qū)段可連接入病毒基因組。某些載體能夠在它 們所引入的宿主細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制(如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動(dòng)物載 體)。其他載體(如非附加型哺乳動(dòng)物載體)在引入到宿主細(xì)胞內(nèi)后將整合入宿主細(xì)胞基 因組，并借此與宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)與它們可操作地相連接的基 因的表達(dá)。此處將這種載體稱為“表達(dá)載體”。通常，在重組DNA技術(shù)中利用的表達(dá)載體經(jīng)常 采用質(zhì)粒的形式。術(shù)語“質(zhì)?！焙汀拜d體”在此處可互換使用，這是因?yàn)橘|(zhì)粒是載體最常用的 形式。然而，本發(fā)明意指包括其他形式的表達(dá)載體，如發(fā)揮等價(jià)功能的病毒載體(如復(fù)制缺 Ρβ型反錄病_、1/$病_ (adenoviruses)禾口Hi半隨病_ (adeno-associated viruses))。本發(fā)明的重組表達(dá)載體以適于在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)核酸的形式包含本發(fā)明的核酸， 這意味著重組表達(dá)載體包括在用于表達(dá)的宿主細(xì)胞基礎(chǔ)上選擇的一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列，該 調(diào)節(jié)序列可操作地連接到要表達(dá)的核酸序列上。在重組表達(dá)載體中，“可操作地連接”意思 指目標(biāo)核苷酸序列以使得核苷酸序列能夠表達(dá)的方式連接到調(diào)節(jié)序列上(如在體外轉(zhuǎn)錄/ 翻譯系統(tǒng)中或當(dāng)載體引入到宿主細(xì)胞內(nèi)時(shí)，在宿主細(xì)胞內(nèi))。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”意指包括啟 動(dòng)子、增強(qiáng)子和其他表達(dá)控制元件(如聚腺苷酸化信號(hào))。這種調(diào)節(jié)序列描述于如Goeddel ； 基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法(Gene Expression Technology :Methods inEnzymology) 185, Academic Press, San Diego，CA(1990)。調(diào)節(jié)序列包括那些在許多類型宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核 苷酸序列的組成型表達(dá)的和那些僅在某些宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列表達(dá)的(如組織特 異性的)調(diào)節(jié)序列。技術(shù)人員應(yīng)該理解表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可依賴于如要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選 擇、所需蛋白質(zhì)表達(dá)的水平等因素。本發(fā)明的表達(dá)載體可引入到宿主細(xì)胞內(nèi)以借此生產(chǎn)由 所述核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽(如蛋白酶蛋白質(zhì)，蛋白酶蛋白質(zhì)的突變型，其片段、變體或功 能等價(jià)物，融合蛋白質(zhì)等)。本發(fā)明的重組表達(dá)載體可為原核或真核細(xì)胞內(nèi)蛋白酶蛋白質(zhì)的表達(dá)而設(shè)計(jì)。例 如，蛋白酶蛋白質(zhì)可在細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞(使用桿狀病毒(baculovirus)表達(dá) 載體)、酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞進(jìn)一步描述于Goeddel，基因表 達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法(Gene Expression Technology :Methods inEnzymology) 185, Academic Press, San Diego, CA(1990)?；蛘撸亟M表達(dá)載體可在體外轉(zhuǎn)錄和翻譯，例如用T7啟動(dòng)子 調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶。用于本發(fā)明的表達(dá)載體包括源自染色體的、附加型的和病毒的載體，如源自細(xì) 菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母附加體、酵母染色體元件、病毒如桿狀病毒、乳多空病毒(papova viruses)、痘苗病毒(vaccinia viruses)、腺病毒、禽痘病毒(fowl poxviruses)、假狂犬病 毒(pseudorabies viruses)和反轉(zhuǎn)錄病毒，和源自其組合的載體，如那些源自質(zhì)粒和噬菌 體遺傳元件的載體，如粘粒和噬菌粒。
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DNA插入片段應(yīng)可操作地連接到適當(dāng)?shù)膯?dòng)子上，如噬菌體λ PL啟動(dòng)子、大腸桿 菌lac、trp和tac啟動(dòng)子、SV40早期和晚期啟動(dòng)子和反轉(zhuǎn)錄病毒LTRs啟動(dòng)子等。其他適 當(dāng)?shù)膯?dòng)子為技術(shù)人員公知。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，優(yōu)選那些能夠指導(dǎo)絲狀真菌中蛋 白酶高水平表達(dá)的啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子為本領(lǐng)域公知。該表達(dá)構(gòu)建體可含有轉(zhuǎn)錄起始、終 止的位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄區(qū)域中用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。由構(gòu)建體表達(dá)的成熟轉(zhuǎn)錄物的編碼部 分將在要翻譯的多肽的起始包括翻譯起始AUG，而在其末尾包括適當(dāng)定位的終止密碼子。載體DNA可通過常規(guī)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)引入到原核或真核細(xì)胞。如在此處所用 的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”意指多種本領(lǐng)域公認(rèn)的將外源核酸(如DNA)引入到宿主細(xì)胞的 技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染、脂轉(zhuǎn)染、陽離 子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔。轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的適當(dāng)方法可它于Sambrook等人(分 子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular Cloning =ALaboratory Manual), 2nd, ed.，Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, NY, 1989)，Davis 等人，分子生物學(xué)基本方法(Basic Methods in Molecular Biology) (1986) 和其他實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)。對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，依賴于所用的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，已知僅有一 小部分的細(xì)胞可將外源DNA整合入其基因組。為了鑒定和選擇這些整合體，通常將一個(gè)編 碼選擇性標(biāo)記的基因(如抗生素抗性)與目標(biāo)基因一起引入到宿主細(xì)胞中。優(yōu)選的選擇性 標(biāo)記包括那些賦予對(duì)藥物如G418、潮霉素和氨甲蝶呤(抗性的標(biāo)記)。編碼選擇性標(biāo)記的核 酸可在與編碼蛋白酶蛋白質(zhì)相同的載體上引入宿主細(xì)胞，或者可在單獨(dú)的載體上引入。由 引入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可通過藥物選擇來鑒定(即插入了選擇性標(biāo)記基因的細(xì)胞可 存活，而其他細(xì)胞則死亡)。原核生物中蛋白質(zhì)的表達(dá)經(jīng)常在大腸桿菌中用含有組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的載 體實(shí)現(xiàn)，該啟動(dòng)子指導(dǎo)融合或非融合蛋白質(zhì)的表達(dá)。融合蛋白質(zhì)將許多氨基酸加入到編碼 的蛋白質(zhì)中，如加入到重組蛋白質(zhì)的氨基末端。這種融合載體一般用作三個(gè)目的1)增加 重組蛋白質(zhì)的表達(dá)；2)增加重組蛋白質(zhì)的溶解性；和3)通過在親和純化中充當(dāng)配體而有助 于重組蛋白質(zhì)的純化。在融合表達(dá)載體中，蛋白水解切割位點(diǎn)經(jīng)常在融合部分和重組蛋白 質(zhì)的接點(diǎn)處引入以使得在融合蛋白質(zhì)純化后，重組蛋白質(zhì)能夠從融合部分分離。這種酶及 其相關(guān)的識(shí)別序列包括因子Xa、凝血酶和腸激酶。如所顯示的，表達(dá)載體將優(yōu)選含有選擇性標(biāo)記。這種標(biāo)記包括真核細(xì)胞培養(yǎng)物的 二氫葉酸還原酶或新霉素抗性和大腸桿菌和其他細(xì)菌培養(yǎng)的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。適 當(dāng)宿主的代表性例子包括細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌、鏈霉菌屬(Streptomyces)和鼠傷寒沙門 氏菌(Salmonella typhimurium)；真菌細(xì)胞如酵母；昆蟲細(xì)胞如果蠅S2和夜蛾Sf9 ；動(dòng)物 細(xì)胞如CHO、COS和Bowes黑色素瘤；及植物細(xì)胞。上述宿主細(xì)胞的適當(dāng)培養(yǎng)物培養(yǎng)基和條 件為本領(lǐng)域公知。在載體中，細(xì)菌中優(yōu)選使用pQE70、pQE60和PQE-9，可購自Qiagen ；pBS載體、 Phagescript 載體、Bluescript 載體、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A,可購自 Stratagene ； 和可購自 Pharmacia 的 ptrc99a、pKK223_3、pKK233_3、pDR540、pRIT5。優(yōu)選的真核載體有 可購自 Stratagene 的 PWLNE0、pSV2CAT、p0G44、pZTl 和 pSG ；和可購自 pharmacia 的 PSVK3、 pBPV、pMSG和pSVL。其他適當(dāng)?shù)妮d體對(duì)于技術(shù)人員顯而易見。
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在用于本發(fā)明的已知細(xì)菌啟動(dòng)子包括大腸桿菌IacI和IacZ啟動(dòng)子、T3和T7啟 動(dòng)子、gpt啟動(dòng)子、λ PR、PL啟動(dòng)子和trp啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟 動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒LTRs啟動(dòng)子如來自勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus) (“RSV”)的，和 金屬硫蛋白啟動(dòng)子如小鼠金屬硫蛋白-I啟動(dòng)子。編碼本發(fā)明多肽的DNA在較高等真核生物中的轉(zhuǎn)錄可通過在載體中插入增強(qiáng)子 序列而增加。增強(qiáng)子是DNA的順式作用元件，通常為約10 300bp長(zhǎng)，作用為在給定的宿 主細(xì)胞類型中增加啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。增強(qiáng)子的例子包括位于復(fù)制起點(diǎn)的晚側(cè)的bplOO 270的SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus)早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、位于復(fù)制起點(diǎn)晚期 側(cè)的多形瘤增強(qiáng)子和腺病毒增強(qiáng)子。為將已翻譯的蛋白質(zhì)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腔內(nèi)、向周質(zhì)區(qū)域或向細(xì)胞外環(huán)境中分泌，適當(dāng) 的分泌信號(hào)可插入到表達(dá)的多肽中。該信號(hào)對(duì)多肽可為內(nèi)源的，或者它們可為異源的信號(hào)。多肽可以已修飾的形式表達(dá)，如融合蛋白質(zhì)，且可不僅包括分泌信號(hào)，而且包括額 外的異源功能區(qū)。因而，例如可將一個(gè)額外的氨基酸，特別是帶電荷的氨基酸加入到多肽的 N-末端以改進(jìn)該多肽在純化或在隨后的處理和貯藏過程中在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性和持續(xù) 時(shí)間。同樣地，可將肽部分加入到多肽中以促進(jìn)純化。根據(jù)本發(fā)明的多肽本發(fā)明提供了一種分離的多肽，該多肽具有選自SEQ IDN0:115 SEQ ID N0:171 的氨基酸序列、通過表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸可獲得的或者在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中在 適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_(dá)選自SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :57的序列可獲得的氨基酸序列，以及通 過在適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_(dá)選自SEQ ID NO 58 SEQ ID NO 114的多核苷酸序列可獲得的氨 基酸序列。同樣地，包含上述多肽的功能等價(jià)物的肽或多肽包含于本發(fā)明中。上述多肽全 體包含于術(shù)語“根據(jù)本發(fā)明的多肽”中。術(shù)語“肽”和“寡肽”被認(rèn)為同義(如通常所認(rèn)識(shí)的)，且如同情況所需的，每一個(gè) 術(shù)語都可互換地使用以指示由肽基鍵偶聯(lián)的至少兩個(gè)氨基酸的鏈。單詞“多肽”此處用作含 有超過7個(gè)氨基酸殘基的鏈。此處的寡肽和多肽分子式或序列都從左到右且在從氨基末端 到羧基末端的方向書寫。此處所用的氨基酸單字母密碼為本領(lǐng)域公知，且可見于Sambrook 等人(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(MolecularCloning :A Laboratory Manual), 2nd, ed.，Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor, NY, 1989)中?！胺蛛x的”多肽或蛋白質(zhì)意指從其天然環(huán)境中取出的多肽或蛋白質(zhì)。例如，在 宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組生產(chǎn)的多肽和蛋白質(zhì)被認(rèn)為是根據(jù)本發(fā)明的目的分離的，正如由 許多適當(dāng)?shù)募夹g(shù)基本純化的天然或重組多肽，該技術(shù)如在Smith和Johnson，Gene 67: 31-40(1988)中公開的單步驟純化方法。根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶可用眾所周知的方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化，該方 法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互 作用層析、親和層析、羥磷灰石(hydroxylapatite)層析和凝集素層析。對(duì)于分析目的最優(yōu) 選高效液相層析(“HPLC”)用于純化。本發(fā)明的多肽包括天然純化的產(chǎn)物、化學(xué)合成程序的產(chǎn)物和由重組技術(shù)從原核或 真核宿主中生產(chǎn)的產(chǎn)物，該宿主包括如細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。依賴于在重組生產(chǎn)過程中采用的宿主，本發(fā)明的多肽可以糖基化或非糖基化。此外，在一些情況下 作為宿主介導(dǎo)的過程的結(jié)果，本發(fā)明的多肽也可包括初始修飾的甲硫氨酸殘基。此外，根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)可為前體蛋白質(zhì)如酶原、雜交蛋白質(zhì)、作為前序列或前 序列原獲得的蛋白質(zhì)，或者任何其他類型的非成熟形式。蛋白質(zhì)片段本發(fā)明也描述了根據(jù)本發(fā)明的多肽的生物學(xué)活性片段。本發(fā)明多肽的生物學(xué)活性片段包括包含與蛋白酶蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有充分 的一致性或者源自后者(如選自SEQ ID N0:115 SEQ ID NO 171序列的氨基酸序列)的 氨基酸序列的多肽，它包括比全長(zhǎng)蛋白質(zhì)少的氨基酸，且展示至少一種相應(yīng)全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的 生物學(xué)活性。一般地，生物學(xué)活性片段包含具有至少一種蛋白酶蛋白質(zhì)活性的結(jié)構(gòu)域或基 元。本發(fā)明的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性片段可為如長(zhǎng)度為10、25、50、100或更多氨基酸的多肽。 此外，其他生物學(xué)活性部分可通過重組技術(shù)制備并評(píng)估其具有的本發(fā)明多肽天然形式的一 或多種生物學(xué)活性，其中蛋白質(zhì)的其他區(qū)域已缺失。本發(fā)明也描述了編碼上述蛋白酶蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性片段的核酸片段。融合蛋白質(zhì)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)物如其生物學(xué)活性部分可以可操作地連接到非蛋 白酶多肽(如異源氨基酸序列)上以形成融合蛋白質(zhì)。如在此處所用的，蛋白酶的“嵌合蛋 白質(zhì)”或“融合蛋白質(zhì)”包含可操作地連接到非蛋白酶多肽上的蛋白酶多肽?！暗鞍酌付嚯摹?指具有相應(yīng)于根據(jù)本發(fā)明的多肽序列的氨基酸序列的多肽，而“非蛋白酶多肽”指具有相應(yīng) 于一個(gè)蛋白質(zhì)的氨基酸序列的多肽，其中的蛋白質(zhì)基本不與根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)同源，如 不同于蛋白酶蛋白質(zhì)的或源自相同或不同生物的蛋白質(zhì)。在一個(gè)蛋白酶融合蛋白質(zhì)中，蛋 白酶多肽可相應(yīng)于根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的全部或部分。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白酶 融合蛋白質(zhì)包含至少一個(gè)根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性片段。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方 案中，蛋白酶融合蛋白質(zhì)包含至少兩個(gè)根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性片段。在融合蛋 白質(zhì)中，術(shù)語“可操作地連接的”意指蛋白酶蛋白質(zhì)和非蛋白酶蛋白質(zhì)以符合閱讀框的方式 相互融合。非蛋白酶多肽可融合到蛋白酶多肽的N-末端或C-末端。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白質(zhì)GST-蛋白酶融合蛋白質(zhì)，其中蛋白酶序列 融合到GST序列的C-末端。這種融合蛋白質(zhì)可促進(jìn)重組蛋白酶的純化。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，融合蛋白質(zhì)是一種在其N-末端含有異源信號(hào)序列的蛋白酶蛋白質(zhì)。在某些宿主細(xì)胞 (如哺乳動(dòng)物和酵母宿主細(xì)胞)中，蛋白酶的表達(dá)和/或分泌可通過使用異源信號(hào)序列而增 加。在另一個(gè)例子中，可將桿狀病毒包膜蛋白的gp67分泌序列用作異源信號(hào)序列(分 當(dāng) ff 夫JJ 禾呈(Current Protocols inMolecular Biology) ,Ausubel ^A, eds. ,John
Wiley & Sons，1992)。真核異源信號(hào)序列的其他例子包括蜂毒肽和人胎盤堿性磷酸酶的分 泌序列(Stratagene ；La Jolla，California)。在另外一個(gè)例子中，有用的原核異源信號(hào)序 列包括PhoA分泌信號(hào)(Sambrook等人，見上)和蛋白質(zhì)A分泌信號(hào)(Pharmacia Biotech ； Piscataway, New Jersey)。可將信號(hào)序列用于促進(jìn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽的分泌和分離。信號(hào)序列一般特 征在于一個(gè)疏水氨基酸的核心，該核心通常在分泌過程中經(jīng)一或多次切割事件而從成熟蛋白質(zhì)中切除。這種信號(hào)肽含有加工位點(diǎn)，該位點(diǎn)使得信號(hào)序列在經(jīng)過分泌途徑時(shí)能夠從成 熟蛋白質(zhì)中切除。信號(hào)序列指導(dǎo)蛋白質(zhì)的分泌，如從該表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的真核宿主中分泌， 且信號(hào)序列隨后或同時(shí)被切割。然后該蛋白質(zhì)可易于用本領(lǐng)域公認(rèn)的方法從細(xì)胞外培養(yǎng)基 中純化?；蛘撸撔盘?hào)序列可用促進(jìn)純化的序列連接到目標(biāo)蛋白上，如具有GST結(jié)構(gòu)域的 序列。因而，例如可將編碼多肽的序列融合到標(biāo)記序列上，如編碼肽的序列，該序列促進(jìn)融 合多肽的純化。在本發(fā)明這方面某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，標(biāo)記序列是六組氨酸肽，如在PQE 載體中提供的標(biāo)記(Qiagen，InC.)，其中許多可由商品購得。例如，如在Gentz等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824(1989)中所描述的，六組氨酸提供了對(duì)融合蛋白質(zhì)的方 便純化。HA標(biāo)記是另一個(gè)用于純化的肽，該肽相應(yīng)于源自流感血凝素蛋白質(zhì)的抗原決定部 位，這已由如Wilson等人，Cell 37:767(1984)進(jìn)行了描述。優(yōu)選，本發(fā)明的蛋白酶嵌合或融合蛋白質(zhì)通過標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)生產(chǎn)。例如， 根據(jù)常規(guī)技術(shù)將編碼不同多肽序列的DNA片段以符合閱讀框的方式連接在一起，例如通過 采用平頭末端或交錯(cuò)末端的末端進(jìn)行連接、采用限制酶消化提供適當(dāng)?shù)哪┒?、適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)平 粘性末端、采用堿性磷酸酶處理以避免不需要的連接及酶促連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 融合蛋白質(zhì)可通過常規(guī)技術(shù)進(jìn)行合成，該技術(shù)包括自動(dòng)DNA合成儀。或者，對(duì)基因片段的 PCR擴(kuò)增可用錨定引物來實(shí)施，該引物可在兩個(gè)連續(xù)的基因片段間引起互補(bǔ)的突出端，其 可隨后進(jìn)行退火和重新擴(kuò)增以生成嵌合基因序列(參見如分子生物學(xué)當(dāng)前規(guī)程(Current Protocols in Molecular Biology)，Ausubel 等人，John Wiley & Sons:1992)。此外，許 多已經(jīng)編碼融合部分的表達(dá)載體可由商品購得(如GST多肽)。可將蛋白酶編碼核酸克隆 入這樣表達(dá)載體中，從而該融合部分以符合閱讀框的方式連接到蛋白酶蛋白質(zhì)上。功能等價(jià)物術(shù)語“功能等價(jià)物”和“功能變體”在此處可互換使用。根據(jù)本發(fā)明的DNA的功能 等價(jià)物是編碼多肽的分離的DNA片段，該多肽展示如在此處所定義的黑曲霉蛋白酶的特別 的功能。根據(jù)本發(fā)明的多肽的功能等價(jià)物是展示如在此處所定義的黑曲霉蛋白酶的至少一 個(gè)功能的多肽。功能蛋白質(zhì)或多肽等價(jià)物可僅含有選自SEQ ID NO 115 SEQ IDNO 171的序列 的一個(gè)和多個(gè)氨基酸的保守替代，或者非基本氨基酸的替代、插入或缺失。因此，非基本氨 基酸是可在選自SEQ IDN0:115 SEQ ID NO 171的序列中發(fā)生改變而不顯著改變生物 學(xué)功能的殘基。例如，在本發(fā)明的蛋白酶蛋白質(zhì)中保守的氨基酸殘基預(yù)計(jì)是特別不宜改變 的。此外，在根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶蛋白質(zhì)和其他蛋白酶中保守的氨基酸不大可能適宜進(jìn)行 改變。術(shù)語“保守替代”意指其中氨基酸殘基用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基置換的替代。 這些家族是本領(lǐng)域中公知的，且包括具有堿性側(cè)鏈(如賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、酸性側(cè) 鏈(如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電的極性側(cè)鏈(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇 氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙 氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β _分枝側(cè)鏈(如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(如酪 氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。功能性核酸等價(jià)物一般含有沉默突變或不改變所編碼多肽的生物學(xué)功能的突變。 因此，本發(fā)明提供了編碼蛋白酶蛋白質(zhì)的核酸分子，該蛋白質(zhì)含有對(duì)于具體生物學(xué)活性非
26關(guān)鍵性的氨基酸殘基的改變。這種蛋白酶蛋白質(zhì)與選自SEQ ID N0:115 SEQ ID NO 171 的序列在氨基酸序列中有差異，但仍然保留了至少一種生物學(xué)活性。在一個(gè)實(shí)施方案中， 分離的核酸分子包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其中該蛋白質(zhì)包含與在選自SEQ ID NO 115 SEQ ID NO :171的序列中顯示的氨基酸序列至少約60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同源性或更同源的基本同源的氨基酸序列。例如，關(guān)于如何制備表型沉默的氨基酸替代的指南在Bowie，J. U.等人，Science 247 1306-1310(1990)中提供，其中作者顯示有兩種主要的方法用于研究氨基酸序列對(duì)改 變的耐受性。第一種方法依賴于進(jìn)化過程，其中突變被自然選擇接受或者廢棄。第二種方 法利用基因工程以在克隆的基因的特定位置引入氨基酸變化，并選擇或篩選以鑒定維持功 能性的序列。如作者陳述的，這些研究揭示蛋白質(zhì)對(duì)于氨基酸替代具有令人驚訝的耐受性。 作者進(jìn)一步顯示在蛋白質(zhì)的某些位置何種變化可能是允許的。例如，大多數(shù)隱蔽的氨基酸 殘基要求非極性側(cè)鏈，而通常很少的表面?zhèn)孺湹奶卣魇潜Ｊ氐?。其他這種表型沉默的替代 描述于Bowie等人，見上及其引用的參考文獻(xiàn)中。編碼與選自SEQ ID N0:115 SEQ ID NO :171的蛋白質(zhì)同源的蛋白酶蛋白質(zhì)的分 離的核酸分子可通過向根據(jù)選自SEQ ID NO 1 SEQID NO 57的序列或選自SEQ ID NO 58 SEQ ID NO :114的序列的編碼核苷酸序列中引入一個(gè)或多個(gè)核苷酸替代、增加、或缺 失而形成，從而一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代、缺失或插入即引入到編碼的蛋白質(zhì)中。這種突變可 通過標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)引入，如定點(diǎn)誘變和PCR-介導(dǎo)的誘變。術(shù)語“功能等價(jià)物”也包含黑曲霉蛋白酶蛋白質(zhì)的直向同源物(orthologues)。黑 曲霉蛋白酶蛋白質(zhì)的直向同源物是可從其他品系或物種中分離并具有相似或相同的生物 學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這種直向同源物可易于鑒定為包含與選自SEQ ID N0:115 SEQ ID N0: 171的序列基本同源的氨基酸序列。如在此處所定義的，術(shù)語“基本同源”指第一個(gè)氨基酸或核苷酸序列含有足夠的或 最低數(shù)目的與第二個(gè)氨基酸或核苷酸序列相同或等價(jià)(如具有相似的側(cè)鏈)的氨基酸或 核苷酸，從而第一個(gè)和第二個(gè)氨基酸或核苷酸序列具有共同的結(jié)構(gòu)域。例如，含有具有約 60%、優(yōu)選地為65%、更優(yōu)選地為70%、更加優(yōu)選地為75%、80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%或99%或更多的一致性的共同結(jié)構(gòu)域的氨基酸或核苷酸序列在此處定義為足夠 相同。同樣，編碼其他蛋白酶家族成員的核酸在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，該核酸因而具有與 選自 SEQ ID NO :1 SEQ ID NO 57 的序列或選自 SEQ ID NO 58 SEQ ID NO 114 的序 列不同的核苷酸序列。此外，編碼來自其他物種的蛋白酶蛋白質(zhì)的核酸在本發(fā)明的范圍之 內(nèi)，該核酸因而具有與選自SEQ ID NO :1 SEQ ID NO 57的序列或選自SEQ IDNO 58 SEQ ID NO :114的序列不同的核苷酸序列。相應(yīng)于本發(fā)明的蛋白酶DNA的變體(如天然等位基因變體)和同系物的核酸分子 可基于其與在此處所公開的蛋白酶核酸的同源性而分離，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的雜交技術(shù)優(yōu)選在高度 嚴(yán)緊性雜交條件下用在此處所公開的cDNA或其適當(dāng)?shù)钠巫鳛殡s交探針。除蛋白酶序列的天然存在的等位基因變體之外，技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到可通過突變而 將變化引入到選自SEQ ID NO 1 SEQ ID NO 57的序列或選自SEQ ID NO 58 SEQ ID NO 114的序列的核苷酸序列中，借此導(dǎo)致蛋白酶蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的變化而不顯著
27改變蛋白酶蛋白質(zhì)的功能。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了改進(jìn)的蛋白酶蛋白質(zhì)。改進(jìn)的蛋白酶蛋白質(zhì)是其 中至少一種生物學(xué)活性得到改進(jìn)的蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)可通過在所有或部分的蛋白酶編碼 序列上隨機(jī)地引入突變而獲得，如通過飽和誘變，且可重組地表達(dá)結(jié)果所得的突變體并篩 選其生物學(xué)活性。例如，本領(lǐng)域提供了用于測(cè)量蛋白酶的酶活性的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定，因而可易于選 擇改進(jìn)的蛋白質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白酶蛋白質(zhì)具有根據(jù)選自SEQ IDN0:115 SEQ ID NO :171的序列的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶多肽與根據(jù)選自SEQ ID NO 115 SEQ ID NO :171的序列的氨基酸序列基本同源并保留根據(jù)選自SEQ ID N0:115 SEQ IDNO 171的序列的多肽的至少一個(gè)生物學(xué)活性，但由于天然的變異或上述的誘變而在
氨基酸序列中有差異。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白酶蛋白質(zhì)具有由分離的核酸片段編碼的氨基酸 序列，該分離的核酸片段能夠優(yōu)選在高度嚴(yán)緊性雜交條件下與根據(jù)選自SEQ ID NO :1 SEQ ID NO 57的序列或選自SEQID NO 58 SEQ ID NO 114的序列的核酸進(jìn)行雜交。因此，蛋白酶蛋白質(zhì)是包含與在選自SEQ ID N0:115 SEQ IDNO :171的序列中 顯示的氨基酸序列具有至少約 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%, 98%、99%或更大同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并保留了根據(jù)選自SEQ ID N0:115 SEQ IDNO 171的序列的多肽的至少一種功能活性。根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的功能等價(jià)物也可如通過篩選本發(fā)明蛋白質(zhì)的突變體如截 短的突變體的組合文庫的蛋白酶活性而進(jìn)行鑒定。在一個(gè)實(shí)施方案中，多樣的變體文庫通 過在核酸水平上的組合誘變而形成。多樣的變化文庫可通過如將合成的寡核苷酸混合物 酶促連接到基因序列中而產(chǎn)生，從而將潛在蛋白質(zhì)序列的一套簡(jiǎn)并組表達(dá)為單獨(dú)的多肽或 者一組較大的融合蛋白質(zhì)(如用于噬菌體展示)。有許多方法可用于從簡(jiǎn)并的寡核苷酸序 列中生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的潛在變體文庫。合成簡(jiǎn)并寡核苷酸的方法為本領(lǐng)域中公知(參 見如 Narang(1983) Tetrahedron39 3 ；Itakura 等人，(1984) Annu. Rev. Biochem. 53 323 ； Itakura 等人，(1984) Science 198 :1056 ;Ike 等人，(1983)Nucleic Acid Res. 11 :477)。此外，可將本發(fā)明多肽的編碼序列的片段文庫生成用于篩選后繼變體選擇的多樣 化多肽群體。例如，編碼序列片段的文庫可通過下述方法形成，在每個(gè)分子只發(fā)生約一次切 口(nicking)的條件下用核酸酶處理目標(biāo)編碼序列的雙鏈PCR片段、使該雙鏈DNA變性、使 DNA復(fù)性以形成可包括來自不同缺刻產(chǎn)物的有義/反義對(duì)的雙鏈DNA、通過用Sl核酸酶處 理從重構(gòu)的雙鏈體去除單鏈部分并將結(jié)果所得的片段連接入表達(dá)載體中。通過該方法，可 以得到編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的N-末端和多種大小的內(nèi)部片段的表達(dá)文庫。在本領(lǐng)域中已知有幾種技術(shù)用于從由截短突變的點(diǎn)突變制備的組合文庫篩選基 因產(chǎn)物，及從cDNA文庫篩選具有所選性質(zhì)的基因產(chǎn)物。適于高通量分析的篩選大基因文庫 的最廣泛使用的技術(shù)一般包括將基因文庫克隆入復(fù)制型表達(dá)載體中、用結(jié)果所得的載體文 庫轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)募?xì)胞和在一定條件下表達(dá)該組合基因，在該條件中對(duì)目的活性的探測(cè)促進(jìn)了 對(duì)編碼被探測(cè)基因產(chǎn)物的載體的分離。一種增強(qiáng)文庫中功能突變體頻率的技術(shù)，回歸整體 誘變(recursive ensemblemutagenesis) (REM)可與該篩選測(cè)定一起用于鑒定本發(fā)明蛋白 質(zhì)的變體(Arkin 和 Yourvan (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 :7811-7815 ；Delgrave 等人，(1993) Protein Engineering 6(3) :327_331)。除在選自SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :57的序列中顯示的蛋白酶基因序列之外，對(duì) 于本領(lǐng)域技術(shù)人員，顯而易見的是在給定的群體中可存在DNA序列多態(tài)現(xiàn)象，該多態(tài)現(xiàn)象 可導(dǎo)致蛋白酶蛋白質(zhì)中氨基酸序列的變化。這種遺傳多態(tài)現(xiàn)象可存在于來自不同群體的細(xì) 胞或由于天然等位基因變異的一個(gè)群體中的細(xì)胞內(nèi)。等位基因變異也可包括功能等價(jià)物。根據(jù)本發(fā)明的多肽的片段也可包含不編碼功能多肽的多核苷酸。這種多核苷酸可 發(fā)揮探針或PCR反應(yīng)的引物的功能。當(dāng)想要在具體生物體中破壞蛋白酶的功能活性時(shí)也可 用這種多核苷酸(基因敲除突變體)。根據(jù)本發(fā)明的核酸不論它們編碼功能性還是非功能性多肽，都可用作雜交探針 或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物。不編碼具有蛋白酶活性的多肽的本發(fā)明的核酸分子的用途 此外還包括(1)從例如來自除黑曲霉之外的生物體的cDNA文庫中分離編碼蛋白酶蛋白 質(zhì)的基因或其等位基因突變體；(2)對(duì)中期染色體擴(kuò)展的原位雜交(如FISH)以提供蛋 白酶基因在染色體中的精確定位，如描述于Verma等人，人染色體基本技術(shù)手冊(cè)(Human Chromosomes :a Manual of BasicTechniques)，Pergamon Press，New York(1988)中的方 法；(3) RNA印跡分析以在特定組織和/或細(xì)胞中探測(cè)蛋白酶mRNA的表達(dá)和(4)可用作診 斷工具的探針和引物以分析可與在給定的生物學(xué)(如組織)樣品中的蛋白酶探針雜交的核 酸是否存在。本發(fā)明同樣包含獲得蛋白酶基因或cDNA的功能等價(jià)物的方法。這種方法需要獲 得標(biāo)記的探針，該探針包括編碼根據(jù)選自SEQ IDN0:115 SEQ ID NO 171的序列或其變體 的全部或部分序列的分離的核酸或其變體；在探針與文庫中的核酸片段能夠雜交的條件下 用標(biāo)記的探針篩選核酸片段文庫，借此形成核酸雙鏈體，及從任何標(biāo)記的雙鏈體的核酸片 段制備全長(zhǎng)的基因序列以獲得與蛋白酶基因相關(guān)的基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶核酸與在選自SEQ IDNO :1 SEQ ID NO 57 的序列、選自SEQ ID N0:58 SEQ ID NO :114的序列或其補(bǔ)體序列的核酸序列具有至少 約 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%或更大的同源性。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶多肽與在選自SEQID N0:115 SEQ ID NO 171 序列的氨基酸序列具有至少約 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%, 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的同源性。宿主細(xì)胞在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明描述了含有本發(fā)明的核酸的細(xì)胞，如轉(zhuǎn)化的宿主細(xì) 胞或重組宿主細(xì)胞。“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”或“重組的細(xì)胞”是依靠重組DNA技術(shù)已向其中(或向 其祖先中)引入了根據(jù)本發(fā)明的核酸的細(xì)胞。這包括原核和真核細(xì)胞兩者，如細(xì)菌、真菌、 酵母等，尤其優(yōu)選來自絲狀真菌特別是黑曲霉的細(xì)胞?？蛇x擇調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)或以特定的所需方式修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì) 胞。這種對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的修飾(如糖基化)和加工(如切割)可促進(jìn)蛋白質(zhì)的最適功能發(fā) 揮。多種宿主細(xì)胞具有對(duì)蛋白質(zhì)和基因產(chǎn)物進(jìn)行翻譯后加工和修飾的特有的和特定 的機(jī)制。可選擇分子生物學(xué)和/或微生物學(xué)領(lǐng)域中技術(shù)人員熟悉的適當(dāng)細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)
29以確保對(duì)表達(dá)的外源蛋白質(zhì)進(jìn)行所需和正確的修飾和加工。為此目的，可使用對(duì)基因產(chǎn)物 進(jìn)行正確的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物加工、糖基化和磷酸化的真核宿主細(xì)胞。這種宿主細(xì)胞為本領(lǐng)域內(nèi) 眾所周知。宿主細(xì)胞也包括但不局限于哺乳動(dòng)物細(xì)胞系如CHO、VERO, BHK、HeLa, COS、MDCK, 293、3T3、WI38和脈絡(luò)叢細(xì)胞系。如果需要，根據(jù)本發(fā)明的多肽可通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系來生產(chǎn)。許多適合于哺乳 動(dòng)物細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的載體是公共可獲得的，構(gòu)建這種細(xì)胞系的方法也為公知技術(shù)，如在 Ausubel等人(見上)中所述?？贵w本發(fā)明進(jìn)一步描述了特異性結(jié)合根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶蛋白質(zhì)的抗體，如單克隆或 多克隆抗體。如在此處所用的，術(shù)語“抗體”(Ab)或“單克隆抗體”(Mab)指包括能夠特異性結(jié) 合蛋白酶蛋白質(zhì)的完整分子及抗體片段(如Fab和F(ab，)2片段)。Fab和F(ab，)2片段 缺乏完整抗體的Fc片段，在循環(huán)中可更快地清除，且可具有比完整抗體少的非特異性組織 結(jié)合(Wahl 等人，J. Nucl. Med. 24 :316_325 (1983))。因而，優(yōu)選這些片段。本發(fā)明的抗體可通過多種方法的任何一種來制備。例如，可將表達(dá)蛋白酶蛋白質(zhì) 或其抗原性片段的細(xì)胞施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)含有多克隆抗體的血清的生產(chǎn)。在一個(gè)優(yōu)選的方 法中，對(duì)蛋白酶蛋白質(zhì)制備物進(jìn)行制備和純化以使得其基本不含天然的污染物。然后將這 種制劑引入到動(dòng)物中以生產(chǎn)具有更高特異性活性的多克隆抗血清。在最優(yōu)選的方法中，本發(fā)明的抗體是單克隆抗體(或其蛋白酶蛋白質(zhì)結(jié)合片段)。 這種單克隆抗體可用雜交瘤技術(shù)制備(Kohler等人，Nature 256:495(1975) ；Kohler等 人，Eur. J. Immunol. 6 :511(1976) ；Hammerling 等人，In 單克隆抗體和 T-細(xì)胞雜交瘤 (Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas),Elsevier,N. Y. ,pp. 563-681(1981))。 通常，這種程序包括用蛋白酶蛋白質(zhì)抗原或用蛋白酶蛋白質(zhì)表達(dá)細(xì)胞對(duì)動(dòng)物(優(yōu)選地為小 鼠)進(jìn)行免疫接種。將這種小鼠的脾細(xì)胞提取并與適當(dāng)?shù)墓撬枇黾?xì)胞系進(jìn)行融合。根據(jù)本 發(fā)明可采用任何適當(dāng)?shù)墓撬枇黾?xì)胞系；然而，優(yōu)選采用親代骨髓瘤細(xì)胞系(SP2O),購自美國 模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection),Rockville,Maryland0 融合之 后，將結(jié)果所得的雜交瘤細(xì)胞選擇性地維持于HAT培養(yǎng)基上，然后通過限制性的稀釋來克 隆，如由Wands等人(Gastro-enterology 80 :225_232 (1981))所描述。然后將通過這種 選擇獲得的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定以鑒定分泌能夠結(jié)合蛋白酶蛋白質(zhì)抗原的抗體的克隆。通 常，該多肽可與載體蛋白質(zhì)如KLH偶聯(lián)，如Ausubel等人所述，見上，與佐劑混合，并注射到 宿主哺乳動(dòng)物中。具體而言地，多種宿主動(dòng)物可通過對(duì)目標(biāo)多肽的注射而進(jìn)行免疫接種。適當(dāng)?shù)乃?主動(dòng)物的例子包括兔、小鼠、豚鼠和大鼠。依賴于宿主物種，多種佐劑可用于增加免疫反應(yīng)， 該佐劑包括但不局限于弗氏(完全和不完全的)、佐劑礦質(zhì)膠如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)如 溶血卵磷脂、聚多醇、聚陰離子、肽、油乳化劑、匙孔血藍(lán)蛋白、二硝基苯酚、BCG(卡介苗)和 小棒桿菌(Corybebacterium parvum)。多克隆抗體是源自免疫接種動(dòng)物的血清的抗體分子 的異源群體。這種抗體可為包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD的任何免疫球蛋白種類及其亞類。生
30產(chǎn)本發(fā)明的mAb的雜交瘤可在體外或在體內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。一旦生產(chǎn)了，即用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在免疫測(cè)定如蛋白質(zhì)印跡或免疫沉淀分析中檢驗(yàn)多克 隆或單克隆抗體對(duì)蛋白酶多肽或其功能等價(jià)物的特異性識(shí)別，如Ausubel等人描述，見上。 特異性結(jié)合蛋白酶蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)物的抗體可用于本發(fā)明中。例如，這種抗體可用于 免疫測(cè)定中以探測(cè)致病或非致病曲霉菌種中的蛋白酶(如在曲霉提取物中)。優(yōu)選，本發(fā)明的抗體用蛋白酶多肽的片段生產(chǎn)，該片段以例如高頻率出現(xiàn)帶電殘 基的標(biāo)準(zhǔn)可能顯示為具有抗原性。例如，這種片段可通過標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)生成，然后克隆入 PGEX表達(dá)載體中(Ausubel等人，見上)。然后融合蛋白質(zhì)可在大腸桿菌中表達(dá)，并用谷胱 甘肽瓊脂糖親和基質(zhì)進(jìn)行純化，如Ausubel等人描述，見上。如果想要，對(duì)每一蛋白質(zhì)可生 成幾個(gè)(如兩個(gè)或三個(gè))融合，且每個(gè)融合可注射入至少兩個(gè)兔中?？寡蹇赏ㄟ^一系列 的注射而引起，一般包括至少三次加強(qiáng)注射。一般地，檢測(cè)抗血清免疫沉淀重組蛋白酶多肽 或其功能等價(jià)物的能力，而不相關(guān)的蛋白質(zhì)可充當(dāng)免疫反應(yīng)特異性的對(duì)照?；蛘撸刹捎盟龅膯捂溈贵w生產(chǎn)技術(shù)(美國專利4，946，778和4，704，692)生產(chǎn) 抗蛋白酶多肽或其功能等價(jià)物的單鏈抗體。生成和篩選噬菌體展示文庫的試劑盒可購自如 Pharmacia。此外，具體適于生成和篩選抗體展示文庫的方法和試劑可見如美國專利 No. 5,223,409 ;PCT 公開文本 No. WO 92/18619 ;PCT 公開文本 No. WO 91/17271 ;PCT 公開 文本 No. WO 20791 ；PCT 公開文本 No. WO 92/20791 ；PCT 公開文本 No. WO 92/15679 ；PCT 公 開文本 No. WO 93/01288 ;PCT 公開文本 No. WO 92/01047 ;PCT 公開文本 No. WO 92/09690 ； PCT 公開文本 No. WO 90/02809 ；Fuchs 等人(1991) Bio/Technology 9 1370-1372 ；Hay 等 人(1992)Hum. Antibod. Hybridomas 3 :81_85 ；Huse 等人(1989) Science 246 1275-1281 ； Griffiths 等人(1993) EMBO J. 12 :725_734?？蓪⑻禺愋越Y(jié)合蛋白酶多肽或其功能等價(jià)物的多克隆和單克隆抗體用于如探測(cè) 蛋白酶基因或其如在曲霉屬其他菌種中的功能等價(jià)物的表達(dá)。例如，蛋白酶多肽可易于在對(duì)曲霉屬細(xì)胞或提取物的常規(guī)測(cè)定中探測(cè)。適當(dāng)?shù)奶?測(cè)的例子非限制性地包括蛋白質(zhì)印跡、ELISA、放射免疫測(cè)定等?！疤禺愋缘亟Y(jié)合”意思指抗體識(shí)別并結(jié)合特別的抗原，如蛋白酶多肽，但基本不識(shí) 別且不結(jié)合樣品中其他無關(guān)的分子?？贵w可通過如親和層析方法進(jìn)行純化，其中多肽抗原固定于樹脂上?？蓪⒖贡景l(fā)明多肽的抗體(如單克隆抗體)用于以標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離多肽，如親和層 析或免疫沉淀。此外，這種抗體可用于探測(cè)蛋白質(zhì)(如在細(xì)胞裂解液或細(xì)胞上清夜中)以 估計(jì)多肽表達(dá)的豐富程度和模式。也可將抗體作為臨床檢驗(yàn)程序的一部分而診斷性地用于 監(jiān)控細(xì)胞或組織中的蛋白質(zhì)水平，以確定如給定治療法或在曲霉病診斷中的效率?？赏ㄟ^使抗體與可探測(cè)的物質(zhì)偶聯(lián)而促進(jìn)探測(cè)。可探測(cè)的物質(zhì)的例子包括多種 酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料和放射性材料。適當(dāng)?shù)拿傅睦影ɡ备^ 氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；適當(dāng)?shù)臒晒獠牧系睦影▊阈?酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三吖嗪胺(dichlorotriazinylamine)熒光素、 丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料的例子包括魯米諾；生物發(fā)光材料的例子包括螢光素酶、 螢光素和水母發(fā)光蛋白；適當(dāng)?shù)姆派湫圆牧系睦影?25I、131I、35S或3H。
由抗原性肽包含的優(yōu)選的抗原決定部位位于蛋白質(zhì)的表面區(qū)域，如親水性區(qū)域。 本發(fā)明蛋白質(zhì)的疏水性圖可用于鑒定親水性區(qū)域。本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗原性肽包含選自SEQ ID NO 115 SEQ IDNO 171的序列的氨基酸序列中至少7 (優(yōu)選地為10、15、20或30)個(gè) 連續(xù)的氨基酸殘基，且包含蛋白質(zhì)的抗原決定部位，從而抗該肽的抗體與該蛋白質(zhì)形成特 異性的免疫復(fù)合物。由抗原性肽包含的優(yōu)選的抗原決定部位位于蛋白質(zhì)的表面蛋白酶的區(qū)域，如親水 區(qū)域、疏水區(qū)域、α區(qū)域、β區(qū)域、螺旋(coil)區(qū)域、轉(zhuǎn)角(turn)區(qū)域和可動(dòng)(flexible) 區(qū)域。免疫測(cè)定對(duì)生物學(xué)樣品中根據(jù)本發(fā)明的多肽的定性或定量確定可用任何本領(lǐng)域公知的方 法來進(jìn)行?；诳乖募夹g(shù)對(duì)于測(cè)定生物學(xué)樣品中特定的多肽水平提供了特殊的優(yōu)點(diǎn)。其中，特異性識(shí)別由初級(jí)抗體(多克隆或單克隆的)提供，但次級(jí)探測(cè)系統(tǒng)可利用 熒光、酶或其他綴合的次級(jí)抗體。結(jié)果，獲得了免疫復(fù)合物。因此，本發(fā)明提供了診斷某個(gè)生物體是否感染了曲霉病的方法，該方法包含以下 步驟 從該疑似感染了曲霉病的生物體中分離生物學(xué)樣品， 使該生物學(xué)樣品與根據(jù)本發(fā)明的抗體進(jìn)行反應(yīng)， 確定是否形成免疫復(fù)合物。也可用尿素和中性去污劑提取組織以釋放用于蛋白質(zhì)印跡或斑點(diǎn)/狹線測(cè)定的 蛋白質(zhì)。該技術(shù)也可應(yīng)用于體液。其他基于抗體的探測(cè)蛋白酶基因表達(dá)的方法包括免疫測(cè)定，如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (ELISA)和放射免疫測(cè)定(RIA)。例如，可將對(duì)蛋白酶特異的單克隆抗體用作免疫吸附劑和 酶標(biāo)記的探針兩者以對(duì)蛋白酶蛋白質(zhì)進(jìn)行探測(cè)和定量。存在于樣品中的蛋白酶蛋白質(zhì)的量 可用線性回歸計(jì)算機(jī)算法參考標(biāo)準(zhǔn)制劑中的存在量來進(jìn)行計(jì)算。在另一個(gè)ELISA測(cè)定中， 可將兩個(gè)不同的特異性單克隆抗體用于在生物學(xué)液體中探測(cè)蛋白酶蛋白質(zhì)。在該測(cè)定中， 抗體之一用作免疫吸附劑而另一個(gè)用作酶標(biāo)記的探針。上述技術(shù)基本可作為“一步”或“兩步”測(cè)定來進(jìn)行。“一步”測(cè)定包括使蛋白酶蛋 白質(zhì)與固定的抗體接觸，并不經(jīng)洗滌，使混合物與標(biāo)記的抗體接觸?！皟刹健睖y(cè)定在使混合物 與標(biāo)記的抗體接觸前包括洗滌。其他的常規(guī)方法也可適當(dāng)?shù)夭捎?。通常將測(cè)定系統(tǒng)的一種 成分固定在支持體上，借此使得系統(tǒng)的其他成分能夠與該成分接觸，而易于從樣品中去除。適當(dāng)?shù)拿笜?biāo)記包括如那些來自氧化酶組的，其通過與底物反應(yīng)催化過氧化氫的產(chǎn) 生。氧化酶標(biāo)記的活性可通過測(cè)量由酶標(biāo)記的抗體/底物反應(yīng)形成的過氧化氫的濃度來測(cè) 定。除酶之外，其他適當(dāng)?shù)臉?biāo)記包括放射性同位素，如碘(1251、1211)、碳(14C)、硫(35S)、 氚(3H)、銦(112In)和锝(99mTc),和熒光標(biāo)記，如熒光素和羅丹明，和生物素。例如，檢驗(yàn)化合物與蛋白酶多肽的特異性結(jié)合可在體外通過可逆地或不可逆地將 蛋白酶多肽固定在基質(zhì)上而進(jìn)行探測(cè)，該基質(zhì)如96-孔的聚苯乙烯微量滴定板的一個(gè)孔的 表面。固定多肽或其他小分子的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，可通過向每一個(gè)孔添加 溶液中的多肽(一般地，以0. 05 lmg/ml的濃度，在1-100 μ 1體積中)而用蛋白酶多肽覆蓋微量滴定板，并于室溫至37°C將平板溫育0. 1 36小時(shí)。未結(jié)合到平板上的多肽可 通過將多余的溶液從平板上振蕩除去，然后用水或緩沖液洗滌平板(一次或重復(fù)地)。一 般地，多肽包含于水或緩沖液中。然后用缺乏結(jié)合的多肽的緩沖液洗滌平板。為了阻斷平 板上的自由蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，將平板用與結(jié)合的多肽無關(guān)的蛋白質(zhì)進(jìn)行封閉。例如，300μ 1 Tris-HCl中的濃度為2mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)是適當(dāng)?shù)?。適當(dāng)?shù)幕|(zhì)包括那些含有 確定的交聯(lián)化學(xué)物質(zhì)的基質(zhì)(如塑料基質(zhì)，如購自Corning Costar Corp. (Cambridge,ΜΑ) 的聚苯乙烯、苯乙烯或聚丙烯基質(zhì))。如果需要，可將珠狀顆粒用作基質(zhì)，如珠狀瓊脂糖或珠 狀瓊脂糖凝膠。檢驗(yàn)化合物與根據(jù)本發(fā)明的多肽的結(jié)合可通過多種本領(lǐng)域公知的方法來探測(cè)。例 如，特異性抗體可用于免疫測(cè)定中。如果需要，可將抗體進(jìn)行標(biāo)記(如熒光物質(zhì)或用放射性 同位素)并直接探測(cè)(參見如West和McMahon，J. Cell Biol. 74 :264，1977)?；蛘撸蓪?次級(jí)抗體用于探測(cè)(如結(jié)合抗-AN97抗體的Fc部分的標(biāo)記抗體)。在另一種探測(cè)方法中， 將蛋白酶多肽進(jìn)行標(biāo)記并探測(cè)該標(biāo)記(如通過用放射性同位素、熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)等標(biāo)記蛋 白酶多肽)。在另外一個(gè)方法中，蛋白酶多肽作為與可光學(xué)探測(cè)的蛋白質(zhì)如綠色熒光蛋白 質(zhì)(該蛋白質(zhì)可在紫外光下探測(cè))的融合蛋白質(zhì)而生產(chǎn)。在另一個(gè)方法中，蛋白酶多肽可 共價(jià)地連接到具有可探測(cè)的酶活性的酶或與之融合，該酶如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、 a-半乳糖苷酶或葡萄糖氧化酶。編碼所有這些酶的基因均已克隆，且是本領(lǐng)域技術(shù)人員可 易于獲得并使用。如果需要，融合蛋白質(zhì)可包括抗原，且這種抗原可用常規(guī)方法以多克隆或 單克隆抗體進(jìn)行探測(cè)和測(cè)量。適當(dāng)?shù)目乖?如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和a-半 乳糖苷酶)和非酶多肽(如血清蛋白質(zhì)如BSA和球蛋白，和乳汁蛋白質(zhì)如酪蛋白)?？乖瓫Q定部位、抗原和免疫原在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了肽或多肽，該肽或多肽包含本發(fā)明的多肽具有抗原 決定部位的部分。該多肽部分的抗原決定部位是本發(fā)明多肽的免疫原性或抗原性抗原決定 部位?！懊庖咴钥乖瓫Q定部位”定義為當(dāng)整個(gè)蛋白質(zhì)是免疫原時(shí)可引起抗體反應(yīng)的蛋白質(zhì) 的一部分。人們認(rèn)為這些免疫原性抗原決定部位限制在分子的少數(shù)位置上。另一方面，抗 體可結(jié)合的蛋白質(zhì)分子上的一個(gè)區(qū)域定義為“抗原性抗原決定部位”。蛋白質(zhì)中免疫原性抗 原決定部位的數(shù)目通常小于抗原性抗原決定部位的數(shù)目。參見如GeySen，H.M.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :3998_4002(1984)。至于具有抗原性抗原決定部位的肽或多肽(即含有抗體可結(jié)合的蛋白質(zhì)分子 區(qū)域)的選擇，本領(lǐng)域眾所周知的是模擬蛋白質(zhì)序列部分的相對(duì)短的合成肽通常能夠引 起與被部分模擬的蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗血清。參見如Sutcliffe，J.G.等人，Science 219 660-666(1984)。能夠引起蛋白質(zhì)反應(yīng)性血清的多肽通常描述為蛋白質(zhì)的一級(jí)序列，可通過 一組簡(jiǎn)單的化學(xué)原則進(jìn)行特征記述，且既不限制于完整蛋白質(zhì)的免疫顯性區(qū)域(即免疫原 性抗原決定部位)也不限制于氨基或羧基末端。極度疏水的和那些具有6個(gè)或更少殘基 的肽通常在誘導(dǎo)與被模擬蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體時(shí)無效；較長(zhǎng)的可溶性肽，尤其是那些含有脯 氨酸殘基的肽通常有效。Sutcliffe等人，見上。例如，根據(jù)這些指南設(shè)計(jì)的20個(gè)肽中的 18個(gè)誘導(dǎo)了與HAI蛋白質(zhì)或完整病毒反應(yīng)的抗體，該肽含有覆蓋了流感病毒(influenza virus)血凝素HAI多肽鏈序列的75%的8_39個(gè)殘基；來自MuLV聚合酶的12/12肽和來自 狂犬病糖蛋白的18/18誘導(dǎo)了沉淀相應(yīng)蛋白質(zhì)的抗體。
因此具有抗原性抗原決定部位的本發(fā)明的肽和本發(fā)明的多肽可用于引起特異性 結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體，包括單克隆抗體。因而，通過用具有抗原性具有抗原決定部位的肽 進(jìn)行免疫接種的供體的脾細(xì)胞融合獲得的雜交瘤中高百分比部分通常分泌與活性蛋白質(zhì) 反應(yīng)的抗體。見上Sutcliffe等人，在663頁所述。具有由抗原性抗原決定部位的肽或多 肽引起的抗體可用于探測(cè)被模擬的蛋白質(zhì)，且針對(duì)不同肽的抗體可用于追蹤蛋白質(zhì)前體的 多個(gè)區(qū)域的命運(yùn)，該蛋白質(zhì)前體經(jīng)歷了翻譯后加工。肽和抗肽的抗體可用于對(duì)所模擬的蛋 白質(zhì)進(jìn)行的多種定性或定量測(cè)定，例如競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定，這是因?yàn)橐扬@示即使短肽(如約9個(gè)氨 基酸)也可在免疫沉淀測(cè)定中結(jié)合和替代較長(zhǎng)的肽。參見如Wilson，I. A.等人，Cell 37: 767-778在777頁(1984)。本發(fā)明的抗肽的抗體也可用于純化所模擬的蛋白質(zhì)，例如通過 用本領(lǐng)域眾所周知的方法進(jìn)行的吸附層析。根據(jù)上述指南設(shè)計(jì)的具有抗原性抗原決定部位本發(fā)明的肽和多肽優(yōu)選含有至少7 個(gè)，更優(yōu)選至少9個(gè)且最優(yōu)選約15 約30個(gè)氨基酸的序列，該序列包含于本發(fā)明的多肽的 氨基酸序列中。然而，包含本發(fā)明的多肽的較大部分氨基酸序列的、含有約30 約50個(gè)氨 基酸或任何長(zhǎng)度直至達(dá)到包括本發(fā)明的多肽的全部氨基酸序列的多肽也被認(rèn)為是具有抗 原決定部位本發(fā)明的肽和多肽，且也可用于誘導(dǎo)與所模擬的蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體。優(yōu)選，選擇 具有抗原決定部位的肽的氨基酸序列以提供在水溶劑中的基本溶解性(即該序列包括相 對(duì)親水的殘基且優(yōu)選避免高度疏水的序列)；且含有脯氨酸殘基的序列特別優(yōu)選。具有抗原決定部位的本發(fā)明肽和多肽可通過任何制備肽或多肽的常規(guī)方法來生 產(chǎn)，該方法包括利用本發(fā)明的核酸分子的重組方法。例如，可將短的具有抗原決定部位的氨 基酸序列與較長(zhǎng)的多肽融合，該較長(zhǎng)的多肽在重組生產(chǎn)和純化過程中充當(dāng)載體，及在免疫 接種過程中用于生產(chǎn)抗肽的抗體。具有抗原決定部位的肽也可用化學(xué)合成的已知方法來合成。例如，Houghten已描 述了合成許多肽的簡(jiǎn)單方法，如10-20mg的248個(gè)不同的13個(gè)殘基的肽，該肽代表了 HAI 多肽的片段的單氨基酸變體，可在少于4個(gè)星期內(nèi)制備并進(jìn)行表征(通過ELISA-類型結(jié)合 研究)。Houghten，R.A.，Proc. Natl .Acad. Sci .USA 82:5131-5135(1985)。該“同時(shí)多個(gè)多 肽合成(Simultaneous MultipleP印tide Synthesis (SMPS) ” 方法進(jìn)一步描述于 Houghten 等人(1986)的美國專利No. 4，631，211中。在該程序中，固相合成多種肽的單獨(dú)的樹脂包 含于單獨(dú)的具有溶劑可透過性的包中，從而使得固相方法中包含的許多相同的重復(fù)步驟的 實(shí)現(xiàn)最適使用。手工程序能夠同時(shí)進(jìn)行500-1000或更多的合成。Houghten等人，見上，在5134頁。具有抗原決定部位本發(fā)明的肽和多肽可用于根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法來誘導(dǎo) 抗體。參見如Sutcliffe等人，見上；Wilson等人，見上；Chow, Μ.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 910-914 ；和 Bittle, F. J.等人，J. Gen. Virol. 66 :2347_2354 (1985)。通常，可用游離肽對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫接種；然而抗肽抗體的效價(jià)可通過使肽與大分 子載體偶聯(lián)而強(qiáng)化，如匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)或破傷風(fēng)類毒素。例如，含有半胱氨酸的肽可用 連接體如順丁二烯酰亞胺苯-N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)與載體偶聯(lián)，而其他的肽可用更 通常的連接劑如戊二醛與載體偶聯(lián)。動(dòng)物如兔、大鼠和小鼠用游離的或載體偶聯(lián)的肽進(jìn)行免疫接種，如通過腹膜內(nèi)和/
34或皮內(nèi)注射含有約100 μ g肽或載體蛋白質(zhì)和弗氏佐劑的乳劑。需要進(jìn)行間隔例如約2個(gè) 星期的幾次強(qiáng)化注射以提供抗肽抗體的有用效價(jià)，該抗體可由如ELISA測(cè)定用吸附到固體 表面的自由肽進(jìn)行探測(cè)。來自免疫接種的動(dòng)物血清的抗肽抗體的效價(jià)可通過對(duì)抗肽抗體的 選擇而增加，如通過將肽吸附到固體支持體上，及根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法洗脫所選的 抗體。本發(fā)明的具有免疫原性具有抗原決定部位的肽根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行鑒定， 該肽即蛋白質(zhì)的那些當(dāng)完整的蛋白質(zhì)是免疫原時(shí)可引起抗體反應(yīng)的部分。例如，Geysen等 人，1984，見上公開了在固體支持體上快速同時(shí)合成數(shù)百個(gè)肽的程序，該肽具有在酶聯(lián)免疫 吸附測(cè)定反應(yīng)的足夠純度。然后不將合成的肽與抗體從支持體上去除而探測(cè)其相互作用。 在這種方式中，具有所需蛋白質(zhì)免疫原性抗原決定部位的肽可常規(guī)地由本領(lǐng)域的技術(shù)人員 進(jìn)行鑒定。例如，口蹄疫病毒(foot-and-mouth virus)的包膜蛋白中免疫學(xué)重要的抗原決 定部位由Geysen等人以7個(gè)氨基酸的精確度進(jìn)行了定位，這是通過合成所有208個(gè)可能的 六肽的重疊組而實(shí)現(xiàn)的，該重疊組覆蓋了本發(fā)明的全部213個(gè)氨基酸序列。更進(jìn)一步地，Geysen (1990)的美國專利No. 5，194，392描述了探測(cè)或確定單體(氨 基酸或其他化合物)序列的一般方法，該單體是與目標(biāo)抗體的特它抗原互補(bǔ)位(抗原結(jié)合 位點(diǎn))互補(bǔ)的抗原決定部位(即“mimotope”)的拓?fù)涞葍r(jià)物。更一般地，Geysen(1989)的 美國專利No. 4，433，092描述了探測(cè)或確定單體序列的方法，該單體是與特定目標(biāo)受體的 配體結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)的配體的拓?fù)鋱D等價(jià)物。類似地，Houghten，R.A.等人(1996)的關(guān)于過 烷基化的寡肽混合物的美國專利No. 5，480，971公開了線形C1-C7-烷基過烷基化的寡肽和 這種肽的群組和文庫，以及利用這種寡肽組和文庫確定優(yōu)選與目標(biāo)受體分子結(jié)合的過烷基 化的寡肽的序列的方法。因而，本發(fā)明具有抗原決定部位的肽的非肽類似物也可用這些方 法常規(guī)制備。蛋白酶活性的去除或減少本發(fā)明也涉及生產(chǎn)親代細(xì)胞的突變細(xì)胞的方法，該方法包含破壞或缺失編碼蛋白 酶的核酸序列或其控制序列，這樣導(dǎo)致的生產(chǎn)較親代細(xì)胞少的蛋白酶。具有減少的蛋白酶活性的品系的構(gòu)建可常規(guī)地通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白酶活性表達(dá)所 必需的核酸序列的修飾和失活而實(shí)現(xiàn)。要修飾或失活的核酸序列可為如編碼對(duì)于展示蛋白 酶活性是關(guān)鍵的蛋白酶或其部分的核酸序列，或者為具有調(diào)節(jié)功能的核酸序列，其是蛋白 酶從核酸序列的編碼序列中表達(dá)所必需的。這樣一種調(diào)節(jié)或控制序列的例子可為啟動(dòng)子序 列或其功能部分，即足以影響蛋白酶表達(dá)的部分?？赡苄揎椀钠渌刂菩蛄邪ǖ痪窒?于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號(hào)序列和終止位點(diǎn)。核酸序列的修飾或失活可通過對(duì)細(xì)胞進(jìn)行誘變并選擇其中蛋白酶生產(chǎn)能力減少 或消除的細(xì)胞而完成。特定的或隨機(jī)的誘變可通過如使用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)誘變劑、使用 適當(dāng)?shù)墓押塑账峄蛘邔?duì)DNA序列進(jìn)行PCR生成的誘變而完成。此外，誘變可用這些誘變劑 的任何組合進(jìn)行。適合于本目的的物理或化學(xué)誘變劑的例子包括紫外線(UV)照射、羥胺、 N-甲基-N，-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、ο-甲基羥胺、亞硝酸、甲基磺酸乙酯(EMS)、亞硫 酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。當(dāng)使用這些藥劑藥劑時(shí)，誘變一般通過在適當(dāng)?shù)臈l件下在所 選誘變劑存在時(shí)將要誘變的細(xì)胞進(jìn)行溫育而進(jìn)行，并選擇展示減少的或無蛋白酶活性表達(dá) 的細(xì)胞。
本發(fā)明蛋白酶生產(chǎn)的修飾或失活可通過在編碼蛋白酶或其轉(zhuǎn)錄或翻譯所必需的 調(diào)節(jié)元件的核酸序列中引入、替代或去除一個(gè)或多個(gè)核苷酸而進(jìn)行。例如，可將核苷酸插入 或去除，從而導(dǎo)致終止密碼子的引入、起始密碼子的去除或可讀框的改變。這種修飾或失活 可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法通過定點(diǎn)誘變或PCR生成的誘變而實(shí)現(xiàn)。盡管原則上修飾可在體內(nèi)進(jìn)行，即直接在表達(dá)要修飾的核酸序列的細(xì)胞上，但優(yōu) 選如下面所示范地在體外進(jìn)行修飾。由宿主細(xì)胞的選擇失活或減少生產(chǎn)的方便途徑的例子基于基因替代或基因中斷。 例如，在基因中斷方法中，將相應(yīng)于內(nèi)源基因或目標(biāo)基因片段的核酸序列在體外誘變以產(chǎn) 生缺陷的核酸序列，然后將該核酸序列轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞以產(chǎn)生缺陷的基因。通過同源重組， 缺陷型核酸序列替代了內(nèi)源基因或基因片段。缺陷型基因或基因片段最好也編碼標(biāo)記，該 標(biāo)記可用于選擇轉(zhuǎn)化體，在該轉(zhuǎn)化體中編碼蛋白酶的基因已被修飾或破壞。或者，編碼本發(fā)明蛋白酶的核酸序列的修飾或失活可通過已確立的反義技術(shù)用與 蛋白酶編碼序列互補(bǔ)的核苷酸序列來進(jìn)行。更具體地，細(xì)胞的蛋白酶生產(chǎn)可通過引入與編 碼蛋白酶的核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列而減少或消除，該核苷酸序列可在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄并能 夠與細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的蛋白酶mRNA進(jìn)行雜交。在互補(bǔ)的反義核苷酸序列能夠與蛋白酶mRNA雜 交的條件下，翻譯的蛋白酶的量則減少或消除了。優(yōu)選依照本發(fā)明的方法要修飾的細(xì)胞來源于微生物，如適合于所需蛋白質(zhì)產(chǎn)物生 產(chǎn)的真菌菌種，該蛋白質(zhì)產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞是同源的或異源的。本發(fā)明進(jìn)一步涉及親代細(xì)胞的突變細(xì)胞，該細(xì)胞包含編碼蛋白酶或其控制序列的 核酸序列的破壞或缺失，這樣導(dǎo)致的突變細(xì)胞生產(chǎn)較親代細(xì)胞少的蛋白酶。這樣形成的蛋白酶缺陷突變細(xì)胞特別用于表達(dá)同源和/或異源多肽的宿主細(xì)胞。 因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)同源或異源多肽的方法，該方法包含(a)在有利于多肽生產(chǎn) 的條件下培養(yǎng)突變細(xì)胞；和(b)回收多肽。在現(xiàn)有情況下術(shù)語“異源多肽”在此處定義為對(duì) 于宿主細(xì)胞是非天然的多肽、在其中已進(jìn)行修飾而改變了天然序列的天然蛋白質(zhì)或其表達(dá) 已通過重組DNA技術(shù)對(duì)宿主細(xì)胞的操作而被改變數(shù)量改變的天然蛋白質(zhì)。本發(fā)明生產(chǎn)基本不含蛋白酶的產(chǎn)物的方法對(duì)真核多肽的生產(chǎn)具有特別的重要性， 特別是真菌蛋白質(zhì)如酶。蛋白酶缺陷型細(xì)胞也可用于表達(dá)在食品工業(yè)中具有重要性的或者 具有制藥重要性的異源蛋白質(zhì)。蛋白酶在工業(yè)過程中的用途本發(fā)明也涉及根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶在許多選擇的工業(yè)和制藥過程中的用途。盡管 在這些過程中獲得了長(zhǎng)期的經(jīng)驗(yàn)，但根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶與現(xiàn)在使用的酶相比具有許多顯 著的優(yōu)點(diǎn)。依賴于特定的應(yīng)用，這些優(yōu)點(diǎn)可包括如較低的生產(chǎn)成本、較高的底物特異性、較 低的抗原性、較低的不利副作用、當(dāng)在適當(dāng)?shù)奈⑸镏猩a(chǎn)時(shí)較高的產(chǎn)量、更適當(dāng)?shù)腜H和 溫度范圍、更好的終產(chǎn)物味道及食品等級(jí)和適合方面等方面。在食品或飼料生產(chǎn)的大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用中，蛋白水解酶通常用于改進(jìn)以下方面，如 蛋白質(zhì)溶解性、提取物產(chǎn)量、粘性或味道、質(zhì)地、營養(yǎng)價(jià)值、抗原性或不利營養(yǎng)的因素的最小 化、顏色或功能性及加工方面如蛋白質(zhì)原材料的濾過性。在這些應(yīng)用中，蛋白質(zhì)原材料可為 動(dòng)物或植物來源，且例子包括植物蛋白質(zhì)如大豆蛋白質(zhì)、小麥谷蛋白、油菜籽蛋白質(zhì)、豌豆 蛋白質(zhì)、苜蓿蛋白質(zhì)、向日葵蛋白質(zhì)、蠶豆?fàn)疃沟鞍踪|(zhì)、棉花或芝麻籽蛋白質(zhì)、玉米蛋白質(zhì)、
36大麥蛋白質(zhì)、高粱蛋白質(zhì)、馬鈴薯蛋白質(zhì)、水稻蛋白質(zhì)、咖啡蛋白質(zhì)，和源自動(dòng)物的蛋白質(zhì)如 乳汁蛋白質(zhì)(如酪蛋白、乳清蛋白質(zhì))、蛋清、魚蛋白質(zhì)、肉類蛋白質(zhì)包括明膠、膠原蛋白、血 液蛋白質(zhì)(如血紅蛋白)、毛發(fā)、羽毛和魚肉。根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶的一個(gè)重要方面是它們覆蓋了理想地適合于多種應(yīng)用的pH 和溫度的整個(gè)最適值范圍。例如許多大規(guī)模過程受益于50攝氏度或更高的相對(duì)高的加工 溫度以控制微生物感染的危險(xiǎn)。根據(jù)本發(fā)明的幾個(gè)蛋白酶符合該需要，但同時(shí)它們不展示 極度的熱穩(wěn)定性，從而它們可忍受額外熱處理使酶失活的嘗試。后一個(gè)特性使得到終產(chǎn)物 的生產(chǎn)途徑無殘留的蛋白水解活性。相似地，許多飼料和食品產(chǎn)品具有微酸性的PH值，從 而對(duì)于它們的加工，酸性或接近中性PH值的蛋白酶是優(yōu)選的。根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶也符合 該需要。內(nèi)切蛋白酶的特異性通常根據(jù)分別在位置Pl的氨基酸殘基的羧基和位置ΡΓ的 殘基的氨基基團(tuán)之間的鍵的優(yōu)選切割而定義。該優(yōu)選性可以主要以Pi(如胰蛋白酶底物中 帶正電荷的殘基)、ΡΓ (如在由嗜熱芽孢菌蛋白酶切割中的疏水殘基)或Pl和Ρ2兩者(如 由腎上腺髓質(zhì)內(nèi)切蛋白酶在兩個(gè)帶正電荷殘基間的特異性切割)為條件。在一些情況下， 更遠(yuǎn)的殘基可確定切割優(yōu)選性，如Ρ2對(duì)于鏈球菌肽酶Α。已知一些殘基對(duì)切割有負(fù)影響； 眾所周知的是脯氨酸在位置ΡΓ的鍵對(duì)于許多蛋白酶的作用有抗性。大多數(shù)內(nèi)切蛋白酶優(yōu) 選地在疏水環(huán)境或在帶負(fù)電荷的殘基附近進(jìn)行切割。例如，工業(yè)上可獲得的內(nèi)切蛋白酶如 胰凝乳蛋白酶(從牛胰腺中獲得)或枯草桿菌蛋白酶、中性金屬蛋白酶或嗜熱芽孢菌蛋白 酶(均從芽孢桿菌屬菌種中獲得)傾向于偏愛在疏水氨基酸如-Phe、-LeU和-Tyr “之后” 切割。其他工業(yè)上可獲得的內(nèi)切蛋白酶為優(yōu)選在-Arg和-Lys之后切割的胰蛋白酶(從牛 胰腺中獲得)和優(yōu)選在-Arg之后切割的木瓜蛋白酶(多種酶的復(fù)雜混合物，包括從番木瓜 果中獲得的蛋白酶)。相反，由小殘基如Ala、Gly、Ser、Thre及Ile和Pro形成的肽鍵是弱 的底物(Keil，B 等人；Protein Seq Data Anal (1993) 5 :401_407)。該狀態(tài)對(duì)于制藥、食品 和飲料、農(nóng)業(yè)及甚至化學(xué)工業(yè)都有深刻的意義。根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶展示了不尋常的切割 優(yōu)選性。外肽酶僅在靠近多肽鏈末端處作用。那些在自由N-末端的作用釋放了單個(gè)氨基 酸殘基(所謂的氨肽酶)或二肽或三肽(所謂的二肽基肽酶和三肽基肽酶)。那些在自由 C-末端的作用釋放了單個(gè)殘基(所謂的羧肽酶)或二肽(所謂的肽基二肽酶)。羧肽酶在 其催化機(jī)制的基礎(chǔ)上分為3組，即絲氨酸型羧肽酶、金屬羧肽酶和半胱氨酸型羧肽酶。其他 的外肽酶對(duì)于二肽是特異性的(所謂的二肽酶)或者能夠切割除那些α-羧基或α-氨基 基團(tuán)之外的肽鍵(所謂的ω肽酶)。這種新的ω肽酶的例子為如在本發(fā)明中鑒定的焦谷 MIitIiBI (pyroglutamyl-peptidase) ^PlitSMSlitSliBl (acylaminoacyl-peptidase) (參見表1，分別為基因18和45)。工業(yè)應(yīng)用的一般例子包括對(duì)植物或動(dòng)物來源的材料的加工，該應(yīng)用依賴于純的內(nèi) 切蛋白酶的使用，且在其中根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶預(yù)期可發(fā)揮極高的性能。這些加工步驟可 針對(duì)原材料或(部分)純化的蛋白質(zhì)組分的大批特征的修飾。例如，這些加工步驟可針對(duì) 性使產(chǎn)物的溶解性、濾過性、可分離性、蛋白質(zhì)提取產(chǎn)量和消化性最大化，或者使毒性、不利 口味和粘性最小化。此外，該處理也可改變?cè)牧匣蚣兓?或部分純化的)蛋白質(zhì)的物 理化學(xué)特征。這些優(yōu)點(diǎn)不僅在將本發(fā)明的內(nèi)切蛋白酶作為加工輔助應(yīng)用在工業(yè)中時(shí)適用，而且在作為活性酶成分應(yīng)用于動(dòng)物飼料中時(shí)也適用。根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)切蛋白酶可特異性 地作為面包添加劑應(yīng)用在面包工業(yè)中，如延遲面包的老化或減少生面團(tuán)的粘性?；蛘邇?nèi)切 蛋白酶可用于啤酒和葡萄酒工業(yè)中以防止或使不需要的蛋白質(zhì)絮最小化?；蛘?，它可用于 啤酒工業(yè)中以使制備麥芽汁的谷類的蛋白質(zhì)提取物產(chǎn)量最適化。此外，它也可作為具有 極好的特征的乳汁凝固劑而有利地用于乳品加工業(yè)中，或者使多種乳汁成分的質(zhì)地形成 (texturishing)、發(fā)泡或沉降(setting)特征最適化。在乳品加工業(yè)中的另一個(gè)應(yīng)用是新 蛋白酶在制備經(jīng)酶修飾的干酪(Enzyme Modified Cheeses) (EMC)的用途。此外，可將多種蛋白質(zhì)底物用通常與其他蛋白水解酶組合的根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)切蛋 白酶處理以獲得醫(yī)學(xué)或非醫(yī)學(xué)應(yīng)用的水解產(chǎn)物。此處根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)切蛋白酶在獲得蛋白 質(zhì)底物的完全水解中令人驚訝地有效，即使是蛋白酶抗性的部分也完全水解了，內(nèi)切蛋白 酶也令人驚訝地使最終水解產(chǎn)物的變態(tài)反應(yīng)原性最小化或有效抑制不利口味的形成。更具體地，根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)切蛋白酶的特征在于其在不尋常肽鍵切割蛋白質(zhì)的優(yōu) 選性，尤其當(dāng)小氨基酸殘基Ala、Gly、Ser和Thr，或殘基Ile和Pro在Pl或ΡΓ位置時(shí) (Keil，B等人；ProteinSeq Data Anal (1993) 5 :401_407)。結(jié)果，那些在用現(xiàn)有技術(shù)的內(nèi)切 蛋白酶時(shí)對(duì)水解有抗性的蛋白質(zhì)起始材料的組分可以用根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)切蛋白酶進(jìn)行溶 解和水解。這種蛋白酶抗性組分的非限制性例子包括植物材料中的所謂的伸展蛋白和動(dòng)物 來源的材料中的膠原蛋白、明膠以及特定的乳汁成分。多種飼料如大豆中含有胰蛋白酶抑制劑。這些蛋白質(zhì)在如豬和家禽的GI-道內(nèi)抑 制胰蛋白酶的活性。該胰蛋白酶抑制活性導(dǎo)致這些動(dòng)物中最適度以下的蛋白質(zhì)消化性，從 而導(dǎo)致增加的廢物產(chǎn)生和差的經(jīng)濟(jì)效果。該問題可部分地通過在高溫烘烤大豆而解決。在 大豆中已經(jīng)鑒定了兩種不同類型的胰蛋白酶抑制劑，即Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑和 Kunitz型胰蛋白酶抑制劑。本發(fā)明現(xiàn)在提供了對(duì)于通過烘烤降解胰蛋白酶抑制劑活性的可選擇的途徑， 即它提供了能夠在靠近Kimitz型胰蛋白酶抑制劑的羧基末端的亮氨酸176-天冬氨酸 177之間的肽鍵處切割的半胱氨酸蛋白酶(EC 3.4. 22，表1)(如由Wilson(1988)在CRC CriticalReviews in Biotechnology 8(3) 197-216 中所綜述)。這導(dǎo)致大豆中該胰蛋白 酶抑制劑的失活。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)由真菌黑曲霉分泌的半胱氨酸蛋白酶比源自其他生物的 類似的酶更好地滿足這些標(biāo)準(zhǔn)。蛋白酶也廣泛用于干酪制備領(lǐng)域中。在干酪的生產(chǎn)中，必需的是使干酪乳汁凝固 以使得能夠從乳清中分離干酪物質(zhì)如酪蛋白。幾種乳汁凝固酶，也稱為促凝劑已經(jīng)得到描 述，且包括(牛)凝乳酶、牛胃蛋白酶、豬胃蛋白酶以及微生物酶如Rhizomucor miehei蛋 白_、I hizomucor pusiIlus 蛋白_禾口 Cryptonectria parasitica 蛋白_。
疑可牛 胃中獲得，但也可通過如乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)經(jīng)微生物生產(chǎn)。所有這 些酶特征在于具有對(duì)κ-酪蛋白中殘基105(苯丙氨酸)和殘基106(甲硫氨酸)之間的 肽鍵或靠近該肽鍵的鍵的特異性。這意味著通過在干酪制備中采用這些酶，κ-酪蛋白在 側(cè)-κ-酪蛋白和帶有負(fù)電荷的稱為糖大肽(glycomacrop印tide) (GMP)的大肽半分子的接 點(diǎn)切割開。當(dāng)這發(fā)生時(shí)，大肽擴(kuò)散到乳清中，其對(duì)酪蛋白微團(tuán)的溶解性的穩(wěn)定作用喪失了， 且一旦足夠的κ-酪蛋白得到水解，酪蛋白微團(tuán)即開始凝固。對(duì)于進(jìn)一步的乳汁酶促凝固 的細(xì)節(jié)見(如 D. G. Dalgleish, AdvancedDairy Chemistry 卷 1，由 P. F. Fox 編緝，Elsevier，
38London,1992。當(dāng)前可用的促凝劑使得能夠得到相當(dāng)高產(chǎn)量的干酪，然而，應(yīng)認(rèn)識(shí)到由于生產(chǎn)的 大體積的干酪，以百分之十的量級(jí)增加的產(chǎn)量可構(gòu)成基本的經(jīng)濟(jì)優(yōu)點(diǎn)。隨后，本領(lǐng)域中對(duì)于 具有(即使微弱的)改進(jìn)的產(chǎn)量的促凝劑有巨大的需求。促凝劑特征在于其高的底物特異性，然而該特異性依賴于pH和溫度。在一般 的干酪生產(chǎn)過程中，PH將從最初的pH 6. 3變僅到4. 5-5. 5范圍內(nèi)的較低pH值，終值依 賴于在干酪生產(chǎn)過程中所用的條件。一些促凝劑比另一些對(duì)于PH改變更敏感。例如 Rhizomucorpusillus蛋白酶比凝乳酶對(duì)于pH改變更加敏感。除pH之外，其他的參數(shù)如溫 度和水含量也可影響蛋白酶特異性。眾所周知大多數(shù)促凝劑顯示隨變化的PH而變化的底 物特異性，從而導(dǎo)致在干酪生產(chǎn)末期改變的蛋白水解活性。同樣眾所周知促凝劑在酪蛋白 蛋白水解的程度上有差異；它們?cè)诘鞍姿膺^程中產(chǎn)生的肽模式中也顯示有差異。這些是 干酪成熟過程中的相關(guān)因素，且可影響干酪的性質(zhì)如味道、風(fēng)味和質(zhì)地。在一些情況中，促 凝劑引起了不利作用如苦味肽或不利口味的形成。此外，蛋白水解特異性中的變化可導(dǎo)致 產(chǎn)量的減少。許多牛凝乳酶制劑中眾所周知的一種成分胃蛋白酶是蛋白酶的一個(gè)例子，該 蛋白酶與純的凝乳酶相比產(chǎn)生了較低的產(chǎn)量和味道效果。在產(chǎn)生新的改進(jìn)的干酪質(zhì)地和味 道中仍然需要促凝劑。這種新的促凝劑導(dǎo)致快速發(fā)展與干酪老化相關(guān)的味道和質(zhì)地特點(diǎn)， 于是提供了基本的經(jīng)濟(jì)利益。眾所周知游離氨基酸在味道和風(fēng)味生成中非常重要。尤其氨基酸亮氨酸、苯丙 氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸在一般的干酪味道和風(fēng)味成分中起重要的作用。該游離氨基酸 通過在干酷制造過程中加入的微生物發(fā)酵而轉(zhuǎn)變到實(shí)際的生成風(fēng)味和味道的化合物如 methanediol、二甲基二硫醚、甲基丙酸和甲基丙醛。外肽酶在游離氨基酸的生成中起重要 的作用。然而，它們僅當(dāng)與具有適當(dāng)特異性的內(nèi)切蛋白酶組合才有效。外-和內(nèi)-肽酶的 適當(dāng)組合可用于干酪制備中，從而生產(chǎn)具有新的和改進(jìn)的味道特點(diǎn)的干酪制品。根據(jù)本發(fā)明的酶可用于水解動(dòng)物來源的蛋白質(zhì)材料，如全脂奶、脫脂乳、酪蛋白、 乳清蛋白質(zhì)或酪蛋白和乳清蛋白質(zhì)的混合物。這種酪蛋白和乳清蛋白質(zhì)的混合物可以如人 乳中類似的比例適用。此外，根據(jù)本發(fā)明的酶混合物可用于水解植物來源的蛋白質(zhì)材料， 如小麥谷蛋白、發(fā)芽的或未發(fā)芽的大麥或其他用于制造啤酒的谷類、豆奶、其濃縮物或分離 物、玉米蛋白質(zhì)、其濃縮物或分離物和水稻蛋白質(zhì)。在大規(guī)模工業(yè)過程的領(lǐng)域中，一些應(yīng)用僅依賴于內(nèi)切蛋白酶，而在其他的應(yīng)用中， 內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶的組合是關(guān)鍵的。依賴于單純的內(nèi)切蛋白酶應(yīng)用的和在其中根據(jù) 本發(fā)明的蛋白酶可發(fā)揮極好的性能的一般例子包括如大豆或豌豆或谷類蛋白質(zhì)加工的應(yīng) 用，該應(yīng)用使粘性最小化或使發(fā)泡性或其他物理化學(xué)特征最適化，面包工業(yè)中的面包添加 劑使生面團(tuán)的粘性最小化，啤酒和葡萄酒工業(yè)中的加工輔助防止出現(xiàn)蛋白質(zhì)絮或使谷類的 提取產(chǎn)量最適化，生物工業(yè)中的飼料添加劑增強(qiáng)腸吸收或調(diào)節(jié)腸中的微生物活性，乳品加 工業(yè)中的加工輔助使多種乳汁成分的凝固、發(fā)泡或沉降特征最適化。此外，將源自乳汁或大 豆或膠原蛋白的蛋白質(zhì)用蛋白酶進(jìn)行處理以生產(chǎn)所謂的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。盡管這些蛋白質(zhì) 水解產(chǎn)物的主要出路是嬰兒制劑和用于就醫(yī)者的食品，但是打算供應(yīng)非醫(yī)療需要的人員如 運(yùn)動(dòng)員或進(jìn)行減食療法的人的產(chǎn)品形成了一個(gè)快速增長(zhǎng)的區(qū)段。在所有這些應(yīng)用中，蛋白 質(zhì)水解產(chǎn)物提供了吸引人的優(yōu)點(diǎn)，如降低的變態(tài)反應(yīng)原性、促進(jìn)的胃腸道攝取、所需氨基酸如谷氨酰胺和半胱氨酸的較少的化學(xué)破壞，和最后，在長(zhǎng)期貯藏期間酸性飲料中無蛋白質(zhì) 沉淀。如果水解產(chǎn)物以二和三肽的混合物提供，那么即可組合所有這些優(yōu)點(diǎn)。然而，目前所 有商業(yè)上可購得的水解產(chǎn)物都是通過組合幾種內(nèi)切蛋白酶來生產(chǎn)的。后一方法意味著對(duì)蛋 白質(zhì)的非均一的和不完全的降解。為了獲得所需的二 _和三肽混合物，包含多種二 _和三肽 基肽酶的組合的水解過程是理想的。不幸的是，只有少數(shù)來自食品等級(jí)和工業(yè)可接受的微 生物的這些酶是已知的，更不用說工業(yè)可獲得的。根據(jù)本發(fā)明，幾個(gè)高度有用的二-和三肽 基肽酶是以相對(duì)純的狀態(tài)可經(jīng)濟(jì)地獲得。優(yōu)選那些對(duì)要切割的底物展示低選擇性的二 _或 三肽基肽酶，即僅展示最低的氨基酸殘基切割優(yōu)選性。優(yōu)選那些水解高百分比的天然存在 的肽鍵的二 _或三肽基肽酶的組合。盡管對(duì)天然存在的肽鍵有高的活性，但對(duì)游離氨基酸 的總水解通過二-和三肽基肽酶的特性而防止。同樣優(yōu)選那些最適活性在PH 4 8且展 示足夠的溫度穩(wěn)定性的二 _或三肽基肽酶。足夠的溫度穩(wěn)定性意味著在將酶與底物一起 于50攝氏度加熱1小時(shí)后，至少殘存著初始水解活性的40%，優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選70 100%。盡管二 -或三肽或二 _和三肽混合物的有效生產(chǎn)的方法以根據(jù)本發(fā)明的酶的可 獲得性為關(guān)鍵，但與蛋白質(zhì)底物溫育的第一酶通常為內(nèi)切蛋白酶。優(yōu)選地具有廣譜內(nèi)肽 酶活性的內(nèi)切蛋白酶適合于該狀態(tài)，如用于接近中性條件的枯草桿菌蛋白酶(購自DSM的 Delvolase)、中性金屬蛋白酶(購自NOVO的Neutrase)或嗜熱芽孢菌蛋白酶(購自Daiwa Kasei的Thermoase)，和用于酸性條件的胃蛋白酶或曲霉病胃蛋白酶(aspergillop印sin) (如購自Shin Nikon的SumizymeAP，日本)。第一消化的目的是改進(jìn)溶解性、減少粘性和減 少水/蛋白質(zhì)混合物的熱沉降特征。此外，用內(nèi)切核酸酶的該預(yù)處理對(duì)于形成足夠的二-和 三肽基肽酶的起始位點(diǎn)并借此加速二 _或三肽形成過程是關(guān)鍵的。可選擇地，使水解產(chǎn)物 脫苦味的蛋白酶與二 _或三肽基肽酶一起包括于過程的該階段或其后。后繼水解的主要目的是使產(chǎn)物的變態(tài)反應(yīng)原性最小化或促進(jìn)胃腸道攝取。在這種 水解產(chǎn)物的生產(chǎn)中，應(yīng)用二肽基-和三肽基-肽酶具有特別的重要性，這是因?yàn)槠涮峁┝松?產(chǎn)水解產(chǎn)物的有效途徑。在食品和飼料工業(yè)中的其他應(yīng)用完全依賴于一種或多種內(nèi)切蛋白酶與一種或多 種外切蛋白酶的組合。這種內(nèi)切蛋白酶與外切蛋白酶的組合一般用于工業(yè)中以改進(jìn)如終產(chǎn) 物的味道和顏色的方面。其原因?yàn)槲兜篮皖伾漠a(chǎn)生主要依賴于游離氨基酸的存在。游離 氨基酸不僅可通過外切蛋白酶如羧肽酶和氨肽酶來獲得，而且可通過肽基二肽酶獲得。如 果與內(nèi)切蛋白酶或甚至二肽基_或三肽基_肽酶組合，那么羧肽酶、氨肽酶和肽基_ 二肽酶 可在較短的時(shí)間內(nèi)生成大量的游離氨基酸。然而，在所有這些過程中，應(yīng)該避免氨基酸或甚 至非蛋白質(zhì)成分的非控制的釋放以使不利副作用最小化。盡管游離氨基酸同樣可引起許多味覺，但這些味覺是非?；镜?苦、甜、酸和 “鮮美(umami)”)，且感覺這些味道所必需的氨基酸濃度很高。盡管有這些高的閾值，但游 離氨基酸能夠在非常低的濃度范圍通過許多風(fēng)味增強(qiáng)機(jī)制來形成主要的感覺作用。這些機(jī) 制之一包含游離氨基酸與糖在所謂的美拉反應(yīng)(Maillard reaction)中的組合。與游離氨 基酸相比，利用這些美拉產(chǎn)物，可以比記錄的游離氨基酸低幾個(gè)數(shù)量級(jí)的閾值而發(fā)展出壓 倒性的復(fù)雜風(fēng)味和香氣系統(tǒng)。美拉產(chǎn)物通常在制備食品或飼料產(chǎn)物的烹飪、烘焙和烘烤中 于升高的溫度中形成。在這些處理中同時(shí)產(chǎn)生了顏色和一大批香味。在這些反應(yīng)中，氨基
40基團(tuán)與還原化合物反應(yīng)作為第一步并最終導(dǎo)致整組反應(yīng)途徑。在食品或飼料中，包含的氨 基化合物主要是游離氨基酸，該氨基酸用多種蛋白酶從蛋白質(zhì)原材料中釋放，且所需的還 原化合物主要指還原糖。這意謂在原材料的加工中，應(yīng)該避免游離氨基酸和糖的不當(dāng)釋放 以使不利口味最小化，該不利口味會(huì)在隨后的加熱步驟如在噴射干燥和滅菌中生成。后一 個(gè)想法再次強(qiáng)調(diào)了根據(jù)本發(fā)明的酶的較高純度和低使用成本的益處。除美拉反應(yīng)之外，也可在環(huán)境溫度中對(duì)氨基酸進(jìn)行重要的化學(xué)轉(zhuǎn)換。后一類型的 轉(zhuǎn)換是酶依賴性的，且在發(fā)酵的食品中相當(dāng)普遍，如啤酒、酸牛乳、干酪成熟和肉類和葡萄 酒成熟過程。在這些發(fā)酵過程中，游離氨基酸由加入的蛋白酶或由來自所用原材料或微生 物引子的蛋白水解酶活性從所用原材料中釋放。在成熟期，微生物的代謝活性將游離氨基 酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂性黾拥母杏X性質(zhì)的衍生物。例如，L-亮氨酸、L-異亮氨酸和L-纈氨酸在啤酒 發(fā)酵中導(dǎo)致有價(jià)值的雜醇如戊醇和異丁醇(isobutanol)。相似的干酪揮發(fā)物如甲硫醇和二 甲基二硫醚可追溯到干酪中甲硫氨酸的產(chǎn)生以及甲基丙酸和甲基丙醛可追溯到纈氨酸。最 后游離氨基酸谷氨酸因?yàn)槠渑cRNA的分解產(chǎn)物即所謂的5’ -核糖核苷酸的協(xié)同作用，可形 成強(qiáng)的味道增強(qiáng)作用。如果與5’ -核糖核苷酸如5’ -IMP和5’ -GMP的適當(dāng)濃度組合，由谷 氨酸生成的鮮美味道的探測(cè)閾值已知可降低兩個(gè)數(shù)量級(jí)。為了在所有這些過程中獲得明確的和精確的味道效果，蛋白質(zhì)底物應(yīng)該用內(nèi)-和 外切蛋白酶的組合來水解，其中內(nèi)和外切蛋白酶的至少一種，優(yōu)選內(nèi)-和外切蛋白酶兩者 都是純的，且優(yōu)選對(duì)于特定組的氨基酸有選擇性或優(yōu)選釋放優(yōu)選的氨基酸。因此，優(yōu)選的蛋 白酶特征在于對(duì)于可被切割的氨基酸序列的高選擇性，該想法使得已知為“成熟酶”的曲霉 屬中的酶類具有特別的重要性。除食品和飼料工業(yè)之外，蛋白酶也普遍應(yīng)用于化學(xué)、制藥、診斷和個(gè)人護(hù)理 (personal care)工t中。在個(gè)人護(hù)理(personal care)工業(yè)中，蛋白酶用于形成肽，該肽加入到多種產(chǎn)物中 以改進(jìn)如皮膚感覺、光澤或保護(hù)的方面。此外，有一種直接體表應(yīng)用蛋白酶的新的傾向。與 皮革工業(yè)中的酶使用非常相似地，后一種應(yīng)用的主要目的是清潔、去毛和軟化皮膚。在化學(xué)和制藥工業(yè)中，蛋白酶已發(fā)展為生產(chǎn)昂貴配料或中間物的有價(jià)值的工具。 在這些工業(yè)中，蛋白酶不僅因?yàn)槠渌饽芰Χ乙驗(yàn)槠鋸奶烊换蚍翘烊话被岷铣呻牡哪?力而被應(yīng)用。后一種選擇是明確地由從其基于氨基酸的構(gòu)建塊用內(nèi)切蛋白酶如嗜熱芽孢菌 蛋白酶合成天冬苯丙二肽酯的可能性所證實(shí)。與食品和飼料工業(yè)的情況不同，盡管要實(shí)現(xiàn)所需化學(xué)轉(zhuǎn)化可能需要不尋常的反應(yīng) 條件，但蛋白酶的立體-和區(qū)域選擇性也認(rèn)為是重要的優(yōu)點(diǎn)。蛋白酶在該工業(yè)應(yīng)用中的一 般例子包括內(nèi)切蛋白酶、氨肽酶及羧肽酶在生產(chǎn)多種藥物中間物如胰島素、抗生素、腎素和 ACE-抑制劑中的使用。這種應(yīng)用的綜述提供于IndustrialBiotransformations，A. Liese, K. Seelbach, C. Wandrey, Wiley-VCH ；ISBN 3-527-30094-5。考慮到所需特異性、立體_和區(qū)域選擇性、無副作用和對(duì)不尋常反應(yīng)條件如高的 溶劑濃度的耐受性，根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶的改進(jìn)的性能提供了基本的優(yōu)點(diǎn)。從制藥的角度看，蛋白酶的作用通過相當(dāng)數(shù)目的參考文獻(xiàn)闡明于MartindalfThe Extra Pharmacopoeia，，(PharmaceuticalPress, London, UK)。此夕卜，在調(diào)節(jié)各種生物學(xué)過 程中非常特異的蛋白酶的重要作用由下述事實(shí)闡明，即許多激素僅在其前體分子被這樣一種非常特異的蛋白酶加工之后活化。對(duì)于某些種類的這種特異性蛋白酶的抑制劑活性己包 含于各種新藥物的開發(fā)中。因此，蛋白酶的新的和有效的抑制劑現(xiàn)在可用此處提供的序列 進(jìn)行鑒定。每一個(gè)在此處弓I用的文獻(xiàn)的全部公開內(nèi)容均在此弓I入作為參考。表1
實(shí)施例實(shí)施例1測(cè)定蛋白水解活性和特異性蛋白酶特異性可用多種肽底物來研究。合成的底物廣泛用于在篩選中、在發(fā)酵中、 在分離中探測(cè)蛋白水解酶以確定酶濃度、研究特異性及探究與抑制劑的相互作用。肽P-硝 基苯胺優(yōu)選用于測(cè)定蛋白酶活性，這是因?yàn)榭蛇B續(xù)跟隨該活性并因此使得能夠進(jìn)行動(dòng)力學(xué) 測(cè)量。肽P-硝基苯胺的切割可由釋放4-硝基苯胺時(shí)在410nm測(cè)量的吸收增加而跟蹤。對(duì) 硝基苯胺底物通常用于絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶。此外，使用了肽硫酯和7_氨基-P-甲基 香豆素肽衍生物。肽硫酯對(duì)于絲氨酸和金屬蛋白酶是非常敏感的底物，它展示了相對(duì)高的 轉(zhuǎn)換率，這是因?yàn)榱蝓ユI比酰胺鍵易于切割。硫酯的切割可用巰基試劑如4，4_ 二硫代嘧啶 (324nm)或5，5-二硫二 2-硝基苯甲酸(405nm)跟隨。相對(duì)于酰胺鍵，酯鍵的切割通常觀察到了相同增加的轉(zhuǎn)換率。要測(cè)定蛋白酶的酯酶活性的最眾所周知的底物是對(duì)硝基酚衍生 物。對(duì)硝基酚衍生物的釋放可依賴于所用的PH在不同的波長(zhǎng)進(jìn)行監(jiān)控，如在在中性PH左 右時(shí)使用了 340nm的波長(zhǎng)，而在超過pH 9時(shí)，監(jiān)控是在405nm左右進(jìn)行的。此外，酯的水解 也可由用pH-stat設(shè)備的滴定法跟隨。在對(duì)酯酶活性進(jìn)行定量測(cè)量的情況下，可應(yīng)用PH敏 感性染料。或者，可將肽附著在熒光離去基團(tuán)上。當(dāng)在適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)監(jiān)控時(shí)，蛋白水解伴隨熒光 的增加。通常使用的是肽基2-苯基酰胺和肽基4-甲基-7-香豆基酰胺。例如7-氨基-4-甲 基香豆素的釋放用350nm的激發(fā)波長(zhǎng)和460nm的放射波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)量。7-氨基-4-甲基香 豆素的使用優(yōu)點(diǎn)為離去基團(tuán)為產(chǎn)色的(380nm吸收)并有熒光(400nm激發(fā)，505nm發(fā)射)。 當(dāng)易裂鍵兩側(cè)必須均有一個(gè)氨基酸時(shí)，引入猝滅熒光的基團(tuán)是有用的。這種底物的一般特 征是肽序列將熒光供體基團(tuán)與受體基團(tuán)分離，該受體基團(tuán)充當(dāng)熒光的猝滅劑。對(duì)猝滅基團(tuán) 與熒光團(tuán)之間的肽鍵的切割將導(dǎo)致熒光的實(shí)質(zhì)增加。已經(jīng)報(bào)道了幾種供體_受體對(duì)，包括 鄰氨基苯甲酸(Abz)作為供體和2，4-二硝基苯基(Dnp)作為受體，5_[(2’氨基乙基)_氨 基]-萘磺酸(EDANS)作為供體和4-[[4’_(二甲基氨基)苯基]偶氮]_苯甲酸(DABCYL) 作為受體。Abz/EDDnp代表非常便利的供體_受體對(duì)，這是因?yàn)樵谕耆夂?，熒光? 100的因子增加了，且EDDnp的吸收光譜不隨pH而變化。此外，該肽序列可含有達(dá)10個(gè)殘 基而不喪失猝滅作用。隨著連接肽的大小增加，易裂的鍵的位置變得較不特異了。因此，除 確定水解是否發(fā)生之外，對(duì)產(chǎn)物的額外分析也是必需的。這可通過用HPLC分析并分離所生 產(chǎn)的肽并確定片段的氨基酸序列而進(jìn)行。此外，消化的肽組成可直接由組合的HPLC/質(zhì)譜 分析技術(shù)來分析。除了用具有確定序列的肽之外，合成的肽文庫也可用于研究蛋白酶的特異性。肽 是以隨機(jī)或半隨機(jī)的方式固相合成。如Meldal等人(PNAS USA 91，3314，1994)報(bào)道了一 個(gè)蛋白酶底物家族的制備，該制備開始于H-Lys (Abz)-樹脂，用肽將樹脂延伸到6個(gè)氨基 酸，并最后使Tyr (N02)與該肽偶聯(lián)。每一個(gè)樹脂珠都具有唯一的序列，且在用蛋白酶處理 之后，最易感的由于釋放含有Tyr (N02)的肽而發(fā)熒光。對(duì)易感的肽的序列分析將提供蛋白 酶特異性的信息。蛋白酶活性通常以單位表示。通常國際標(biāo)準(zhǔn)單位(IU)定義為在確定的條件下每 分鐘轉(zhuǎn)移1微摩爾底物所需的酶量。對(duì)于蛋白酶，IU可涉及每分鐘內(nèi)1微摩爾肽鍵的水解。 然而，在蛋白酶單位的情況下，偏離國際定義是規(guī)則而不是例外。在特異性切割一個(gè)鍵的模 式肽中，IU的計(jì)算很簡(jiǎn)單，對(duì)于可在多個(gè)位置在多種程度上切割蛋白質(zhì)底物的蛋白酶，使用 許多偏離的單位定義。除所用的單位定義之外，任何水解實(shí)驗(yàn)均需要描述足夠的進(jìn)行單位 測(cè)量的條件。這種條件包含如底物濃度、酶-底物比例、PH和溫度。確定蛋白酶特定活性的 一般測(cè)定包含蛋白質(zhì)底物，如變性的血紅蛋白、胰島素或酪蛋白。用蛋白酶在固定的條件下 在固定的時(shí)間間隔內(nèi)消化多肽。將未消化的和大的多肽用TCA進(jìn)行沉淀，且TCA可溶性產(chǎn) 物是通過測(cè)量在220或280nm的吸收或通過用福林試劑(folin reagent)、茚三酮、氟-2， 4- 二硝基苯/丹磺酰氯、滴定可溶性肽或TNBS方法或熒光素來確定。除水解后標(biāo)記產(chǎn)物之 外，也可使用已經(jīng)用特定的染料或熒光團(tuán)如熒光素進(jìn)行標(biāo)記的多肽底物。此外，可用標(biāo)準(zhǔn)的 實(shí)驗(yàn)室分析儀采用標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸分析方法。為了解由蛋白酶生成的肽的大小分布，可進(jìn)行 凝膠層析實(shí)驗(yàn)。除此之外，由蛋白酶生成的肽模式的更好的分辨率可由采用反相技術(shù)HPLC
45獲得。蛋白質(zhì)底物水解的程度通常表示為水解度或DH。在水解過程pH穩(wěn)定的情況下，DH可 得自水解中的堿消耗(食品蛋白質(zhì)的酶促水解(Enzymatic Hydrolysis of FoodProtein)， J. Adler-Nissen, 1986,Elsevier Applied SciencePublishers LTD. )。DH涉及水解產(chǎn)物多 種有用的功能性質(zhì)，如溶解性、乳化能力、發(fā)泡和泡沫穩(wěn)定性、振蕩擴(kuò)張、器官感覺的質(zhì)量。 此外，味道是水解產(chǎn)物食品等級(jí)的一個(gè)重要的方面?？辔妒堑鞍踪|(zhì)水解產(chǎn)物的一個(gè)主要問 題。水解反應(yīng)的終止可通過改變pH、熱失活、變性劑如SDS、乙腈等來進(jìn)行。根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)⒈?中所示的多肽進(jìn)行了表達(dá)，并進(jìn)行了至少部分的純 化。它們是根據(jù)至少一種上述方法進(jìn)行分析并發(fā)現(xiàn)具有表1中所列的活性。實(shí)施例2蛋白酶底物的Kcat/Km比例的直接確定可將合成的底物用于在純化過程中監(jiān)控酶活性、用于確定酶濃度、用于確定抑制 常數(shù)或用于研究底物特異性。Kcat/Km比例的確定給出了對(duì)底物特異性的測(cè)量。它使得能 夠?qū)Ρ韧N酶對(duì)不同底物的特異性或切割相同底物的不同酶的水解速率。該比例具有二階 速率常數(shù)單位，于是表示為1/(濃度.時(shí)間)。將具有10. 5-10. 6M-l.sec-l范圍的Kcat/ Km比例的底物被認(rèn)為是非常好的底物，即具有好的親和力和快的轉(zhuǎn)換率。然而，一些具有 Kcat/Km值在10. 4M-1. sec-Ι范圍的底物是非常特異性的。Kcat/Km比例可在確定單獨(dú)的參數(shù)之后進(jìn)行計(jì)算。在該情況下，Km和Vm可從多種 線性圖(如Hanes或Cornish-Bowden方法)中和或通過非線性回歸方法獲得。已知Vm = kcat.Et (其中Et是最終的活性酶濃度)，那么kcat = Vm/Et。當(dāng)產(chǎn)物或底物抑制發(fā)生時(shí)， 或者當(dāng)?shù)孜镆愿叩臐舛瘸恋頃r(shí)，通過前述方法對(duì)Kcat/Km比例的確定即不能進(jìn)行。然而可 能可獲得一階條件下作用的Kcat/Km比例的精確值，該條件為當(dāng)?shù)孜餄舛冗h(yuǎn)遠(yuǎn)低于估計(jì)的 Km 時(shí)。在這些條件下，Michaelis-Menten 方程v = (Vm. S)/(Km+S)變?yōu)棣?= (Vm. S) /Km,因?yàn)?S << Km或ν = (Vm/Km). S = kobs. S = -dS/dt對(duì)其求積分為InS = -kobs. t+lnSo，其中So為起始底物濃度，且S為給定時(shí)間時(shí) 的底物濃度。該速度與底物濃度成比例。換句話說，底物水解遵守以kobs為一階速率常數(shù) 的一階過程。因?yàn)?Vm = kcat. EtJjfW kobs = Vm/Km = (kcat. Et)/Km。對(duì)底物水解的連續(xù)的記錄使得能夠在InS對(duì)時(shí)間的圖中以曲線圖來確定kobs。如 果活性酶濃度已知時(shí)，Kcat/Km比例可簡(jiǎn)單地從kobs來推斷Kcat/Km = kobs/Et測(cè)定方法利用起始底物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于估計(jì)的Km和低的酶濃度以使得可記錄底 物的水解。你將獲得產(chǎn)物生成的一階曲線在底物完全水解之后，產(chǎn)物的吸收(或熒光單 位)將使得能夠精確確定So，這是因?yàn)镻t = So。kobs從InS對(duì)時(shí)間的圖的斜率或可選用 擬合軟件(Enzfitter，SigmaPlot. · ·)來確定。NB 不要忘記從產(chǎn)物濃度來計(jì)算任何給定時(shí)間的底物濃度(S = So-P)，這是因?yàn)?以P對(duì)時(shí)間繪圖不能提供正確的kobs(dP/dt = kobs. S不能以相同的方式積分)。或者，人們可從產(chǎn)幻象(apparition)曲線來測(cè)量連續(xù)的tl/2 (半衰期)，這是因?yàn)?在一階過程中tl/2 = ln2/kobs = 0. 693/kobs，所以 kobs = 0. 693/tl/2
利用該方法使得能夠檢查你有正確的一階衰減(連續(xù)的tl/2的相等值)。實(shí)施例3失活曲霉中的蛋白酶基因使曲霉屬基因組中蛋白酶基因失活的最方便的途徑是基因置換技術(shù)(也稱為“一 步基因破壞”)。該技術(shù)的基礎(chǔ)已由RothsteinRJ在Meth. Enzymol. 101，p202,1983中描 述。該技術(shù)基本基于轉(zhuǎn)化的DNA片段與真菌細(xì)胞的基因組DNA的同源重組。通過雙交換， 要失活的基因即(部分地)被對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)化的DNA片段置換。該轉(zhuǎn)化的DNA片段優(yōu)選地 含有對(duì)黑曲霉的選擇性標(biāo)記基因。對(duì)DNA的操作和失活構(gòu)建體的生成基本用一般的分子 生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行。首先，從黑曲霉品系中分離基因組DNA，該DNA隨后用于對(duì)蛋白酶基因的 失活。黑曲霉的基因組DNA可用任何描述的方法進(jìn)行分離，如通過由Graaff等人(1988) Curr. Genet. 13，315-321所述且本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法。將該基因組DNA用作模板，該 模板用于用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR ；Sambrook等人，(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular Cloning :A Laboratory Manual),2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)對(duì)蛋白酶基因翼側(cè)區(qū)域的擴(kuò)增。該翼側(cè)區(qū)域此處指要失活的蛋白酶基因上游和 下游的非編碼區(qū)域。每個(gè)翼側(cè)區(qū)域長(zhǎng)度優(yōu)選超過1. Okb。將兩個(gè)單鏈的DNA寡核苷酸用于引發(fā)對(duì)每一個(gè)翼側(cè)區(qū)域的PCR擴(kuò)增。對(duì)于5’-翼 側(cè)區(qū)域，一個(gè)引物與該蛋白酶基因編碼序列起點(diǎn)的上游DNA序列同源。該同源區(qū)域優(yōu)選位 于翻譯起始位點(diǎn)上游超過1. Okb處。第二個(gè)引物與位于蛋白酶基因編碼序列鄰接上游的互 補(bǔ)和反向DNA序列同源。對(duì)于3’ -翼側(cè)區(qū)域，一個(gè)引物與位于該蛋白酶基因編碼序列鄰接下游的DNA序列 同源。第二個(gè)引物與優(yōu)選位于蛋白酶基因編碼序列下游超過1. Okb處的互補(bǔ)和反向DNA序 列同源。包括于所有引物且與黑曲霉基因組同源的DNA序列長(zhǎng)度應(yīng)該最小為15個(gè)核苷酸， 優(yōu)選長(zhǎng)度為18個(gè)核苷酸。最方便地，所有引物應(yīng)該在與黑曲霉基因組同源的序列上游含有 適當(dāng)?shù)南拗泼傅淖R(shí)別位點(diǎn)。這些額外的識(shí)別位點(diǎn)促進(jìn)了克隆過程。將引物和黑曲霉基因組DNA兩者在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的條件下用于PCR反應(yīng) 中。引物的退火溫度可從與黑曲霉基因組同源的DNA序列的部分進(jìn)行計(jì)算。將含有5’-翼 側(cè)區(qū)域和3’ -翼側(cè)區(qū)域的片段兩者克隆入可用一般的分子生物學(xué)技術(shù)在大腸桿菌中增殖 的載體中。然后將可用作黑曲霉中選擇性標(biāo)記的基因克隆在兩個(gè)翼側(cè)區(qū)域之間。最方便地， 標(biāo)記基因在實(shí)現(xiàn)黑曲霉中表達(dá)的啟動(dòng)子的控制之下，優(yōu)選為內(nèi)源的黑曲霉啟動(dòng)子。標(biāo)記基 因的插入方向優(yōu)選與最初的蛋白酶基因的方向相同。最終的失活片段含有5’ -翼側(cè)區(qū)域、 優(yōu)選在黑曲霉內(nèi)源啟動(dòng)子控制之下的標(biāo)記基因和3’ -翼側(cè)區(qū)域，所有均在該方向和定向。 將最終構(gòu)建體的DNA克隆入可在大腸桿菌中增殖的載體中。將失活構(gòu)建體用適當(dāng)?shù)南拗泼高M(jìn)行消化以去除大腸桿菌載體序列，且失活片段用 標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行分離(Sambrook等人，(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular Cloning =A LaboratoryManual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)。最 后將黑曲霉用描述于文獻(xiàn)中的方法以失活的片段進(jìn)行轉(zhuǎn)化，如用由Kusters-van Someren 等人(1991) Curr. Genet. 20，293-299描述的方法。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞通過將轉(zhuǎn)化混合物涂布于 瓊脂平板上而進(jìn)行選擇，該平板對(duì)于表達(dá)標(biāo)記基因的黑曲霉品系的生長(zhǎng)具有選擇性。在通
47過影印培養(yǎng)法對(duì)轉(zhuǎn)化的曲霉菌株進(jìn)行純化后，用標(biāo)準(zhǔn)方法以DNA印跡對(duì)菌株的代表數(shù)目進(jìn) 行分析(Sambrook 等人，(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular Cloning =ALaboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring HarborLaboratory Press, New York)。因此,轉(zhuǎn)化菌 株的菌絲體的基因組DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼高M(jìn)行分離和消化。限制性酶切片段用瓊脂糖凝膠 進(jìn)行分離，印跡于硝酸纖維素膜上并用標(biāo)記的標(biāo)記基因片段進(jìn)行探測(cè)。雜交和洗滌在嚴(yán)緊 性條件下。含有正確長(zhǎng)度的標(biāo)記的限制性片段的菌株認(rèn)為是正確的。利用該方法可選擇具 有失活蛋白酶基因的黑曲霉菌株。實(shí)施例4用離子交換層析分離蛋白酶如在此處提供的由核苷酸序列編碼的小量的蛋白酶是通過構(gòu)建含有相關(guān)DNA序 列的表達(dá)質(zhì)粒、用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化黑曲霉菌種并使該黑曲霉菌種生長(zhǎng)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上而獲 得。在收集了不含污染的細(xì)胞的液體培養(yǎng)基之后，可純化到所需蛋白酶。為了以基本純的形式分離由所提供的核苷酸序列編碼的蛋白酶，可遵從幾個(gè)策 略。所有這些策略均已充分地描述于相關(guān)的科學(xué)文獻(xiàn)中(參見如蛋白質(zhì)純化手冊(cè)(Protein PurificationHandbook)，18-1131-29 Edition AA 如由 Amersham PharmaciaBiotech 出片反 的，Uppsala，瑞典)?？蛇m用于從復(fù)雜的混合物中純化蛋白酶的程序在下文中提供。對(duì)于 所需酶特征存在有選擇的適當(dāng)測(cè)定是必須的。對(duì)于蛋白酶，一般如實(shí)施例1所述使用產(chǎn)色 的合成肽底物。這種肽底物對(duì)于內(nèi)切蛋白酶、羧肽酶、氨肽酶或ω肽酶是選擇性的。在實(shí) 施例11中描述了對(duì)于特定三肽基肽酶的選擇性。通過在相關(guān)的合成肽中選擇正確的氨基 酸殘基，可以選擇具有所需特異性的蛋白酶。首先應(yīng)該確定蛋白酶是否分泌到培養(yǎng)基中，依賴于所述的生產(chǎn)蛋白酶的表達(dá)系 統(tǒng)，該蛋白酶可分泌或可保留于細(xì)胞內(nèi)。如果蛋白酶分泌到發(fā)酵培養(yǎng)基中，產(chǎn)生細(xì)胞或這些 細(xì)胞的片段必須由離心或過濾去除，且所得的清澈或澄清的培養(yǎng)基是進(jìn)一步純化的起點(diǎn)。 在那些蛋白酶不為分泌型的情況中，必須破裂細(xì)胞以使得能夠進(jìn)行蛋白酶的純化。在這種 情況下，收集的細(xì)胞物質(zhì)最好用摩擦機(jī)研磨、用珠子磨細(xì)、用超聲波降解或用法式壓碎器 (French press)或Manton-Gaulin勻漿器進(jìn)行處理，然后過濾或離心。在該蛋白酶是疏水 或膜結(jié)合的情況下，必需在過濾或離心之前加入非離子去污劑以使蛋白酶溶解。在澄清步驟之后，可應(yīng)用三個(gè)階段的純化步驟以獲得基本純狀態(tài)的未知蛋白酶。 在這三個(gè)步驟的全部或部分中，加入去污劑是必需的。在第一個(gè)或捕獲階段，將目標(biāo)蛋白酶分離、部分純化并濃縮。在隨后的中間物純化 階段，將大批雜質(zhì)的大多數(shù)去除，且在最后的精制(polishing)階段，將大量相關(guān)物質(zhì)的痕 量的剩余雜質(zhì)去除并將酶溶解于適合的緩沖液中。依賴于得到的蛋白酶的特性和物理性 質(zhì)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠用不同蛋白質(zhì)結(jié)合材料的略加修改的方式使這三個(gè)階段最適化 并在有些改變的條件下應(yīng)用這些階段。然而，在所有情況下選擇性分析測(cè)定是不可缺少的， 這是因?yàn)樗鼘⑹沟媚軌驅(qū)τ蛹兓牡鞍姿饣钚赃M(jìn)行連續(xù)的監(jiān)控。適用于該目的的分析 測(cè)定包括如前文提及的產(chǎn)色肽底物的使用。在純化的第一捕獲步驟中，陰離子類型的強(qiáng)離子交換樹脂優(yōu)選用于澄清和脫鹽含 有酶的培養(yǎng)基。為保證所需蛋白水解活性與樹脂的結(jié)合，在低傳導(dǎo)性條件下檢驗(yàn)了 3或4 個(gè)不同PH值的培養(yǎng)基和樹脂。在這些檢驗(yàn)中，樹脂通常用緩沖液平衡，該緩沖液具有與含酶培養(yǎng)基相同的PH值和傳導(dǎo)性。然后將該培養(yǎng)基在PH條件下應(yīng)用于柱中，該條件已顯示 允許樹脂對(duì)蛋白酶的充分結(jié)合，即無所需酶活性可追溯到流過的培養(yǎng)基中。隨后酶活性用 連續(xù)的鹽梯度從離子交換樹脂中洗脫，該梯度起始于樹脂平衡緩沖液并終止于向其中加入 了 1摩爾/升NaCl的緩沖液。將根據(jù)本測(cè)定含有所需活性的洗脫級(jí)分收集并備用于額外 的純化步驟。該額外的純化步驟依賴于收集的級(jí)分中所需酶的純度如果是幾乎純態(tài)，額外 的凝膠過濾步驟將證明其為足夠；如果不是幾乎純態(tài)，那么在凝膠過濾步驟之后應(yīng)用疏水 相互作用樹脂層析。疏水相互作用樹脂層析是通過首先將從離子交換樹脂中收集的組分的鹽含量增 加到4摩爾/升NaCl及通過去除形成的任何沉淀而進(jìn)行。如果結(jié)果所得的清澈組分不 含所需活性，那么該活性明顯存在于沉淀中，且可以以基本純的狀態(tài)進(jìn)行回收。如果結(jié)果 所得的清澈組分在測(cè)定中仍然顯示所需活性，那么同樣將該液體應(yīng)用于苯基葡聚糖樹脂 (Pharmacia)中，該樹脂用具有相同pH和傳導(dǎo)性的高鹽緩沖液平衡。如果所需酶活性結(jié)合 到苯基葡聚糖樹脂上，則將該活性用連續(xù)降低的鹽梯度進(jìn)行洗脫之后伴隨無鹽的洗滌，必 要時(shí)用離液劑進(jìn)行洗脫。如同前面的，將在測(cè)定中展示活性的梯度的組分收集并最終進(jìn)行 凝膠過濾的步驟。如果所需酶活性不結(jié)合苯基葡聚糖樹脂，許多污染物將結(jié)合其上，從而存 在于柱的外水體積中的所需酶活性在應(yīng)用于凝膠過濾柱之前，僅需要額外的超濾步驟來獲 得更濃縮形式的活性。凝膠過濾柱不僅去除了痕量的污染物，而且將酶帶入了隨后使用時(shí) 所必需的緩沖液中。盡管該方法通常適用于根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶的分離和純化，但更具體的分離技術(shù) 描述于實(shí)施例4。在該實(shí)施例中，曲霉蛋白酶的分離描述為使用固定的桿菌肽，即一種已知 與多種類型蛋白酶選擇性相互作用的肽抗生素。實(shí)施例5用親和層析分離蛋白酶純化小量蛋白酶的另一種方法親和層析。為了獲得純化形式的蛋白酶，將100毫 升的培養(yǎng)物生長(zhǎng)于良好通風(fēng)的搖瓶中。離心以除任何不溶性物質(zhì)之后，將上清夜應(yīng)用于40 毫升用0. 05摩爾/升乙酸鈉Ph 5. 0平衡的桿菌肽_葡聚糖柱中。結(jié)合于柱上的蛋白酶用補(bǔ) 充了 IMNaCl 和 10% (ν/ν)異丙醇的乙酸緩沖液洗脫(J. Appl. Biochem.，1983ρρ420_428)。 將活性組分收集、對(duì)蒸餾水進(jìn)行透析并應(yīng)用于20毫升桿菌肽_葡聚糖柱中，該柱仍然用乙 酸緩沖液進(jìn)行平衡。如前文，洗脫用補(bǔ)充了 NaCl和異丙醇的乙酸緩沖液進(jìn)行。將活性組 分即展示所需活性的組分收集、對(duì)5毫摩爾/升的乙酸緩沖液pH5. 0進(jìn)行透析并然后用 Amicon ΡΜ-10膜超濾而濃縮。為了獲得基本純態(tài)的蛋白酶，將濃縮的液體在Superdex 75 柱上進(jìn)行層析，該柱用0. 05摩爾/升乙酸鈉pH 5. 0平衡并補(bǔ)充了 0. 5摩爾/升的NaCl。用純化的酶在PAGE上進(jìn)行的進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)可證實(shí)分子量是否與序列數(shù)據(jù)的基礎(chǔ) 上所預(yù)測(cè)的一致。最后的證實(shí)可通過進(jìn)行部分的N-末端氨基酸分析來獲得。實(shí)施例6來自黑曲霉的新半胱氨酸蛋白酶的性質(zhì)在本實(shí)施例中，如前文描述的，將曲霉基因nr28克隆并在黑曲霉中過表達(dá)。將獲 得的酶根據(jù)實(shí)施例4中描述的程序進(jìn)行純化并用于在多種條件下破壞大豆的胰蛋白酶抑 制活性。作為參考材料使用了木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶。菠蘿蛋白酶購自Sigma，木瓜蛋白
49酶購自 DSM Food Specialities Business Unit Beverage Ingredients, PO Box 1,2600 MA Delft，荷蘭。胰蛋白酶抑制根據(jù)Kakade，M. L.，Rackis，J. J.，McGhee，J. E.和 Puski，G. (1974) J. Cereal Chemistry 51 :376_382的方法進(jìn)行測(cè)量。將底物N-苯甲酰-L-精氨酸-對(duì)硝基 苯胺降解為N-苯甲酰-L-精氨酸和對(duì)硝基苯胺作為對(duì)胰蛋白酶活性的測(cè)量。胰蛋白酶是 從British Drug Houses Ltd獲得的并源自牛胰腺，在每克產(chǎn)物中含有超過0. 54AnSOn單 位。大豆的Kunitz抑制劑也從Sigma獲得。在測(cè)量胰蛋白酶抑制之前，胰蛋白酶抑制劑以2mg/ml的濃度與上述半胱氨酸 蛋白酶在PH 3于50mM乙酸鈉緩沖液中預(yù)溫育。將酶以酶蛋白質(zhì)與胰蛋白酶抑制劑 1 100 (w/w)的比例加入。白蛋白用作酶的負(fù)對(duì)照。剩余的胰蛋白酶活性在37°C溫育3 個(gè)小時(shí)之后進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果顯示于表2中。表2.多種半胱氨酸蛋白酶對(duì)大豆的Kimitz胰蛋白酶抑制劑酶促失活的作用。 TI 胰蛋白酶抑制劑活性在半胱氨酸蛋白酶與胰蛋白酶抑制劑預(yù)溫育中，在胃蛋白酶存在時(shí)重復(fù)進(jìn)行實(shí) 驗(yàn)。將胃蛋白酶以1.3mg/ml的終濃度加入。結(jié)果顯示于列3。進(jìn)行了另一系列的實(shí)驗(yàn)以檢查熱穩(wěn)定性。在將半胱氨酸蛋白酶加入到與胰蛋白酶 抑制劑的預(yù)溫育中之前，將這些酶在75和90°C中溫育5分鐘。結(jié)果顯示于列4和5。這些結(jié)果明顯地證實(shí)這些來自黑曲霉的新的半胱氨酸蛋白酶比目前可用的半胱 氨酸蛋白酶在使動(dòng)物飼料中胰蛋白酶抑制劑失活中更有活性。實(shí)施例7外肽酶促進(jìn)干酪的成熟和干酪的味道使由基因nr 20和54 (參見表1)編碼的氨肽酶根據(jù)前述的方法在黑曲霉中過量 表達(dá)。這些酶的純化根據(jù)實(shí)施例4中描述的程序進(jìn)行。純化的酶樣品的活性在pH7. 2的磷酸 水緩沖液(50mM)中確定，該緩沖液中含有許多疏水氨基酸殘基的對(duì)硝基苯胺衍生物(3mM)作為底物。底物由氨肽酶的轉(zhuǎn)化通過監(jiān)控由于底物轉(zhuǎn)化而在400nm有光密度的變化來確 定，其中使用不含酶的溶液作為參考。依賴于所用的底物，將活性(A)計(jì)算為每分鐘OD的 變化，并表示為如Phe-AP、Leu-AP或Val-AP單位。將正常的干酪乳汁用DelV0-teCTMDX 31 范圍的引子培養(yǎng)物(DSM Food Specialities Delft，荷蘭)接種以獲得Gouda類型的干酪， 且用平均劑量的促凝劑(每升干酪乳汁50IMCU)實(shí)現(xiàn)。此外，將25Phe-單位的每種外切蛋 白酶加入到兩種實(shí)驗(yàn)干酪中，而對(duì)照不含有任何一種外切蛋白酶。使用的干酷制備參數(shù)與 對(duì)兩種干酪的半堅(jiān)硬干酪應(yīng)用的程序一致。在實(shí)驗(yàn)的干酪和對(duì)照干酪之間在風(fēng)味和香味產(chǎn) 生方面的差異達(dá)到這樣的程度記錄，即在3個(gè)星期之后實(shí)驗(yàn)的干酪含有大多數(shù)其器官感覺 的性質(zhì)，而對(duì)照干酪在6個(gè)星期之后獲得了相似的鑒定。在3個(gè)星期后實(shí)驗(yàn)的干酪中游離 氨基酸的水平顯示為兩倍高；6個(gè)星期后成熟的水平又變得相當(dāng)。氨基酸分析根據(jù)Waters 的 Picotag 方法(Milford MA, USA)進(jìn)行。這些數(shù)據(jù)說明產(chǎn)物可提前3個(gè)月進(jìn)行銷售而不降低干酪的保存性。實(shí)驗(yàn)干酪的器 官感覺特征與對(duì)照差別的程度還在于對(duì)照干酪中略傾向于苦味的原干酪味道在存在氨肽 酶的實(shí)驗(yàn)干酪中被克服。同樣，也發(fā)現(xiàn)干酪的質(zhì)地在某些程度上更潤滑。實(shí)施例8由基因55編碼的蛋白酶的新特異性如前文所解釋的，某些蛋白質(zhì)作為特定的氨基酸組成或特定的三級(jí)結(jié)構(gòu)而可以耐 受酶促水解。在這種情況下，可用展示新特異性的蛋白酶來顯著地改進(jìn)從蛋白酶抗性蛋白 質(zhì)中溶解的肽的量。酪蛋白是具有非常有限的三級(jí)結(jié)構(gòu)但具有非常高水平的脯氨酸殘基的蛋白 質(zhì)。許多蛋白酶在切割含有脯氨酸的序列中有困難，從而β-酪蛋白用普通蛋白酶水解產(chǎn) 生相對(duì)富含大的蛋白酶抗性肽的水解產(chǎn)物。后面的抗性肽可使水解產(chǎn)物具有許多不利性 質(zhì)。例如，眾所周知這些大的肽對(duì)于變態(tài)反應(yīng)原性和苦味有相對(duì)強(qiáng)的作用。此外，這些肽阻 止了進(jìn)一步降解為游離氨基酸，從而在某些過程中，這些大的蛋白酶抗性肽的出現(xiàn)等于產(chǎn) 量損失。因此，能夠切割蛋白質(zhì)的蛋白酶抗性部分的蛋白酶的可利用性和使用將成為重要 的技術(shù)和經(jīng)濟(jì)益處。β-酪蛋白代表牛乳中主要酪蛋白組分的一種。該蛋白質(zhì)已在其氨基酸序列上進(jìn) 行了充分的特征記述，且以幾乎純的形式可購得。同樣地，酪蛋白提供了用于研究酶切 割位點(diǎn)和在酶水解中形成的多種肽的長(zhǎng)度之間關(guān)系的極好的檢驗(yàn)底物。本實(shí)施例證明盡管內(nèi)切蛋白酶枯草桿菌蛋白酶具有廣譜的切割特征，但非常特異 的酶如由基因55(參見表1)編碼的脯氨酰內(nèi)切蛋白酶的加入對(duì)于形成的β-酪蛋白片段 的大小有主要的影響。來自牛乳(凍干的，基本無鹽的粉末)具有最小值為90%的β-酪蛋白的β-酪蛋 白從 Sigma獲得。來自地衣芽孢桿菌(B. licheniformis) (Delvolase ，每克 560000DU) 的枯草桿菌蛋白酶從DSM Food Specialities (Seclin，法國)獲得。由基因55編碼的脯氨 酸特異性內(nèi)切蛋白酶在黑曲霉中過量表達(dá)并用在實(shí)施例4中描述的程序進(jìn)行純化。將β -酪蛋白粉末以10% (w/w)的濃度與Delvolase 粉末以ο· 1% (w/w)的 濃度一起溶解于O. 1摩爾/升的磷酸緩沖液pH7. O中。在45°C振蕩水浴中溫育24小時(shí)之 后，反應(yīng)由90°C將溶液加熱15分鐘而終止。向一半溶液(Iml含有10毫克β-酪蛋白)中
51加入100微升脯氨酸特異性蛋白酶，且使反應(yīng)在45°C繼續(xù)進(jìn)行另外24小時(shí)。于90°C再一 次熱擊之后，將Delvolase 和Delvolase +脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶兩者處理的β-酪蛋 白材料的樣品用LC/MS設(shè)備進(jìn)行分析以研究?jī)煞N樣品中精確的肽大小分布。LC/MS 分析將使用與Ρ4000泵(Thermoquest ，Breda，荷蘭)偶聯(lián)的使用離子捕獲質(zhì)譜儀 (Thermoquest , Breda，荷蘭)的HPLC用于對(duì)由本發(fā)明的酶混合物產(chǎn)生的酶促蛋白質(zhì)水 解產(chǎn)物的特征鑒定。這些形成的肽用PEPMAP C18 300A(MIC-15-03-C18-PM，LC Packing, Amsterdam，荷蘭)柱與 Milli Q 水(Millipore，Bedford，MA，美國；溶液 Α)中的 0. 甲酸 梯度的聯(lián)合進(jìn)行分離，并用乙腈中的0. 甲酸(溶液B)進(jìn)行洗脫。該梯度起始于100% 的溶液A并在45分鐘中降低到70%的溶液B，然后在后一比例保持另外5分鐘。所用的注 射體積是50微升，流速是每分鐘50微升，且柱的溫度維持在30°C。注射的樣品的蛋白質(zhì)濃 度約為50微克/毫升。單獨(dú)的肽的詳細(xì)信息用“掃描依賴性(scan cbpendent) ”MS/MS算法獲得，該 算法是離子捕獲質(zhì)譜儀特有的算法。完全的掃描分析之后進(jìn)行可變焦(zoom)掃描分析 以確定在完全掃描質(zhì)量范圍內(nèi)的大多數(shù)強(qiáng)離子的帶電狀態(tài)。隨后MS/MS分析后一種離 子得到部分的肽序列信息，該信息可用于使用來自Xcalibur Bioworks的SEQUEST應(yīng)用 (Thermoquest , Breda,荷蘭)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索。所用的數(shù)據(jù)庫由OWL. fasta數(shù)據(jù)庫提 取，該數(shù)據(jù)庫可在NCBI (國家生物技術(shù)信息中心(National Centre for Biotechnology Informatics))獲得，其含有進(jìn)行所用應(yīng)用的目標(biāo)蛋白質(zhì)。通過用這些技術(shù)作為篩選的方法，只有具有質(zhì)量在約400 2000道爾頓范圍內(nèi)的 肽被認(rèn)為適合用MS測(cè)序進(jìn)一步分析。將血管緊張肽(M = 1295. 6)用于調(diào)整MS模式中的最適靈敏度和MS/MS模式中的 最適片段化，進(jìn)行了 60yg/ml的恒定的灌輸，結(jié)果導(dǎo)致MS模式中主要的二重和三重帶電的 種類，及MS/MS模式中約35%的最適碰撞能量。在單獨(dú)用Delvolase消化的樣品中，LC/MS/MS分析鑒定了覆蓋β -酪蛋白分子多 個(gè)部分的40個(gè)肽。這些肽一起占總的酪蛋白序列的79%。肽在C18柱上不同的保持 時(shí)間可追溯到在2 23個(gè)氨基酸殘基范圍內(nèi)的肽的長(zhǎng)度。總共發(fā)現(xiàn)的肽的< 15%小于6 個(gè)氨基酸。用Delvolase 和脯氨酸特異性蛋白酶消化的樣品也生成了大量來自β _酪蛋 白的可以確認(rèn)的肽。這些肽一起覆蓋了總酪蛋白蛋白質(zhì)序列的>50%。在該樣品中， 肽大小的分布顯著均一，這是因?yàn)樵撾膬H在2和6個(gè)殘基的長(zhǎng)度范圍內(nèi)。該結(jié)果顯示在用 脯氨酸特異性蛋白酶制備的水解產(chǎn)物中含有大的二 _、三_到6ΑΑ肽的組分，這顯示了與特 征在于不尋常的特異性的內(nèi)切蛋白酶共溫育的明顯有利作用。這些實(shí)驗(yàn)中同樣明顯的是根 據(jù)基因55的內(nèi)切蛋白酶編碼在脯氨酸殘基的羧基末端切割肽鏈的內(nèi)切蛋白酶。實(shí)施例9選擇性釋放特定氨基酸以促進(jìn)風(fēng)味形成。游離氨基酸如亮氨酸和苯丙氨酸不僅包含于美拉反應(yīng)中，而且在多種食品發(fā)酵中 作為所需香味的前體。為了促進(jìn)在食品發(fā)酵中或在食品的加熱、烘烤或烘焙階段促進(jìn)這種 香味的形成，有利的是在這些產(chǎn)物中加入蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，該水解產(chǎn)物含有相對(duì)高水平的 游離形式的這些特異性氨基酸。在本實(shí)施例中，我們描述了選擇性富含亮氨酸和苯丙氨酸的酵母提取物的生產(chǎn)。該富集通過將對(duì)所選氨基酸殘基組具有切割優(yōu)選性的內(nèi)切蛋白酶與 對(duì)相似的氨基酸組的釋放有利的外切蛋白酶進(jìn)行組合而獲得。內(nèi)切蛋白酶的優(yōu)選性應(yīng)該與 所用的外切蛋白酶的優(yōu)選性相匹配。例如我們已確定由基因20和54(參見表1)編碼的氨 肽酶特征在于具有對(duì)亮氨酸和苯丙氨酸殘基的釋放的明確的優(yōu)選性，該優(yōu)選性與嗜熱芽孢 菌蛋白酶的切割優(yōu)選性匹配。由基因23和24編碼的羧肽酶具有釋放精氨酸和亮氨酸殘基 的優(yōu)選性，該優(yōu)選性與胰蛋白酶的切割優(yōu)選性匹配。由基因5編碼的羧肽酶特征在于對(duì)釋 放甘氨酸具有非常不尋常的優(yōu)選性，該優(yōu)選性可與存在于木瓜蛋白酶中的某些內(nèi)切蛋白酶 進(jìn)行組合。由基因51編碼的羧肽酶能夠去除谷氨酸殘基，這與由基因43編碼的谷氨酸特 異性蛋白酶匹配。來自Daiwa Kasei KK (Osaka,日本)的內(nèi)切蛋白酶嗜熱芽孢菌蛋白酶(商業(yè)上作 為Thermoase可購得)C180已知可在大的疏水氨基酸如Leu和Phe的氨基末端側(cè)切割肽鍵。 為了將因此暴露的氨基酸從新形成的肽中釋放，我們使用由基因nr20和54 (參見表1)編 碼的氨肽酶。這些基因根據(jù)前述的方法在黑曲霉中過量表達(dá)，且這些酶的純化根據(jù)在實(shí)施 例4中描述的程序進(jìn)行。為了用酶的這些組合釋放盡可能多的亮氨酸和苯丙氨酸而不伴隨釋放不利氨基 酸，顯然應(yīng)該謹(jǐn)慎地選擇酶促水解中所用的條件。此外，必須使酵母自身的內(nèi)源(和可能非 特異性)蛋白酶失活。在許多檢驗(yàn)溫育之后，設(shè)計(jì)出了一個(gè)流程，該流程使這兩種新的蛋白 酶以令人驚訝地選擇性和有效性使亮氨酸和苯丙氨酸從酵母蛋白質(zhì)中釋放。為了使酵母內(nèi)源蛋白酶失活，將酵母懸浮液在95攝氏度放置5分鐘。然后將懸浮 液快速冷卻到需要的溫度，并將PH用4N NaOH調(diào)節(jié)到7.0。將酵母、嗜熱芽孢菌蛋白酶和一 種氨肽酶均同時(shí)在下面的條件下溫育。在熱擊之后，將2000毫升酵母懸浮液的pH調(diào)節(jié)到 7. 0，其后將680毫克的Thermoase加入，并在攪動(dòng)后加入純化的氨肽酶。將混合物在攪動(dòng) 中于50攝氏度溫育3小時(shí)然后離心。為了終止所有酶活性，將上清夜的pH調(diào)節(jié)到4，并于 95攝氏度的進(jìn)行另外45分鐘的熱處理。在另一次離心后，從上清夜中獲得了用于氨基酸分 析的樣品。沉淀的或不溶解的物質(zhì)是通過在Hereaus Megafuge2. OR離心機(jī)中以3500rpm 離心15分鐘而去除。將上清夜取出并以-20°C冷凍放置。將上清夜樣品在解凍后立即根據(jù)Waters的Picotag方法(Milford MA，美國)進(jìn) 行氨基酸含量的分析。在氨基酸分析中，Trp和Cys的值被省略，并將Asp和Asn的值合計(jì)為一個(gè)值。根 據(jù)所獲得的數(shù)據(jù)，在結(jié)果所得的水解產(chǎn)物中，丙氨酸和亮氨酸(21. 3 11. 7)之間的比例為 1 0.5。商品酵母水解產(chǎn)物的丙氨酸對(duì)亮氨酸的比例一般展示為1 0.3。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，制備了富含游離谷氨酸的酵母提取物。為了實(shí)現(xiàn)該目的，使用了 具有在谷氨酸殘基的C-末端切割的優(yōu)選性的內(nèi)切蛋白酶(由表1中的基因nr 43所編碼) 和能夠去除這些因此暴露的谷氨酸的羧肽酶(由表1中的基因nr 51所編碼)。由基因nr 43編碼的內(nèi)切蛋白酶和由基因51編碼的羧肽酶(參見表1)根據(jù)前述的方法在黑曲霉中過 量表達(dá)。這些酶的純化根據(jù)在實(shí)施例4中描述的程序進(jìn)行。游離谷氨酸在許多香味形成過程中的基本作用已得到充分證明，且認(rèn)為MSG，即谷 氨酸鈉鹽，是單一的最重要的味道增強(qiáng)成分。在本實(shí)施例中，將200ml熱休克的酵母懸浮液的pH調(diào)節(jié)到8. 0，然后將由基因43編碼的純化的酶產(chǎn)物加入，并將混合物在50攝氏度溫育4小時(shí)。然后將pH降低到5. 0，并 將懸浮液離心。向100毫升上清夜中加入由基因51的純化的基因產(chǎn)物。與該羧肽酶的溫 育在連續(xù)的PH調(diào)節(jié)中于50攝氏度進(jìn)行30分鐘。在用95攝氏度的5分鐘熱處理使酶溫育 停止后，再次將材料離心(見上)并獲得樣品用于氨基酸分析。根據(jù)獲得的氨基酸數(shù)據(jù)(見上)，在結(jié)果所得的水解產(chǎn)物中，丙氨酸和谷氨酸 (30.0 48. 7)之間的比例為1 1.6。商品酵母水解產(chǎn)物丙氨酸對(duì)谷氨酸的比例一般展 示為1 ； I0實(shí)施例10富含特定的氨基酸的酵母水解產(chǎn)物的風(fēng)味估計(jì)為了證明富含根據(jù)本發(fā)明的特定氨基酸的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物能夠生成特定的香味， 用在前面實(shí)施例中描述的酵母水解產(chǎn)物進(jìn)行了許多實(shí)驗(yàn)。為此，將這些水解產(chǎn)物的較大部 分制備并凍干。將結(jié)果所得的粉末的性能與標(biāo)準(zhǔn)化的混合物中的商品酵母提取物的性能 (GistexLS，獲自DSM Food Specialities，Delft，荷蘭)在幾個(gè)反應(yīng)條件下進(jìn)行比較。該 標(biāo)準(zhǔn)化混合物由一種水解產(chǎn)物、堿混合物和水組成。堿混合物含有在研缽中充分混合的22克Maxarome PlusPowder (具有高含量天 然核苷酸的特型酵母提取物，同樣可從DSMFood Specialities獲得)、29. 2克葡萄糖、9克 REFEL-F脂肪(氫化的豆油，獲得自Barentz, Hoofddorp,荷蘭)和0. 2克乳酰硬脂酸鈣 (calcium stearoyl lactylate)(乳化齊[J,獲得自 Abitec, Northampton,英國)。所有標(biāo)準(zhǔn)化的混合物都含有5克酵母提取物粉末(即富含亮氨酸或谷氨酸的材料 或者商品的酵母提取物)、3克堿混合物和3克水。在充分混合后，將這三種漿液進(jìn)行不同 的加熱方法，即在反應(yīng)小瓶中于90-95攝氏度進(jìn)行65分鐘(液體反應(yīng))，或者在真空烘箱中 于120攝氏度在20毫巴進(jìn)行干燥(真空烘烤反應(yīng))，或者在水分逸散后在開口的反應(yīng)小瓶 中于120攝氏度加熱10分鐘(烘烤反應(yīng))。在熱處理之后，所有三種產(chǎn)物均具有假定的在深褐色到幾乎黑色范圍的顏色。在 真空烘烤反應(yīng)的情況下，僅使用了淺色的上層。對(duì)加熱產(chǎn)物的味道估計(jì)通過將變黑的餅研 磨成細(xì)的粉末并將這些粉末以2% (w/w)的濃度溶解于含有0.6% (WZV)NaCl的水中而進(jìn) 行的。對(duì)一組味道實(shí)驗(yàn)對(duì)象的觀察列舉在表3中。表3 用三肽基肽酶形成的非變態(tài)反應(yīng)原性的乳清蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物由基因19和55編碼的二肽基肽酶以及由基因4、9、10、12、26、35、46和50編碼的 三肽基肽酶可如所描述的進(jìn)行過量表達(dá)，并根據(jù)在實(shí)施例4中提供的方法進(jìn)行純化。在純 化后，每一種單獨(dú)的酶的PH最適值和溫度穩(wěn)定性可通過任何可用且技術(shù)人員公知的方法 來確定。此外，每一種單獨(dú)的酶的特異性可用在實(shí)施例1中略述的方法來確定。由三肽基 肽酶展示的選擇性在下面的實(shí)驗(yàn)中闡明。使由基因12編碼的酶在黑曲霉宿主細(xì)胞中過量表達(dá)并用在實(shí)施例4中描 述的程序進(jìn)行純化。將這樣獲得的酶與不同的合成產(chǎn)色底物即Ala-Ala-Phe-pNA和 Ala-Phe-pNA (均來自Bachem，瑞士 )在pH5和50攝氏度進(jìn)行溫育。與Ala-Ala-Phe-pNA 底物的溫育導(dǎo)致在410nm吸收的顯著增加，而與Ala-Phe-pNA的溫育則不。該觀察明顯地 證明三肽基肽酶將三肽切除，且不展示氨肽酶活性，該氨肽酶活性可導(dǎo)致游離氨基酸的不 利增加。此外，由基因12編碼的酶顯示有利的酶穩(wěn)定性特征，如在下面的實(shí)驗(yàn)中所示的。 將4個(gè)酶樣品分別于0、40、50和60攝氏度在pH5溫育1小時(shí)。然后使每一種酶樣品與上 述的Ala-Ala-Phe-pNA底物在檸檬酸緩沖液中于pH 5進(jìn)行溫育，且每一種單獨(dú)的樣品中殘 留的活性可通過測(cè)量在410nm吸收的增加而確定。0攝氏度的樣品顯示100%的活性，40攝 氏度的樣品顯示96%的殘留活性，50攝氏度的樣品顯示92%的殘留活性，而60攝氏度的樣 品顯示88%的殘留活性。在一個(gè)生產(chǎn)具有高比例三肽的水解產(chǎn)物的一般方法中，可將乳清蛋白質(zhì)(WPC 75) 以10克蛋白質(zhì)/升的濃度溶解/懸浮于PH為8. 5的水介質(zhì)中。第一次酶溫肓與廣譜的內(nèi) 切蛋白酶枯草桿菌蛋白酶(061丫01&36@，每克5600000仏來自0510進(jìn)行。在用濃度為 每克蛋白質(zhì)酶濃縮物為0. 5%的該酶于60攝氏度對(duì)乳清預(yù)消化2小時(shí)后，將混合物進(jìn)行熱 處理以使所用的內(nèi)切蛋白酶失活。然后將溫度調(diào)節(jié)到50攝氏度，并將三肽基肽酶加入，然 后將整個(gè)混合物進(jìn)行溫育直到達(dá)到想要的三肽的水平。這樣獲得的水解產(chǎn)物的進(jìn)一步的加 工步驟依賴于特定的應(yīng)用，但可結(jié)合微量過濾和離心及后繼的蒸發(fā)和噴霧干燥。序列表<110>DSM NV<120>編碼新蛋白水解酶的新基因<130>20095W0<160>171<170>PatentIn version3. 1<210>1<211>2520<212>DNA<213> 黑曲霉<400>1cgcaggcgtc cgttgcgccg cgaaaacctg ccgagtgggc cgtttaggct ttgggtctcc 60ccacgatgta agcataatca ttctgtgcct gagtgtgaat tctcctgttg gaggctgcat 120cttaattctt aactgcatga aaagcacttg ggtgctattt tctttttcct ttctttcttt 180
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權(quán)利要求
分離的多核苷酸，該多核苷酸可與根據(jù)選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO57的序列或者選自SEQ ID NO58～SEQ ID NO114的序列的多核苷酸序列進(jìn)行雜交。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，該多核苷酸在高度嚴(yán)緊性條件下可與根據(jù)選自 SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :57 的序列或者選自 SEQ ID N0:58 SEQ ID N0:114 的序列的 多核苷酸進(jìn)行雜交。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的分離的多核苷酸，其可從絲狀真菌獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的分離的多核苷酸，其可從黑曲霉獲得。
5.分離的多核苷酸，該多核苷酸編碼包含根據(jù)選自SEQIDN0:115 SEQ ID N0:171 的序列的氨基酸序列或其功能等價(jià)物的多肽。
6.分離的多核苷酸，該多核苷酸編碼根據(jù)選自SEQIDN0:115 SEQ ID NO :171的序 列的多肽或其功能等價(jià)物的至少一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域。
7.分離的多核苷酸，該多核苷酸包含根據(jù)選自SEQID NO :1 SEQ ID NO :57的序列 或者選自SEQ ID NO 58 SEQ ID NO 114的序列的核 苷酸序列或其功能等價(jià)物。
8.根據(jù)選自SEQID NO :1 SEQ ID NO 57的序列或者選自SEQID NO 58 SEQ ID NO 114的序列的分離的多核苷酸。
9.包含根據(jù)權(quán)利要求1 8的多核苷酸序列的載體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的載體，其中該根據(jù)權(quán)利要求1 8的多核苷酸序列可操作地與調(diào) 節(jié)序列相連接，該調(diào)節(jié)序列適合于該多核苷酸序列在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞內(nèi)表達(dá)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的載體，其中所述適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞是絲狀真菌。
12.制備根據(jù)權(quán)利要求1 8的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求9 11的載體的方法，該方 法包含培養(yǎng)用該多核苷酸或該載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞和從該宿主細(xì)胞內(nèi)分離該多核苷酸或 該載體的步驟。
13.根據(jù)選自SEQID NO 115 SEQ ID NO 171的序列的多肽或其功能等價(jià)物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的多肽，其可從黑曲霉中獲得。
15.分離的多肽，該多肽可通過在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞如黑曲霉中表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1 8 的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求9 11的載體而獲得。
16.包含蛋白酶多肽的功能結(jié)構(gòu)域的重組蛋白酶。
17.制備根據(jù)權(quán)利要求13 16的多肽的方法，該方法包含以下步驟，即用權(quán)利要求 1 8的分離的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求9 11的載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，在使得該多 核苷酸能夠表達(dá)的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞及可選從該細(xì)胞或培養(yǎng)物培養(yǎng)基中純化所編碼的多 肽。
18.包含根據(jù)權(quán)利要求1 8的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求9 11的載體的重組宿主細(xì)胞。
19.表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求13 16的多肽的重組宿主細(xì)胞。
20.包含編碼功能失活的蛋白酶多肽的多核苷酸的重組宿主細(xì)胞。
21.重組宿主細(xì)胞，其中編碼蛋白酶多肽的多核苷酸至少部分缺失。
22.根據(jù)權(quán)利要求18 21的重組宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞來自曲霉屬物種，如黑曲毒ο
23.具有蛋白酶功能缺陷的重組宿主細(xì)胞，該細(xì)胞可通過包含該步驟的方法獲得a.體外突變根據(jù)權(quán)利要求1 11的多核苷酸，b.對(duì)包含內(nèi)源基因的宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，該內(nèi)源基因包含與在步驟a)中獲得的突變 的多核苷酸可以雜交的多核苷酸序列，c.選擇并分離重組宿主細(xì)胞，其中該內(nèi)源基因被在步驟a)中獲得的突變的多核苷酸 所置換。
24.與根據(jù)權(quán)利要求13 16的多肽可反應(yīng)的純化的抗體。
25.包含根據(jù)權(quán)利要求13 16的多肽序列的融合蛋白質(zhì)。
26.診斷生物體是否感染了曲霉病的方法，該方法包含該步驟a.從該疑似感染了曲霉病的生物中分離生物學(xué)樣品，b.從該樣品中分離核酸，c.確定該分離的核酸是否包含可與根據(jù)權(quán)利要求1 8的多核苷酸雜交的多核苷酸。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中步驟c)另外包含擴(kuò)增該分離的核酸，優(yōu)選通過聚合 酶鏈反應(yīng)。
28.診斷某個(gè)生物體是否感染了曲霉病的方法，該方法包含以下步驟a.從該疑似感染了曲霉病的生物中分離生物學(xué)樣品，b.使該生物學(xué)樣品與根據(jù)權(quán)利要求24的抗體進(jìn)行反應(yīng)，c.確定是否形成了免疫復(fù)合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及新鑒定的編碼可從黑曲霉(Aspergillus niger)獲得的新蛋白酶的基因序列。本發(fā)明描述了新基因的全長(zhǎng)基因序列、其cDNA序列及全長(zhǎng)的功能蛋白質(zhì)及其片段。本發(fā)明也涉及在工業(yè)過程中使用這些酶的方法和診斷真菌感染的方法。本發(fā)明同樣包括用根據(jù)本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和在其中對(duì)根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶進(jìn)行遺傳修飾以增強(qiáng)或減少其活性和/或表達(dá)水平的細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N9/62GK101914555SQ20091025138
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2002年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月23日
發(fā)明者A·A·戴克范, A·弗里茨, A·斯托克, C·瓦格納, D·梅爾, E·基姆派爾, F·斯普里菲戈, J·斯坦普勒, K·阿爾伯曼, L·艾登斯, O·海恩里奇, P·克魯巴?？? P·譚, R·阿爾苯, S·克拉格鮑爾, S·霍珀, U·弗爾克斯, W·凱姆納, W·古斯泰德范 申請(qǐng)人:Dsm Ip資產(chǎn)有限公司