專利名稱：：一種生產(chǎn)含有花生四烯酸的微生物油脂的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)微生物油脂的方法，具體是一種生產(chǎn)含有花生四烯酸的微生物油脂的方法。
技術(shù)領(lǐng)域：
花生四烯酸(ArachidonicAcid)簡稱ARA，是5，8，11，14-二十碳四烯酸。它是人體的一種必需脂肪酸，其分子結(jié)構(gòu)式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>從分子結(jié)構(gòu)式中可見，該脂肪酸含有20個(gè)碳原子，4個(gè)雙鍵，其中第一個(gè)雙鍵起始于甲基端起第6個(gè)碳原子上，故屬于n-6系列的多不飽和脂肪酸，簡記為20:4(n-6)。ARA是人體中含量最豐富也是最活躍的C20PUFA。它主要存在于器官、肌肉和血液組織中，在血液、肝臟、肌肉和其它器官系統(tǒng)中作為主要與磷脂結(jié)合的結(jié)構(gòu)脂類起著重要作用。除了主要的結(jié)構(gòu)脂類作用之外，ARA還是許多循環(huán)二十烯酸衍生的生物活性物質(zhì)(eicosenoid)，例如前列腺素E:(PGE2)，前列腺環(huán)素(PG12)，血栓烷A(TxA)，和白細(xì)胞三烯IeukotireneB+(LTB4)和C，(LTC4)的直接前體。這些eicosenoid具有對脂蛋白代謝，血液流變學(xué)，血管彈性，白細(xì)胞功能和血小板激活的調(diào)節(jié)作用。盡管ARA對人體很重要，但是它不能在體內(nèi)從頭合成。ARA是通過必需脂肪酸亞油酸(LOA)的延長和去飽和來合成的。該過程需要酶△6-去飽和酶的存在，該酶在人體內(nèi)含量很低。所以，大多數(shù)ARA必須靠飲食提供，這一點(diǎn)在身體的快速成長期，例如嬰兒期，尤為重要。嬰兒在第一年中其體重可增至2至3倍。所以，需要大量的飲食ARA。世界糧農(nóng)組織和衛(wèi)生組織(FA0/WH0)在“人類營養(yǎng)油脂”(1995)的報(bào)告中建議孕婦與嬰幼兒食譜每天應(yīng)有60mg/kg(體重)ARA的攝入量。花生四烯酸主要來源有植物、動(dòng)物組織、魚油以及微生物和微藻類等，但花生四烯酸在動(dòng)物組織中含量低，一般小于0.2%(wt/wt)，來源也有限，而微生物發(fā)酵法則為生產(chǎn)花生四烯酸開辟了新途徑，它具有不受原材料及氣候限制、生長周期短、培養(yǎng)工藝簡單、花生四烯酸含量高等特點(diǎn)，近幾年已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。而利用各種廉價(jià)原材料培養(yǎng)產(chǎn)油微生物，可進(jìn)一步降低微生物油脂的生產(chǎn)成本。微生物發(fā)酵底物范圍較廣，包括可直接利用的葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜等，以及需要經(jīng)過預(yù)處理的淀粉、纖維素等。目前國內(nèi)外發(fā)酵法生產(chǎn)花生四烯酸的主要原料是葡萄糖等糧食作物。利用廉價(jià)碳源，如木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物，直接發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法尚未見公開報(bào)道。每年有大量的農(nóng)林業(yè)廢棄物(如玉米秸稈)等木質(zhì)纖維素材料用焚燒等方式不當(dāng)處理，既造成浪費(fèi)又污染環(huán)境。通過技術(shù)進(jìn)步，以秸稈等木質(zhì)纖維素材料為原料生產(chǎn)花生四烯酸的成本有望低于糧食發(fā)酵生產(chǎn)花生四烯酸的成本。木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的有機(jī)資源之一，它占地球生物質(zhì)總量的60-80%。，主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，在農(nóng)業(yè)廢棄物中的三者的含量大約是30-40%纖維素，20-30%半纖維素，10-25%木質(zhì)素。其中，葡萄糖是纖維素的組成單元，木糖是半纖維素的主要組成單元。在植物纖維材料水解液中木糖占30%左右，是繼葡萄糖之后自然界中最豐富的糖分，因此，葡萄糖木糖的共利用是開發(fā)木質(zhì)纖維素的關(guān)鍵技術(shù)之一。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種利用含木糖的底物發(fā)酵生產(chǎn)含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，利用廉價(jià)的木質(zhì)纖維素水解糖為發(fā)酵底物，經(jīng)產(chǎn)油微生物轉(zhuǎn)化獲取油脂，將顯著降低微生物油脂生產(chǎn)成本，形成節(jié)約耕地、可連續(xù)生產(chǎn)的油脂獲取路線，并且還有利于環(huán)境保護(hù)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展。本發(fā)明的技術(shù)方案為利用含木糖的底物發(fā)酵生產(chǎn)含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，其特征在于包括以下步驟(1)、原始菌種的活化將高山被孢霉菌種接種到斜面培養(yǎng)基上在25-30°C下培養(yǎng)7-10天，選取菌絲和孢子生長旺盛的新鮮平板，洗脫下平板孢子，過濾得孢子懸液；(2)、離子束誘變將孢子懸液涂布于無菌平皿上，風(fēng)干，進(jìn)行脈沖式N+離子注入，選用N+離子的能量和劑量分別是IOKev和1.3XIO15NVcm2；然后將離子注入過的孢子懸液用無菌水洗脫后，稀釋涂布于木糖篩選平板培養(yǎng)基上在25-30°C下培養(yǎng)，挑選出能在木糖篩選平板培養(yǎng)基上生長且菌絲生長旺盛的的菌落，作為初篩的單菌落，將初篩的單菌落轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)，接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)接搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，挑選出生物量和油脂含量高的菌種作為復(fù)篩的結(jié)果，然后對復(fù)篩的結(jié)果重復(fù)進(jìn)行離子束誘變、初篩和復(fù)篩過程；所述的木糖篩選平板培養(yǎng)基中主要組分的重量百分含量為木糖2%，蛋白胨0.5%，酵母膏1.0%，基質(zhì)蒸餾水，pH8.0，28°C；(3)、液體培養(yǎng)將離子束誘變、篩選過的菌種于PH值為7.5-8.5液體培養(yǎng)基中在28-30°C下培養(yǎng)18-24小時(shí)，液體培養(yǎng)基中主要原料組分的重量百分比為葡萄糖4_6%、木糖2-5%、蛋白胨0.5-1%、豆粕0.5-1.5%，基質(zhì)蒸餾水；(4)、擴(kuò)大培養(yǎng)將液體培養(yǎng)后的菌種接種于發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基中在28-30°C下培養(yǎng)10-12天，發(fā)酵培養(yǎng)基中原料組分的重量百分比為葡萄糖4-6%、木糖2-5%、蛋白胨0.5-1%、豆粕0.5-1.5%，基質(zhì)為蒸餾水；(5)、菌絲體的油脂提取將擴(kuò)大培養(yǎng)后得到的菌絲體進(jìn)行收集，然后進(jìn)行離心、洗滌、100-110°C干燥、萃取得成品。所述的生產(chǎn)含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，其特征在于所述的斜面培養(yǎng)基中主要原料成分的重量百分份比為葡萄糖1.5-2.5%，馬鈴薯浸出液18-22%，瓊脂1.5-2%。所述的生產(chǎn)含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，其特征在于所述的液體培養(yǎng)的搖床轉(zhuǎn)度為180-230rpm，PH值為8，液體培養(yǎng)基中主要原料組分的重量百分比為葡萄糖5%、木糖3%、蛋白胨0.7%、豆粕1%;所述的擴(kuò)大培養(yǎng)是將液體培養(yǎng)后的菌種以8-12%的比例接種于發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐的通氣量為1.0-1.5L/min，攪拌速度為400-500轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵罐內(nèi)PH值為7.5-8.5，溫度為28°C，時(shí)間為10-12天，發(fā)酵培養(yǎng)基中主要原料組分的重量百分比為葡萄糖5%、木糖3%、蛋白胨0.7%、豆粕1%，基質(zhì)為蒸餾水，發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值為7.5-8.5，溫度為28°C；所述的生產(chǎn)含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，其特征在于所述的木糖選用含有五碳糖的木質(zhì)纖維素水解糖；所述的油脂的萃取選用石油醚、正己烷。本發(fā)明各種培養(yǎng)基的基質(zhì)一般均為蒸餾水。本發(fā)明采用離子束修飾細(xì)胞技術(shù)誘變篩選微生物菌種，獲得能高效利用木糖的高山被孢霉優(yōu)良菌株，按照常規(guī)方法將該菌株接種到含木糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中，通氣培養(yǎng)至發(fā)酵液中總還原糖濃度降至1%以下時(shí)停止，離心收集菌體，經(jīng)常規(guī)的有機(jī)溶劑提取方法獲得微生物油脂，并采用氣相色譜法檢測油脂中多不飽和脂肪酸的含量。在本發(fā)明中，在適合于生產(chǎn)含ARA油脂的條件下培養(yǎng)真菌。一般，真菌培養(yǎng)技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，這些技術(shù)可以用于本發(fā)明方法。例如，可以在搖瓶中進(jìn)行真菌接種量的深層培養(yǎng)。搖瓶中裝有生長培養(yǎng)基，植入真菌菌絲，在往復(fù)式搖床上培養(yǎng)約5至10天。本發(fā)明所述的液體培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的組成可以不相同，但都含有碳源和氮源。本發(fā)明采用的碳源是葡萄糖和木糖混合糖，比例是(53)，其含量在約每升培養(yǎng)基30-100克。通常，在培養(yǎng)過程中需要另外加入碳源。這是因?yàn)槲⑸飳μ嫉南牧亢艽?，以致于一次性加入全部碳源是不可行的。氮源的提供通常為蛋白胨和酵母提取物，其濃度為約每升生長培養(yǎng)基5-20克提取物。較好的是，提供約17g/L。也可以使用其它氮源，包括玉米浸出液，大豆粉，花生粉等。氮源可以成批加入，即在培養(yǎng)前一次性全部加入。本發(fā)明利用高山被孢霉發(fā)酵，能夠獲得很高的生物質(zhì)產(chǎn)量，其中約含20-60%的油月旨，油脂中按重量計(jì)25-70%是甘油三酯形式的ARA殘基。收獲菌絲體后，經(jīng)離心分離和洗滌得到的菌體，并在105°C干燥至恒重。然后選擇非極性溶劑，如常規(guī)的石油醚、正己烷等來萃取含ARA的微生物油脂?；ㄉ南┧岬臋z測準(zhǔn)確稱取0.30g菌體(或0.Ig油脂)于5ml容量瓶中，力口入0.5mol/L的KOH-甲醇液lml，60°C水浴30min，其間經(jīng)常振蕩；向容量瓶內(nèi)加入三氟化硼-甲醇溶液lml，60°C水浴30min，其間充分振蕩；冷卻至室溫后向容量瓶中加入Iml石油醚，充分震蕩；向容量瓶中加入Iml飽和食鹽水，使容量瓶內(nèi)溶液更好地分層，分層后的最上層(石油醚層)即可用于氣相色譜分析。準(zhǔn)確稱取0.30g菌體(或0.Ig油脂)于5ml容量瓶中，加入0.5mol/L的KOH-甲醇液lml，60°C水浴30min，其間經(jīng)常振蕩；向容量瓶內(nèi)加入三氟化硼-甲醇溶液lml，60°C水浴30min，其間充分振蕩；冷卻至室溫后向容量瓶中加入Iml石油醚，充分震蕩；向容量瓶中加入Iml飽和食鹽水，使容量瓶內(nèi)溶液更好地分層，分層后的最上層(石油醚層)即可用于氣相色譜(GC)分析檢測。經(jīng)過GC/MS檢測，表明ARA油脂中除花生四烯酸外，還含有Y-亞麻酸、亞油酸以及花生三烯酸等多不飽和脂肪酸，其中不飽和脂肪酸所占比例接近70%。本發(fā)明中萃取得到的油脂中含有大于40%的ARA。氣相色譜條件島津GC-14A氣相色譜儀，C-R4A數(shù)據(jù)處理儀，毛細(xì)管柱BPX70(SGE公司)，25mXΦ0.22mmX0.25μm,氫焰離子化檢測器(FID)，柱溫120-240"C,5°C/min程升，進(jìn)樣量1.0ul，分流比501，氣化室溫度250°C，檢測室溫度250°C氣相色譜條件島津GC-14A氣相色譜儀，C-R4A數(shù)據(jù)處理儀，毛細(xì)管柱BPX70(SGE公司)，25mXΦ0.22mmX0.25μm，氫焰離子化檢測器(FID)，柱溫120-240°C,5°C/min程升，進(jìn)樣量1.0ul，分流比501，氣化室溫度250°C，檢測室溫度250°C。圖1是本發(fā)明的發(fā)酵時(shí)間曲線圖。圖2是補(bǔ)料分批發(fā)酵時(shí)間曲線圖。具體實(shí)施例方式例1利用含木糖的底物發(fā)酵生產(chǎn)含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，包括以下步驟(1)、原始菌種的活化將高山被孢霉菌種接種到斜面培養(yǎng)基上在25-30°C下培養(yǎng)7-10天，選取菌絲和孢子生長旺盛的新鮮平板，洗脫下平板孢子，過濾得孢子懸液；斜面培養(yǎng)基中主要原料成分的重量百分份比為葡萄糖2%，馬鈴薯浸出液20%，瓊脂1.8%；(2)、離子束誘變將孢子懸液涂布于無菌平皿上，風(fēng)干，進(jìn)行脈沖式N+離子注入，選用N+離子的能量和劑量分別是IOKev和1.3XIO15NVcm2；然后將離子注入過的孢子懸液用無菌水洗脫后，稀釋涂布于木糖篩選平板上在25-30°C下培養(yǎng)，挑選出能在木糖篩選平板培養(yǎng)基上生長且菌絲生長旺盛的的菌落，作為初篩的單菌落，將初篩的單菌落轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)，接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)接搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，挑選出生物量和油脂含量高的菌種作為復(fù)篩的結(jié)果，然后對復(fù)篩的結(jié)果重復(fù)進(jìn)行離子束誘變、初篩和復(fù)篩過程；(3)、液體培養(yǎng)將離子束誘變、篩選過的菌種于PH值為8的500ml的液體培養(yǎng)基中在28-30°C，搖床轉(zhuǎn)度為180-230rpm下培養(yǎng)18-24小時(shí)，液體培養(yǎng)基中主要原料組分的重量百分比為葡萄糖5%、木糖3%、蛋白胨0.7%、豆粕；(4)、擴(kuò)大培養(yǎng)將液體培養(yǎng)后的菌種以10%的比例(種子培養(yǎng)基與發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)基的比例)接種于5L發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基中在30°C下培養(yǎng)10-12天，發(fā)酵罐的通氣量為1.0-1.5L/min，攪拌速度為400-500轉(zhuǎn)/分，PH值為7.5-8.5，發(fā)酵培養(yǎng)基中主要原料組分的重量百分比為葡萄糖5%、木糖3%、蛋白胨0.7%、豆粕；(5)、菌絲體的油脂提取將擴(kuò)大培養(yǎng)后得到的菌絲體進(jìn)行收集，然后進(jìn)行離心、洗滌、100-110°C干燥、石油醚萃取得成品。研究了不同原料參數(shù)和投料量對產(chǎn)品產(chǎn)率的影響1、高效利用混合糖發(fā)酵菌株的誘變和篩選取菌絲和孢子生長旺盛的新鮮平板一個(gè)，用IOml無菌水洗下平板孢子，用雙層無菌紗布過濾得到無菌絲體的孢子懸液，取約IO4-IO5個(gè)/ml孢子懸液0.Iml均勻涂布于無菌平皿，風(fēng)干。IOKev氮離子不同劑量進(jìn)行注入。注入后樣品的稀釋、分離、培養(yǎng)及篩選用Iml無菌水洗滌注入后的樣品，將洗脫液適當(dāng)稀釋或不稀釋，取0.Iml均勻涂布于木糖篩選培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行初篩、復(fù)篩。結(jié)果如下表所示最終確定了低能離子束誘變能量和劑量為IOKev和1.3XIO15NVcm2不同低能離子束能量和劑量誘變與存活率關(guān)系<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、混合糖為碳源的發(fā)酵工藝在總糖濃度為8%(葡萄糖/木糖為5/3，w/w)時(shí)，培養(yǎng)溫度28°C，起始pH8.0,接種量8%，裝液量30%，蛋白胨0.76%，豆粕1%的條件下?lián)u瓶一次性發(fā)酵，油脂積累量、生物量和木糖利用率分別是10.05g/L、27.4g/L和84.33%；混合糖發(fā)酵時(shí)間曲線見圖1；3、補(bǔ)料分批發(fā)酵對生物量和油脂積累的影響初始投混合糖4%，在第4天和第7天分別補(bǔ)2%的混合糖，由圖2(補(bǔ)料分批發(fā)酵時(shí)間曲線)可見，第9天生物量和油脂積累量都達(dá)到最高，發(fā)酵時(shí)間縮短為9天。例2利用含木糖的底物發(fā)酵生產(chǎn)含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，其特征在于包括以下步驟(1)、原始菌種的活化將高山被孢霉菌種接種到斜面培養(yǎng)基上在25_30°C下培養(yǎng)7-10天，選取菌絲和孢子生長旺盛的新鮮平板，洗脫下平板孢子，過濾得孢子懸液；所述的斜面培養(yǎng)基中主要原料成分的重量百分份比為葡萄糖1.5-2.5%，馬鈴薯浸出液18-22%，瓊脂1.5-2%。(2)、離子束誘變將孢子懸液涂布于無菌平皿上，風(fēng)干，進(jìn)行脈沖式N+離子注入，選用N+離子的能量和劑量分別是IOKev和1.3XIO15NVcm2；然后將離子注入過的孢子懸液用無菌水洗脫后，稀釋涂布于木糖篩選平板培養(yǎng)基上在25-30°C下培養(yǎng)，挑選出能在木糖篩選平板培養(yǎng)基上生長且菌絲生長旺盛的的菌落，作為初篩的單菌落，將初篩的單菌落轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)，接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)接搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，挑選出生物量和油脂含量高的菌種作為復(fù)篩的結(jié)果，然后對復(fù)篩的結(jié)果重復(fù)進(jìn)行離子束誘變、初篩和復(fù)篩過程；所述的木糖篩選平板培養(yǎng)基中主要組分的重量百分含量為木糖2%，蛋白胨0.5%，酵母膏1.0%，基質(zhì)蒸餾水，pH8.0，28°C；(3)、液體培養(yǎng)將離子束誘變、篩選過的菌種于PH值為7.5-8.5液體培養(yǎng)基中在28-30°C下培養(yǎng)18-24小時(shí)，液體培養(yǎng)基中主要原料組分的重量百分比為葡萄糖4_6%、木糖2-5%、蛋白胨0.5-1%、豆粕0.5-1.5%，基質(zhì)蒸餾水；所述的液體培養(yǎng)的搖床轉(zhuǎn)度為180-230rpm，PH值為8，優(yōu)選的液體培養(yǎng)基中主要原料組分的重量百分比為葡萄糖5%、木糖3%、蛋白胨0.7%、豆粕；(4)、擴(kuò)大培養(yǎng)將液體培養(yǎng)后的菌種接種于發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基中在28-30°C下培養(yǎng)10-12天，發(fā)酵培養(yǎng)基中原料組分的重量百分比為葡萄糖4-6%、木糖2-5%、蛋白胨0.5-1%、豆粕0.5-1.5%，基質(zhì)為蒸餾水；(5)、菌絲體的油脂提取將擴(kuò)大培養(yǎng)后得到的菌絲體進(jìn)行收集，然后進(jìn)行離心、洗滌、100-110°C干燥、萃取得成品。所述的擴(kuò)大培養(yǎng)是將液體培養(yǎng)后的菌種以8-12%的比例接種于發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐的通氣量為1.0-1.5L/min，攪拌速度為400-500轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵罐內(nèi)PH值為7.5-8.5，溫度為280C，時(shí)間為10-12天，發(fā)酵培養(yǎng)基中主要原料組分的重量百分比為葡萄糖5%、木糖3%、蛋白胨0.7%、豆粕1%，基質(zhì)為蒸餾水，發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值為7.5-8.5，溫度為28°C；所述的生產(chǎn)含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，其特征在于所述的木糖選用含有五碳糖的木質(zhì)纖維素水解糖；所述的油脂的萃取選用石油醚、正己烷。本發(fā)明各種培養(yǎng)基的基質(zhì)一般均為蒸餾水。權(quán)利要求利用含木糖的底物發(fā)酵生產(chǎn)含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，其特征在于包括以下步驟(1)、原始菌種的活化將高山被孢霉菌種接種到斜面培養(yǎng)基上在25-30℃下培養(yǎng)7-10天，選取菌絲和孢子生長旺盛的新鮮平板，洗脫下平板孢子，過濾得孢子懸液；(2)、離子束誘變將孢子懸液涂布于無菌平皿上，風(fēng)干，進(jìn)行脈沖式N+離子注入，選用N+離子的能量和劑量分別是10Kev和1.3×1015N+/cm2；然后將離子注入過的孢子懸液用無菌水洗脫后，稀釋涂布于木糖篩選平板培養(yǎng)基上在25-30℃下培養(yǎng)，挑選出能在木糖篩選平板培養(yǎng)基上生長且菌絲生長旺盛的的菌落，作為初篩的單菌落，將初篩的單菌落轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)，接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)接搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，挑選出生物量和油脂含量高的菌種作為復(fù)篩的結(jié)果，然后對復(fù)篩的結(jié)果重復(fù)進(jìn)行離子束誘變、初篩和復(fù)篩過程；所述的木糖篩選平板培養(yǎng)基中主要組分的重量百分含量為木糖2％，蛋白胨0.5％，酵母膏1.0％，基質(zhì)蒸餾水，pH8.0，28℃；(3)、液體培養(yǎng)將離子束誘變、篩選過的菌種于PH值為7.5-8.5液體培養(yǎng)基中在28-30℃下培養(yǎng)18-24小時(shí)，液體培養(yǎng)基中主要原料組分的重量百分比為葡萄糖4-6％、木糖2-5％、蛋白胨0.5-1％、豆粕0.5-1.5％，基質(zhì)蒸餾水；(4)、擴(kuò)大培養(yǎng)將液體培養(yǎng)后的菌種接種于發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基中在28-30℃下培養(yǎng)10-12天，發(fā)酵培養(yǎng)基中原料組分的重量百分比為葡萄糖4-6％、木糖2-5％、蛋白胨0.5-1％、豆粕0.5-1.5％，基質(zhì)為蒸餾水；(5)、菌絲體的油脂提取將擴(kuò)大培養(yǎng)后得到的菌絲體進(jìn)行收集，然后進(jìn)行離心、洗滌、100-110℃干燥、萃取得成品。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，其特征在于所述的斜面培養(yǎng)基中主要原料成分的重量百分份比為葡萄糖1.5-2.5%，馬鈴薯浸出液18-22%，瓊脂1.5-2%ο3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，其特征在于所述的液體培養(yǎng)的搖床轉(zhuǎn)度為180-230rpm，PH值為8，液體培養(yǎng)基中主要原料組分的重量百分比為葡萄糖5%、木糖3%、蛋白胨0.7%、豆粕；所述的擴(kuò)大培養(yǎng)是將液體培養(yǎng)后的菌種以8-12%的比例接種于發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐的通氣量為1.0-1.5L/min,攪拌速度為400-500轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵罐內(nèi)PH值為7.5-8.5，溫度為28°C，時(shí)間為10-12天，發(fā)酵培養(yǎng)基中主要原料組分的重量百分比為葡萄糖5%、木糖3%、蛋白胨0.7%、豆粕1%，基質(zhì)為蒸餾水，發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值為7.5-8.5，溫度為28°C。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，其特征在于所述的木糖選用含有五碳糖的木質(zhì)纖維素水解糖；所述的油脂的萃取選用石油醚、正己烷。全文摘要本發(fā)明公開了一種利用含木糖的底物發(fā)酵生產(chǎn)含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，采用低能離子束誘變的方法，誘變篩選出可以高效利用木糖的高山被孢霉，以葡萄糖和木糖的混合糖作為碳源發(fā)酵生產(chǎn)富含花生四烯酸的微生物油脂。本發(fā)明利用廉價(jià)的木質(zhì)纖維素水解糖為發(fā)酵底物，經(jīng)產(chǎn)油微生物轉(zhuǎn)化獲取油脂，將顯著降低微生物油脂生產(chǎn)成本，形成節(jié)約耕地、可連續(xù)生產(chǎn)的油脂獲取路線，并且還有利于環(huán)境保護(hù)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展。文檔編號C12R1/645GK101805760SQ20091025173公開日2010年8月18日申請日期2009年12月31日優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日發(fā)明者張臘梅,袁成凌,貢國鴻,鄭之明申請人:中國科學(xué)院等離子體物理研究所