專利名稱：：用于同時檢測解脲支原體、人型支原體和生殖器支原體的組合物和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于檢測支原體的組合物和試劑盒，更具體地，本發(fā)明涉及用于同時檢測解脲支原體、人型支原體和生殖器支原體的組合物和試劑盒。
背景技術(shù)：
：解脲支原體(Ureaplasmaurealyticum,UU)、人型支原體(Mycoplasmahominis,MH)及生殖器支原體(Mycoplasmagenitalium,MG)是引起人群泌尿生殖系統(tǒng)感染的常見寄生菌。人泌尿生殖道支原體感染不僅可引起泌尿生殖器官發(fā)生病變，如前列腺炎、附睪炎、陰道炎、宮頸炎等，還可侵犯泌尿生殖器官所屬的淋巴結(jié)，并通過血行播散侵犯全身各重要組織和器官，引起新生兒腦膜炎、先天性肺炎、不孕、流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、低體重兒等各類現(xiàn)象。因此，人泌尿生殖道支原體感染導(dǎo)致的一系列病變，嚴重危害患者的身心健康，已經(jīng)成為世界性的嚴重社會問題和公共衛(wèi)生問題，被認為是當今危害人群健康的重要疾病之ο目前對于解脲支原體、人型支原體以及生殖器支原體的檢測方法主要有涂片檢查、細菌和細胞培養(yǎng)、血清學實驗和聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)法。其中最準確的且可以同時定性定量的方法為實時熒光定量PCR法。所述實時熒光定量PCR法是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號的累積實時監(jiān)測整個PCR過程，最后通過標準曲線對待測模板進行定量分析的方法。此外，由于解脲支原體、人型支原體以及生殖器支原體引起的疾病癥狀類似，但是在臨床上需要分別進行針對性治療；然而所述三種支原體存在一定的序列相似性，因此在合并感染的患者中得到的混合樣本進行PCR擴增時會產(chǎn)生相互干擾，繼而很容易產(chǎn)生錯誤的診斷結(jié)果，延誤最佳的針對性治療時機。因此一般對疑似癥狀的病人只能通過逐一檢測致病微生物解脲支原體、人型支原體以及生殖器支原體來盡量確診，造成操作過程費時費力、成本高并且準確率低，還不利于實現(xiàn)對混合感染(兩種以上支原體感染)的高效準確的檢測。綜上亟需能夠?qū)崿F(xiàn)同時檢測解脲支原體、人型支原體和生殖器支原體的組合物和試齊U盒。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有檢測解脲支原體、人型支原體和生殖器支原體的組合物和試劑盒存在所述三種支原體相互干擾，不能準確同時檢測解脲支原體、人型支原體和生殖器支原體的缺點，提供一種用于同時檢測解脲支原體、人型支原體和生殖器支原體的組合物，使用該組合物可以實現(xiàn)在同一反應(yīng)體系中同時準確檢測解脲支原體、人型支原體和生殖器支原體，并且不存在相互干擾的缺陷，減少操作人員的操作時間，降低檢測成本。本發(fā)明的第二個目的是提供包括所述組合物的用于同時檢測解脲支原體、人型支原體和生殖器支原體的試劑盒。本發(fā)明提供了一種用于同時檢測解脲支原體、人型支原體和生殖器支原體的組合物，其中，所述組合物包括以下序列1)長度為15-30個核苷酸的用于PCR擴增解脲支原體靶核酸序列的第一引物，該引物的GC含量為20-80%，該引物的序列包括a)SEQIDNo1所示的序列，b)SEQIDNo1所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有至多5個核苷酸差異的序列；2)長度為15-30個核苷酸的用于PCR擴增解脲支原體靶核酸序列的第二引物，該引物的GC含量為20-80%，該引物的序列包括a)SEQIDNo:2所示的序列，b)SEQIDNo2所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有至多5個核苷酸差異的序列；3)長度為15-30個核苷酸的用于PCR擴增人型支原體靶核酸序列的第一引物，該引物的GC含量為20-80%，該引物的序列包括a)SEQIDNo:3所示的序列，b)SEQIDNo3所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有至多5個核苷酸差異的序列；4)長度為15-30個核苷酸的用于PCR擴增人型支原體靶核酸序列的第二引物，該引物的GC含量為20-80%，該引物的序列包括a)SEQIDNo4所示的序列，b)SEQIDNo4所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者C)與a)或b)具有至多5個核苷酸差異的序列；5)長度為15-30個核苷酸的用于PCR擴增生殖器支原體靶核酸序列的第一引物，該引物的GC含量為20-80%，該引物的序列包括a)SEQIDNo:5所示的序列，b)SEQIDNo5所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者C)與a)或b)具有至多5個核苷酸差異的序列；6)長度為15-30個核苷酸的用于PCR擴增生殖器支原體靶核酸序列的第二引物，該引物的GC含量為20-80%，該引物的序列包括a)SEQIDNo:6所示的序列，b)SEQIDNo6所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者C)與a)或b)具有至多5個核苷酸差異的序列；7)長度為15-45個核苷酸的與1)和2)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的GC含量為20-80%，該探針的序列包括a)SEQIDNo:7所示的序列或其互補序列，b)SEQIDNo7所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，c)SEQIDNo:7所示序列的互補序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者d)與a)或b)或c)具有至多5個核苷酸差異的序列；8)長度為15-45個核苷酸的與3)和4)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的GC含量為20-80%，該探針的序列包括a)SEQIDNo:8所示的序列或其互補序列，b)SEQIDNo8所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，c)SEQIDNo8所示序列的互補序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者d)與a)或b)或c)具有至多5個核苷酸差異的序列；9)長度為15-45個核苷酸的與5)和6)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的GC含量為20-80%，該探針的序列包括a)SEQIDNo:9所示的序列或其互補序列，b)SEQIDNo9所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，c)SEQIDNo9所示序列的互補序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者d)與a)或b)或C)具有至多5個核苷酸差異的序列；其中，7)_9)所述的探針在5’端帶有互不相同的熒光報告基團，并且在除5'端外的任意一個位置上帶有淬滅基團。本發(fā)明還提供了一種用于同時檢測解脲支原體、人型支原體和生殖器支原體的試劑盒，該試劑盒含有聚合酶鏈式反應(yīng)液、耐熱DNA聚合酶及陰性對照品，其中，所述試劑盒還含有本發(fā)明的組合物。本發(fā)明的用于同時檢測解脲支原體、人型支原體和生殖器支原體的組合物和試劑盒可以在一個反應(yīng)體系內(nèi)同時檢測三種不同的支原體，不僅提高了泌尿生殖系統(tǒng)感染性疾病的早期檢出率，而且減少了操作人員的操作時間，降低了檢測成本，還減輕了病人經(jīng)濟負擔。圖1為本發(fā)明實施例1在PCR引物擴增解脲支原體、人型支原體和生殖器支原體靶核酸序列后所得PCR產(chǎn)物的電泳照片；圖2為本發(fā)明實施例1同時檢測尿液樣品中解脲支原體、人型支原體和生殖器支原體的熒光定量PCR圖；圖3為本發(fā)明實施例2同時檢測尿液樣品中解脲支原體、人型支原體和生殖器支原體的熒光定量PCR圖；圖4為本發(fā)明實施例3同時檢測前列腺液樣品中解脲支原體、人型支原體和生殖器支原體的熒光定量PCR圖；圖5為本發(fā)明實施例4同時檢測宮頸分泌物樣品中解脲支原體、人型支原體和生殖器支原體的熒光定量PCR圖；圖6為IO3拷貝/毫升、IO4拷貝/毫升、IO5拷貝/毫升和IO6拷貝/毫升的解脲支原體陽性對照品的熒光定量PCR疊加圖；圖7為IO3拷貝/毫升、IO4拷貝/毫升、IO5拷貝/毫升和IO6拷貝/毫升的人型支原體陽性對照品的熒光定量PCR疊加圖；圖8為IO3拷貝/毫升、IO4拷貝/毫升、IO5拷貝/毫升和IO6拷貝/毫升的生殖器支原體陽性對照品的熒光定量PCR疊加圖。具體實施例方式本發(fā)明提供了一種用于同時檢測解脲支原體、人型支原體和生殖器支原體的組合物，其中，所述組合物包括以下序列1)長度為15-30個核苷酸的用于PCR擴增解脲支原體靶核酸序列的第一引物，該引物的GC含量為20-80%，該引物的序列包括a)SEQIDNo1所示的序列，b)SEQIDNo1所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有至多5個核苷酸差異的序列；2)長度為15-30個核苷酸的用于PCR擴增解脲支原體靶核酸序列的第二引物，該引物的GC含量為20-80%，該引物的序列包括a)SEQIDNo:2所示的序列，b)SEQIDNo2所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者C)與a)或b)具有至多5個核苷酸差異的序列；3)長度為15-30個核苷酸的用于PCR擴增人型支原體靶核酸序列的第一引物，該引物的GC含量為20-80%，該引物的序列包括a)SEQIDNo:3所示的序列，b)SEQIDNo3所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者C)與a)或b)具有至多5個核苷酸差異的序列；4)長度為15-30個核苷酸的用于PCR擴增人型支原體靶核酸序列的第二引物，該引物的GC含量為20-80%，該引物的序列包括a)SEQIDNo4所示的序列，b)SEQIDNo4所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者C)與a)或b)具有至多5個核苷酸差異的序列；5)長度為15-30個核苷酸的用于PCR擴增生殖器支原體靶核酸序列的第一引物，該引物的GC含量為20-80%，該引物的序列包括a)SEQIDNo:5所示的序列，b)SEQIDNo5所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者C)與a)或b)具有至多5個核苷酸差異的序列；6)長度為15-30個核苷酸的用于PCR擴增生殖器支原體靶核酸序列的第二引物，該引物的GC含量為20-80%，該引物的序列包括a)SEQIDNo:6所示的序列，b)SEQIDNo6所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有至多5個核苷酸差異的序列；7)長度為15-45個核苷酸的與1)和2)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的GC含量為20-80%，該探針的序列包括a)SEQIDNo:7所示的序列或其互補序列，b)SEQIDNo7所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，c)SEQIDNo:7所示序列的互補序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者d)與a)或b)或c)具有至多5個核苷酸差異的序列；8)長度為15-45個核苷酸的與3)和4)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的GC含量為20-80%，該探針的序列包括a)SEQIDNo:8所示的序列或其互補序列，b)SEQIDNo8所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，c)SEQIDNo8所示序列的互補序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者d)與a)或b)或c)具有至多5個核苷酸差異的序列；9)長度為15-45個核苷酸的與5)和6)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的GC含量為20-80%，該探針的序列包括a)SEQIDNo:9所示的序列或其互補序列，b)SEQIDNo9所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，c)SEQIDNo9所示序列的互補序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者d)與a)或b)或c)具有至多5個核苷酸差異的序列；其中，7)_9)所述的探針在5’端帶有互不相同的熒光報告基團，并且在除5'端外的任意一個位置上帶有淬滅基團。在本發(fā)明中，“引物”可以是天然的、合成的或者是二者嵌合的寡核苷酸。引物可以作為在一定條件下誘發(fā)DNA復(fù)制的起始點。在上述條件下可以誘發(fā)與靶核酸鏈互補的引物擴增產(chǎn)物，即在四種不同的三磷酸脫氧核糖核苷及一種聚合試劑(DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶)存在下，在一種合適的緩沖液中，在合適的溫度下進行上述擴增。優(yōu)選的引物是單鏈寡脫氧核糖核苷酸。引物的合適長度取決于該引物的設(shè)計用途，但一般在15-30個核苷酸之間，較短的引物分子通常需要較低的溫度，從而與模板形成充分穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。引物不必反映模板的準確序列，但必須充分互補，以與模板雜交并引發(fā)DNA合成。在本發(fā)明中，術(shù)語“探針”是指能識別特異核苷酸序列的帶標記的一段單鏈DNA或RNA分子，它只與被檢測的特定核苷酸序列結(jié)合。探針位置盡可能地靠近上游引物。為保證結(jié)合特異性，探針的合適長度一般在15-45個核苷酸之間。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，引物和探針上少數(shù)核苷酸殘基的變化，尤其是引物和探針在5’端出現(xiàn)的少數(shù)核苷酸的改變，只能造成該核苷酸的錯配，但不會造成整個DNA復(fù)制合成過程無法進行，進而不會引起PCR產(chǎn)物產(chǎn)量的明顯波動。因此由上述“與a)或b)具有至多5個核苷酸差異的序列”以及“與a)或b)或c)具有至多5個核苷酸差異的序列”也可以得到正確的足夠的PCR熒光信號，因此所述序列也應(yīng)該包括在本發(fā)明中。另外，對本發(fā)明的引物/探針可以實施本領(lǐng)域常規(guī)的修飾以提高其穩(wěn)定性，例如，硫化(磷酸骨架上的非橋氧原子被硫原子代替)、甲基化、形成肽核酸、以及在核糖的2'位置引入如甲基和/或氟等的取代基等。優(yōu)選地，本發(fā)明所述組合物包括以下序列1)長度為25-30個核苷酸的用于PCR擴增解脲支原體靶核酸序列的第一引物，該引物的GC含量為25-75%，該引物的序列包括a)SEQIDNo:1所示的序列，b)SEQIDNo1所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有至多3個核苷酸差異的序列；2)長度為18-30個核苷酸的用于PCR擴增解脲支原體靶核酸序列的第二引物，該引物的GC含量為25-75%，該引物的序列包括a)SEQIDNo:2所示的序列，b)SEQIDNo2所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有至多3個核苷酸差異的序列；3)長度為25-30個核苷酸的用于PCR擴增人型支原體靶核酸序列的第一引物，該引物的GC含量為25-75%，該引物的序列包括a)SEQIDNo:3所示的序列，b)SEQIDNo3所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有至多3個核苷酸差異的序列；4)長度為22-30個核苷酸的用于PCR擴增人型支原體靶核酸序列的第二引物，該引物的GC含量為25-75%，該引物的序列包括a)SEQIDNo:4所示的序列，b)SEQIDNo4所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有至多3個核苷酸差異的序列；5)長度為25-30個核苷酸的用于PCR擴增生殖器支原體靶核酸序列的第一引物，該引物的GC含量為25-75%，該引物的序列包括a)SEQIDNo:5所示的序列，b)SEQIDNo5所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有至多3個核苷酸差異的序列；6)長度為18-30個核苷酸的用于PCR擴增生殖器支原體靶核酸序列的第二引物，該引物的GC含量為25-75%，該引物的序列包括a)SEQIDNo:6所示的序列，b)SEQIDNo6所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有至多3個核苷酸差異的序列；7)長度為25-45個核苷酸的與1)和2)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的GC含量為25-75%，該探針的序列包括a)SEQIDNo:7所示的序列或其互補序列，b)SEQIDNo7所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，c)SEQIDNo:7所示序列的互補序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者d)與a)或b)或c)具有至多3個核苷酸差異的序列；8)長度為25-45個核苷酸的與3)和4)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的GC含量為25-75%，該探針的序列包括a)SEQIDNo:8所示的序列或其互補序列，b)SEQIDNo8所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，c)SEQIDNo:8所示序列的互補序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者d)與a)或b)或c)具有至多3個核苷酸差異的序列；9)長度為25-45個核苷酸的與5)和6)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的GC含量為25-75%，該探針的序列包括a)SEQIDNo:9所示的序列或其互補序列，b)SEQIDNo9所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，c)SEQIDNo:9所示序列的互補序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者d)與a)或b)或c)具有至多3個核苷酸差異的序列；其中，7)_9)所述的探針在5’端帶有互不相同的熒光報告基團，并且除5'端外的任意一個位置上帶有淬滅基團。更優(yōu)選地，本發(fā)明所述組合物包括以下序列1)長度為25-30個核苷酸的用于PCR擴增解脲支原體靶核酸序列的第一引物，該引物的GC含量為30-70%，該引物的序列包括a)SEQIDNo:1所示的序列，b)SEQIDNo1所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有一個或兩個核苷酸差異的序列；2)長度為18-30個核苷酸的用于PCR擴增解脲支原體靶核酸序列的第二引物，該引物的GC含量為30-70%，該引物的序列包括a)SEQIDNo:2所示的序列，b)SEQIDNo2所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有一個或兩個核苷酸差異的序列；3)長度為25-30個核苷酸的用于PCR擴增人型支原體靶核酸序列的第一引物，該引物的GC含量為30-70%，該引物的序列包括a)SEQIDNo:3所示的序列，b)SEQIDNo3所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有一個或兩個核苷酸差異的序列；4)長度為22-30個核苷酸的用于PCR擴增人型支原體靶核酸序列的第二引物，該引物的GC含量為30-70%，該引物的序列包括a)SEQIDNo:4所示的序列，b)SEQIDNo4所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有一個或兩個核苷酸差異的序列；5)長度為25-30個核苷酸的用于PCR擴增生殖器支原體靶核酸序列的第一引物，該引物的GC含量為30-70%，該引物的序列包括a)SEQIDNo:5所示的序列，b)SEQIDNo5所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有一個或兩個核苷酸差異的序列；6)長度為18-30個核苷酸的用于PCR擴增生殖器支原體靶核酸序列的第二引物，該引物的GC含量為30-70%，該引物的序列包括a)SEQIDNo:6所示的序列，b)SEQIDNo6所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有一個或兩個核苷酸差異的序列；7)長度為25-45個核苷酸的與1)和2)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的GC含量為30-70%，該探針的序列包括a)SEQIDNo:7所示的序列或其互補序列，b)SEQIDNo7所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，c)SEQIDNo7所示序列的互補序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段；或者d)與a)或b)或c)具有一個或兩個核苷酸差異的序列；8)長度為25-45個核苷酸的與3)和4)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的GC含量為30-70%，該探針的序列包括a)SEQIDNo:8所示的序列或其互補序列，b)SEQIDNo8所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，c)SEQIDNo8所示序列的互補序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段；或者d)與a)或b)或c)具有一個或兩個核苷酸差異的序列；9)長度為25-45個核苷酸的與5)和6)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的GC含量為30-70%，該探針的序列包括a)SEQIDNo:9所示的序列或其互補序列，b)SEQIDNo9所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，c)SEQIDNo9所示序列的互補序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段；或者d)與a)或b)或c)具有一個或兩個核苷酸差異的序列；其中，7)_9)所述的探針在5’端帶有互不相同的熒光報告基團，并且除5'端外的任意一個的位置上帶有淬滅基團。進一步優(yōu)選地，本發(fā)明所述組合物包括以下序列1)長度為25-30個核苷酸的用于PCR擴增解脲支原體靶核酸序列第一引物，該引物的GC含量為30-70%，該引物的序列包括a)SEQIDNo:1所示的序列，或者b)SEQIDNo1所示的序列的至少18個核苷酸連續(xù)的片段；2)長度為18-30個核苷酸的用于PCR擴增解脲支原體靶核酸序列第二引物，該引物的GC含量為30-70%，該引物的序列包括a)SEQIDNo:2所示的序列，或者b)SEQIDNo2所示的序列的至少16個核苷酸連續(xù)的片段；3)長度為25-30個核苷酸的用于PCR擴增人型支原體靶核酸序列第一引物，該引物的GC含量為30-70%，該引物的序列包括a)SEQIDNo:3所示的序列，或者b)SEQIDNo3所示的序列的至少18個核苷酸連續(xù)的片段；4)長度為22-30個核苷酸的用于PCR擴增人型支原體靶核酸序列第二引物，該引物的GC含量為30-70%，該引物的序列包括a)SEQIDNo4所示的序列，或者b)SEQIDNo4所示的序列的至少18個核苷酸連續(xù)的片段；5)長度為25-30個核苷酸的用于PCR擴增生殖器支原體靶核酸序列第一引物，該引物的GC含量為30-70%，該引物的序列包括a)SEQIDNo:5所示的序列，或者b)SEQIDNo5所示的序列的至少18個核苷酸連續(xù)的片段；6)長度為18-30個核苷酸的用于PCR擴增生殖器支原體靶核酸序列第二引物，該引物的GC含量為30-70%，該引物的序列包括a)SEQIDNo:6所示的序列，或者b)SEQIDNo6所示的序列的至少16個核苷酸連續(xù)的片段；7)長度為25-45個核苷酸的與1)和2)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的GC含量為30-70%，該探針的序列包括a)SEQIDNo:7所示的序列或其互補序列，b)SEQIDNo7所示的序列的至少18個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)SEQIDNo7所示序列的互補序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段；8)長度為25-45個核苷酸的與3)和4)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的GC含量為30-70%，該探針的序列包括a)SEQIDNo:8所示的序列或其互補序列，b)SEQIDNo8所示的序列的至少18個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)SEQIDNo8所示序列的互補序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段；9)長度為25-45個核苷酸的與5)和6)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的GC含量為30-70%，該探針的序列包括a)SEQIDNo:9所示的序列或其互補序列，或者b)SEQIDNo9所示的序列的至少18個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)SEQIDNo9所示序列的互補序列的至少18個核苷酸連續(xù)的片段；其中，7)_9)所述的探針在5’端帶有互不相同的熒光報告基團，并且除5'端外的任意一個的位置上帶有淬滅基團。進一步優(yōu)選地，本發(fā)明所述組合物由以下序列組成1)用于PCR擴增解脲支原體靶核酸序列的第一引物，該引物的序列為如SEQIDNo1所示的序列；2)用于PCR擴增解脲支原體靶核酸序列的第二引物，該引物的序列為如SEQIDNo2所示的序列；3)用于PCR擴增人型支原體靶核酸序列的第一引物，該引物的序列為如SEQIDNo3所示的序列；4)用于PCR擴增人型支原體靶核酸序列的第二引物，該引物的序列為如SEQIDNo4所示的序列；5)用于PCR擴增生殖器支原體靶核酸序列的第一引物，該引物的序列為如SEQIDNo5所示的序列；6)用于PCR擴增生殖器支原體靶核酸序列的第二引物，該引物的序列為如SEQIDNo6所示的序列；7)與1)和2)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的序列為如SEQIDNo7所示的序列或其互補序列；8)與3)和4)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的序列為如SEQIDNo8所示的序列或其互補序列；9)與5)和6)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的序列為如SEQIDNo9所示的序列或其互補序列；其中，7)_9)所述的探針在5’端帶有互不相同的熒光報告基團，并且在在3’端帶有淬滅基團。引物和探針的GC含量與解鏈溫度密切相關(guān)，在保證PCR熒光定量的準確性方面起重要作用，本發(fā)明所述引物和探針的GC含量還可以更進一步優(yōu)選35-65%。本發(fā)明的組合物中探針上所帶有的所述熒光報告基團和所述淬滅基團可以為本領(lǐng)域常用的用作熒光報告基團和淬滅基團的物質(zhì)。只要滿足所述熒光報告基因在所述淬滅基團的上游，且所述熒光報告基團的發(fā)射波長小于所述淬滅基團的吸收波長。所述熒光報告基團和所述淬滅基團按照上述原則可以選自由6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein,FAM)、四氣_6_幾基焚光素(tetrachloro-6-carboxyfluorescein,TET)、六氯-6-甲基熒光素(Hexachloro-6-methylfluorescein，HEX)、6_羧基四甲基羅丹明(6-carboxytetramethylrhodamine，TAMRA)、磺酰羅丹明(Sulforhodamine101，TexasRed)、羧基_X_羅丹明(Carboxy-x-rhodamine，R0X)、花菁3(cyanine3，Cy3)、花菁3.5(cyanine3.5，Cy3.5)、花菁5(cyanine5,Cy5)、花菁5.5(cyanine5.5，Cy5.5)、黑洞淬滅劑1(BlackHoleQuencher1，BHQ1)、黑洞淬滅劑2(BlackHoleQuencher2，BHQ2)、黑洞淬滅劑3(BlackHoleQuencher3，BHQ3)、4_(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸(4-(4，-dimethylaminophenylazo)benzoicacid,DABCYL)、6-羧基-4，，5，-二氯_2，，7，-二甲氧基熒光素琥珀酰亞胺酯(6-CarboXy-4，，5，-dichloro-2，，7，-dimethoxyfluorescein，JOE)和VIC熒光染料(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，AppliedBiosystems.Inc，可商購)所組成的組中。優(yōu)選地，所述熒光報告基團選自由6_羧基熒光素、六氯-6-甲基熒光素、VIC熒光染料、四氯-6-羧基熒光素、羧基-X-羅丹明、6-羧基四甲基羅丹明、磺酰羅丹明、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基熒光素琥珀酰亞胺酯、花菁3、花菁5和花菁5.5所組成的組中；所述淬滅基團選自由6-羧基四甲基羅丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、BHQ1、BHQ2和BHQ3所組成的組中。更優(yōu)選地，按照下表1所示來選擇熒光報告基團和淬滅基團。黑洞淬滅劑(BHQ)可以從例如生物搜索技術(shù)公司(BiosearchTechnologies,Inc)等公司商購。表1常見淬滅基團以及與之相匹配的熒光報告基團<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>可以通過要求完成引物合成的公司在合成引物和探針的同時，添加所述熒光報告基團和淬滅基團作為標記。所述引物合成公司包括但不限于，例如，柏業(yè)貿(mào)易(上海)有限公司(Bioneer)、上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司、寶生物工程(大連)有限公司、上海英駿生物技術(shù)有限公司(Irwitrogen)等?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域常用的熒光定量PCR儀完成本發(fā)明的熒光PCR定性和定量過程。所述熒光定量PCR儀包括但不限于，例如，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(AppliedBiosystems)的ABI7000型、7300型、7500型、7700型、7900型和St印One型熒光定量PCR儀等；德國艾本德股份公司(EppendorfAG)的Mastercyclereprealplex等；瑞士羅氏公司(RocheGroup)的=LightCycler2.0、LightCycler480禾口Rotor—Gene3000等；美國Stratagene公司的Mx3005P、Mx3000P、Mx4000等；中山大學達安基因股份有限公司的DA7600等；杭州博日科技有限公司的LineGeneI、LineGeneII、LineGeneK、LineGene3310/3320和LineGene9600等；以及上海宏石醫(yī)療科技有限公司的SLAN等。本發(fā)明還提供了一種用于同時檢測解脲支原體、人型支原體和生殖器支原體的試劑盒，該試劑盒含有聚合酶鏈式反應(yīng)液、耐熱DNA聚合酶及陰性對照品，其中，所述試劑盒還含有本發(fā)明的組合物。本發(fā)明的試劑盒除了使用本發(fā)明的組合物作為引物和探針外，試劑盒的其他組成成分可以使用本領(lǐng)域常用的檢測支原體PCR檢測法所用到的成分。比如可以使用本領(lǐng)域常用的聚合酶鏈式反應(yīng)液、耐熱DNA聚合酶及陰性對照品。本發(fā)明的試劑盒既可以對待測樣品中的解脲支原體、人型支原體和生殖器支原體進行同時的定性檢測，也可以對待測樣品中的解脲支原體、人型支原體和生殖器支原體進行同時的定量檢測。此外，由于本發(fā)明試劑盒的特異性和靈敏度高。即使不使用陽性對照品，如果待測生物樣品產(chǎn)生了PCR熒光信號，確診患者患有一種、兩種或三種相應(yīng)支原體的準確率也可以達到90%以上。因此本發(fā)明的試劑盒可以不含有陽性對照品。當然，本發(fā)明試劑盒可以包括本領(lǐng)域常用的陽性對照品，比如三種支原體(解脲支原體、人型支原體和生殖器支原體)的總DNA、三種支原體核糖體16SrRNA完整基因(如SEQIDNo13-15所示，分別來自GenBank:L08642.UGenBank:Μ96660·1和GenBankΧ77334.1)等。所述陽性對照品的濃度達到能產(chǎn)生足夠的熒光信號即可。在進行定性檢測時，每種支原體僅需要使用一個濃度的陽性對照品，并將待測樣品得到的熒光信號與陽性對照品得到的熒光信號比較即可；在進行定量檢測時，每種支原體需要使用一系列梯度濃度的陽性對照品，在得到它們標準曲線后，將待測樣品得到的熒光信號按照同樣的方法和條件量化進行比較即可。優(yōu)選地，所述陽性對照品為IO3-IO8拷貝/毫升的解脲支原體質(zhì)粒DNA溶液、IO3-IO8拷貝/毫升的人型支原體質(zhì)粒DNA溶液和IO3-IO8拷貝/毫升的生殖器支原體質(zhì)粒DNA溶液。它們可以形成從IO3拷貝/毫升到IO8拷貝/毫升的濃度梯度，每兩個相鄰的梯度之間濃度相差10倍。更優(yōu)選所述陽性對照品為IO3-IO6拷貝/毫升支原體質(zhì)粒DNA溶液，每兩個相鄰的梯度之間濃度相差10倍。將DNA片段連接在質(zhì)粒上，有利于DNA片段的穩(wěn)定保存。本發(fā)明所述支原體質(zhì)粒DNA由支原體DNA片段和連接該片段的質(zhì)粒載體組成。優(yōu)選地，所述支原體質(zhì)粒DNA由支原體DNA片段和質(zhì)粒載體組成，所述解脲支原體DNA片段為如SEQIDNo:10所示的解脲支原體核糖體16SrRNA基因擴增產(chǎn)物，由SEQIDNo:1和由SEQIDNo:2從前文所述樣品的核酸提取液中擴增而來，所述人型支原體DNA片段為如SEQIDNo:11所示的人型支原體核糖體16SrRNA基因擴增產(chǎn)物，由SEQIDNo:3和由SEQIDNo:4從前文所述樣品的核酸提取液中擴增而來，所述生殖器支原體DNA片段為如SEQIDNo12所示的生殖器支原體核糖體16SrRNA基因擴增產(chǎn)物由SEQIDNo:5和由SEQIDNo:6從前文所述樣品的核酸提取液中擴增而來(如圖1所示)。所述質(zhì)粒載體可以為粘末端克隆載體，也可以為鈍末端克隆載體。所述質(zhì)粒載體非限制性的例子包括PKK質(zhì)粒(Clonetech)、pUC質(zhì)粒、pET質(zhì)粒、pTriex質(zhì)粒(Novagen,Inc.，Madison,WI)、pRSET、pREP質(zhì)粒(InVitrogen,SanDiego,CA)，pMAL質(zhì)粒(NewEnglandBiolabs，Beverly，ΜΑ)，以及pEASY-BluntCloningVector和pEASY_T3CloningVector(以上兩種同屬北京全式金生物技術(shù)有限公司的T質(zhì)粒系列)。可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法來制備質(zhì)粒DNA溶液，將DNA片段(三種支原體核糖體16SrRNA完整基因、或者SEQIDNo10-12所示的序列等)連接在質(zhì)粒上。例如將DNA片段(可以在平頭末端加上合成的接頭以產(chǎn)生粘性末端)經(jīng)兩種核酸內(nèi)切酶雙酶切后，插入到采用同樣的雙酶處理過的粘末端質(zhì)粒載體上或者將DNA片段(三種支原體核糖體16SrRNA完整基因、或者SEQIDNo10-12所示的序列等)通過T4噬菌體DNA連接酶直接連接到pEASY-BluntCloningVector質(zhì)粒(鈍末端克隆載體)上。所述核酸內(nèi)切酶可以使用本領(lǐng)域常用的核酸內(nèi)切酶，例如AatII、AccI、Acc11(FnuDII)、AccIII(BspMII)、AfaI(RsaI)、AflII、AluI、Aorl3HI(BspMII，AccIII)、Aor51HI(Eco47III)、ApaI、ApaLI、BalI、BamHI、BanII(HgiJII)、BciT130I(EcoRII)、BcnI(CauII)、BglI、BglII、BinI(AvrII)、BmeTllOI(AvaI)、BmgT120I(Asul，Cfr131)、Bpull02I(EspI)、Bspl286I(SduI)、Bspl407I、BspT104I(AsuII，NspV)、BspT1071(HgiCI),BssHII(BsePI)、Bstll07I(SnaI)、BstPI(BstEII，Eco065I)、BstXI、Cfr101、ClaI、CpoI(RsrII)、DraI(AhaIII)、EaeI(CfrI)、Eamll05I、Eco52I(XmaIII)、Eco81I(SauI)、EcoO1091(DraII)、Eco065I(BstEII，BstPI)、EcoRI、EcoRV、EcoT14I(StyI)、EcoT22I(AvaIII),FbaI(BelI),FokI,HaeII,HaeIII,HapII(HpaII，MspI),HhaI,HinlI(AcyI,BbiII)、HincII(HindII)、HindIII、HinfI、HpaI、KpnI、MboI(Sau3AI)、MboII、MflI(XhoII)、MluI、MspI(HpaII，HapII)、MunI(MfeI)、NaeI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、NruI、NsbI(AviII，MstI)、PmaCI、PshAI、PshBI(VspI)、Pspl406I(AclI)、PstI、PvuI、PvuII、SacI、SacII、SalI、Sau3AI(MboI)、ScaI、SfiI、SmaI、SmiI(SwaI)、SnaBI、SpeI、SphI、Sse8387I、SspI、StuI、TaqI(TthHB8I)、Tthllll、Van91I(PflMI)、VpaKllBI(AvaII)、XbaI、XhoI禾口XspI(BfaI，MaeI)。本發(fā)明試劑盒的所述陰性對照品可以是本領(lǐng)域常用的各種陰性對照品，只要不產(chǎn)生干擾性的熒光信號即可。所述陰性對照品通常為水，優(yōu)選選自由蒸餾水、去離子水、注射用水、重蒸水和超純水所組成的組中。本發(fā)明的試劑盒還可以包括試劑盒的使用說明書。所述試劑盒的使用說明書所記載的使用方法可以是本領(lǐng)域常規(guī)試劑盒的使用方法。優(yōu)選地，所述試劑盒的使用說明書記載了配合具有不同長度和GC含量的引物和探針的PCR方法。例如，以下實施例中所記載的不同的PCR條件。本發(fā)明的所述試劑盒可以用于檢測的樣品選自由尿液、精液、前列腺液、尿道分泌物、宮頸分泌物和白帶所組成的組中。所述待測樣品可以使用泌尿生殖道常用的獲取樣本的方法取得，例如泌尿生殖道拭子、尿液、前列腺液和精液等。具體地取樣及樣品處理方法操作例如(1)拭子將滅菌白金耳或無菌拭子深入泌尿生殖道(女性為子宮頸管，男性為尿道)1厘米左右，轉(zhuǎn)動數(shù)圈，停留約30秒，取出后置于含生理鹽水的無菌管中，充分擠壓，震蕩后棄去拭子，保留含有標本的洗液即可。(2)尿液收集一次全尿后，2000rpm離心20分鐘，收集沉渣，轉(zhuǎn)移至含生理鹽水的無菌管中即可。(3)精液、前列腺液直接將標本留取于帶有生理鹽水的無菌管中即可?？梢园凑毡绢I(lǐng)域常規(guī)的方法和條件提取待測樣本中的總DNA，以該總DNA為模板，加入本發(fā)明的組合物，完成PCR擴增過程。例如“李金明，實時熒光PCR技術(shù)，人民軍醫(yī)出版社，2007”中所記載的方法。本發(fā)明所涉及的引物/探針通?？梢杂肞CR擴增法、重組法、或人工合成的方法獲得。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明所涉及的引物/探針的核苷酸序列，可以很容易利用PCR進行擴增獲得有關(guān)序列。序列較長時，可以進行兩次或多次PCR擴增，然后將所得片段按正確次序拼接。此外，還可用公知的人工化學合成的方法來合成有關(guān)核苷酸序列。例如，引物合成可以采用固相亞磷酸三酯法，被合成引物的純化方法為聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳。引物在使用前經(jīng)稀釋后，使用紫外分光光度計進行檢測，重新定量，確保其A260/A280>1.7。探針的合成可以采用固相亞磷酸三酯法，并將熒光報告基團(Reporter)和淬滅基團(Quencher)連接上去。探針純化方法采用的是聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳基礎(chǔ)上的變性高效液相色譜(dHPLC)純化，第一步為在連接淬滅基團之前，用PAGE電泳去除大部分雜質(zhì)，特別是會與淬滅基團連接的雜質(zhì)，以提高淬滅基團的連接和純化工作的效率。第二步是在連接了淬滅基團之后再用PAGE電泳在一定條件下將其他雜質(zhì)去除，以獲得純度較高的產(chǎn)品。第三步將探針通過dHPLC進行純化，并檢驗純化后產(chǎn)品的其出峰位置及純度，再用紫外分光光度計在260nm波長下定量。探針在使用前經(jīng)稀釋后，使用紫外分光光度計進行檢測，重新定量，確保其A260/A280>1.7。下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常參照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYorkCoIdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非特別說明，本發(fā)明使用的各種試劑均可以商購，也可以采用本領(lǐng)域常用的方法制備。制備例1男性患者，35歲，發(fā)生尿道口痂膜，尿痛，前列腺炎及附睪炎癥狀，無其他疾病并發(fā)。經(jīng)患者知情同意，取得以下樣品(1)尿液樣品收集一次全尿10ml，在2000rpm下離心20分鐘，棄去上清，收集沉渣。將沉渣轉(zhuǎn)移至含500μ1生理鹽水的1.5ml無菌管中備用。(2)前列腺液樣品取前列腺液10μ1留取于已裝有500μ1生理鹽水的1.5ml無菌管中備用。按照“李金明，實時熒光PCR技術(shù)，人民軍醫(yī)出版社，2007”中第4章第四節(jié)第73-74頁所記載的方法分別提取上述兩種樣品的總DNA，得到兩種總DNA溶液每種各20μ1。^M"Yoshida,Τ.，S.Maeda,Τ.Deguchi,andH.Ishiko.2002.Phylogeny-basedrapididentificationofmycoplasmasandureaplasmasfromurethritispatients.J.Clin.Microbiol.40:105_110”記載的方法，通過測序鑒定上述所得樣品中含有解脲支原體、人型支原體和生殖器支原體的病原體。并且所述三種支原體的核糖體16SrRNA基因序列片段分別與Genbank公開相應(yīng)三種支原體核酸的序列一致。其中解脲支原體與基因庫登錄號(GenbankAccession)L08642.1的序列(SEQIDNo13)一致；人型支原體與基因庫登錄號(GenbankAccession)M96660.1的序列(SEQIDNo14)一致；生殖器支原體與基因庫登錄號(GenbankAccession)X77334.1(SEQIDNo15)的序列一致。制備例2女性患者，27歲，發(fā)生陰道炎及宮頸炎癥狀，無其他疾病并發(fā)。經(jīng)患者知情同意，取得以下宮頸分泌物樣品將無菌拭子深入子宮頸管1厘米左右，轉(zhuǎn)動10圈，停留約30秒，取出后拭子置于含500μ1生理鹽水的1.5ml無菌管中，充分擠壓，震蕩后棄去拭子，保留含有標本的洗液500μ1。按照“李金明，實時熒光PCR技術(shù)，人民軍醫(yī)出版社，2007”中第4章第四節(jié)第73-74頁所記載的方法提取上述樣品的總DNA，得到其總DNA溶液20μ1。^M"Yoshida,Τ.，S.Maeda,Τ.Deguchi，andH.Ishiko.2002.Phylogeny-basedrapididentificationofmycoplasmasandureaplasmasfromurethritispatients.J.Clin.Microbiol.40:105_110”記載的方法，通過測序鑒定上述所得樣品中含有解脲支原體、人型支原體和生殖器支原體的病原體。并且所述三種支原體的核糖體16SrRNA基因序列片段分別與Genbank公開相應(yīng)三種支原體核酸的序列一致。其中解脲支原體與基因庫登錄號(GenbankAccession)L08642.1的序列(SEQIDNo13)一致；人型支原體與基因庫登錄號(GenbankAccession)M96660.1的序列(SEQIDNo14)一致；生殖器支原體與基因庫登錄號(GenbankAccession)X77334.1(SEQIDNo15)的序列一致。制備例3采用固相亞磷酸三酯法分別合成解脲支原體核糖體16SrRNA基因(GenbankAccession:L08642.1)、人型支原體核糖體16SrRNA基因(GenbankAccession:M96660.1)以及生殖器支原體核糖體16SrRNA基因(GenbankAccession:X77334.1)。將所得三種的DNA序列分別通過T4噬菌體DNA連接酶直接連接到pEASY-BluntCloningVector質(zhì)粒(鈍末端克隆載體)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，大量培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，制成IO6拷貝/毫升的三種模擬待測樣品備用。實施例1(1)采用固相亞磷酸三酯法合成表2所列舉的序列表2<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>(2)PCR反應(yīng)擴增靶序列，制備陽性對照品取3個反應(yīng)管，分別加入1種DNA模板和對應(yīng)的兩種PCR引物；DNA模板制備例3制備的模擬待測樣品，每種各3μ1；表2所示的六種引物各0.25μmol/L；北京全式金生物技術(shù)有限公司的PCR預(yù)混液(2XEasyTaqPCRSuperMix),20μ1以純化水補充至40μ1。94°C，5分鐘，1個循環(huán)，94"C，30秒，55°C，30秒，72°C，30秒，35個循環(huán)，72°C,10分鐘，1個循環(huán)。對得到的DNA擴增產(chǎn)物，在80V，50分鐘的條件下，進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果見圖1。圖1中從左至右四個泳道分別為生殖器支原體、解脲支原體、人型支原體靶核酸序列的PCR產(chǎn)物以及DNA分子量標記(marker)。DNAmarker為寶生物(Takara)公司的DL2000，從上至下的條帶依次為2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp。將PCR產(chǎn)物切膠純化后(使用德國快而精(Qiagen)有限公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒，MinEluteGelExtractionKit)，將三個單一條帶回收后，分別與T質(zhì)粒(使用北京全式金生物技術(shù)有限公司的T質(zhì)粒試劑盒，pEASY-T3CloningKit)相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(使用北京全式金生物技術(shù)有限公司的TranS5αChemicallyCompetentCell)，篩選陽性克隆后提取質(zhì)粒(使用天根生化科技(北京)有限公司的高純度質(zhì)粒小提試劑盒，TIANpureMiniPlasmidKit)，并以紫外分光光度計進行檢測和定量。對三種質(zhì)粒的一部分擴增產(chǎn)物進行測序，證明所述擴增得到的DNA片段具有SEQIDNo:10_12所示的序列。對三種質(zhì)粒的剩余的部分逐級稀釋，每種分別依次得到ΙΟ6、ΙΟ5、104、、IO3拷貝/毫升的濃度梯度，得到陽性對照品。以上涉及的操作按照《分子克隆實驗指南》(第三版，科學出版社2002[美]J.薩姆布魯克D.W拉塞爾著，黃培堂等譯)中記載的方法完成。(3)多重熒光PCR檢測待測樣本DNA模板制備例1得到的尿液樣品總DNA溶液，3μ1或步驟(2)的陽性對照品，3μ1(濃度梯度溶液)表2所示的六種引物各0.25μmol/L；表2所示的三種探針各0.25μmol/L;美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(AppliedBiosystems)的TaqMan基因表達預(yù)混液(TaqManGeneExpressionMasterMix),20μ1以純化水補充至40μ1。37°C，2分鐘，94°C，3分鐘，1個循環(huán)，95°C，15秒，50°C，35秒，40個循環(huán)。采用的PCR儀為ABIPRISM7500PCR熒光檢測儀，選定檢測熒光為FAM、HEX、ROX通道，并在PCR循環(huán)50°C(第2-41個循環(huán)的第二步)時，開始實時收集熒光信號。檢測結(jié)果如圖2所示。將解脲支原體的四個濃度梯度的陽性對照品所得的熒光強度相對循環(huán)數(shù)的曲線疊加，得到圖6(圖中4條曲線是從FAM—個信號通道的信號，其他兩個信號通道下沒有信號)；將人型支原體的四個濃度梯度的陽性對照品所得的熒光強度相對循環(huán)數(shù)的曲線疊力口，得到圖7(圖中4條曲線是從HEX—個信號通道的信號，其他兩個信號通道下沒有信號)；將生殖器支原體的四個濃度梯度的陽性對照品所得的熒光強度相對循環(huán)數(shù)的曲線疊力口，得到圖8(圖中4條曲線是從ROX—個信號通道得到的信號，其他兩個信號通道下沒有信號)。從圖2可以看出，通過與陽性對照品所得的曲線進行比較，待測樣品中三個信號通道的熒光強度曲線均有跳動(圖2中3條曲線分別是三個信號通道的信號)，表明被檢測的標本中3種支原體均有存在。實施例2(1)采用固相亞磷酸三酯法合成表3所列舉的序列表3<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>(2)多重熒光PCR檢測待測樣本DNA模板制備例1得到的尿液樣品總DNA溶液，3μ1或?qū)嵤├?步驟(2)的陽性對照品，3μ1(濃度梯度溶液)表3所示的六種引物各0.25μmol/L；表3所示的三種探針各0.25μmol/L;美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(AppliedBiosystems)的TaqMan基因表達預(yù)混液(TaqManGeneExpressionMasterMix),20μ1以純化水補充至40μ1。37°C，2分鐘，94°C，3分鐘，1個循環(huán)，95°C，15秒，65°C，35秒，40個循環(huán)。采用的PCR儀為ABIPRISM7500PCR熒光檢測儀，選定檢測熒光為FAM、HEX、ROX通道，并在PCR循環(huán)65°C(第2-41個循環(huán)的第二步)時，開始實時收集熒光信號。檢測結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，待測樣品中三個信號通道的熒光強度曲線均有跳動，表明被檢測的標本中3種支原體均有存在。本實施例的引物/探針與實施例1不同，但在檢測與實施例1相同的待測樣品時，二者的檢測結(jié)果一致。實施例3(1)采用固相亞磷酸三酯法合成表4所列舉的序列表4<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>(2)多重熒光PCR檢測待測樣本DNA模板制備例1得到的前列腺液樣品總DNA溶液，3μ1或?qū)嵤├?步驟(2)的陽性對照品，3μ1(濃度梯度溶液)表4所示的六種引物各0.25ymol/L；表4所示的三種探針各0.25ymol/L；美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(AppliedBiosystems)的TaqMan基因表達預(yù)混液(TaqManGeneExpressionMasterMix),20μ1以純化水補充至40μ1。37°C，2分鐘，94°C，3分鐘，1個循環(huán)，95°C，15秒，55"C，35秒，40個循環(huán)。采用的PCR儀為ABIPRISM7500PCR熒光檢測儀，選定檢測熒光為FAM、HEX、ROX通道，并在PCR循環(huán)55°C(第2-41個循環(huán)的第二步)時，開始實時收集熒光信號。檢測結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，待測樣品中三個信號通道的熒光強度曲線均有跳動，表明被檢測的標本中3種支原體均有存在。本實施例的引物/探針與實施例1不同，待測樣品與實施例1的待測樣品也不相同；但是所述兩種不同的待測樣品來源于同一個體，并且最終二者的檢測結(jié)果一致。實施例4(1)采用固相亞磷酸三酯法合成表5所列舉的序列表5<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>(2)多重熒光PCR檢測待測樣本DNA模板制備例2得到的宮頸分泌物樣品總DNA溶液，3μ1或?qū)嵤├?步驟(2)的陽性對照品，3μ1(濃度梯度溶液)表5所示的六種引物各0.25μmol/L；表5所示的三種探針各0.25μmol/L;美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(AppliedBiosystems)的TaqMan基因表達預(yù)混液(TaqManGeneExpressionMasterMix),20μ1以純化水補充至40μ1。37°C，2分鐘，94°C，3分鐘，1個循環(huán)，95°C，15秒，60°C，35秒，40個循環(huán)。采用的PCR儀為ABIPRISM7500PCR熒光檢測儀，選定檢測熒光為FAM、HEX、ROX通道，并在PCR循環(huán)60°C(第2-41個循環(huán)的第二步)時，開始實時收集熒光信號。檢測結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，待測樣品中三個信號通道的熒光強度曲線均有跳動，表明被檢測的標本中3種支原體均有存在。本實施例證明，本發(fā)明的組合物和試劑盒既適用于男性患者，也適用于女性患者。實施例5分別取制備例3的IO5拷貝/毫升的三種模擬待測樣品按照下表6的拷貝數(shù)百分比進行混合，模擬從合并感染患者體內(nèi)可能獲得的各種樣品。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>待測樣品分別取3μ1表6所示的混合樣品1-6，按照實施例4的條件進行檢測所得的結(jié)果如下表7所示，證明了本發(fā)明的組合物和試劑盒能夠檢測到混合待測樣本中微量的支原體。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>實施例6對57例臨床檢測送檢標本，使用文獻“Yoshida，Τ.，S.Maeda，Τ.Deguchi，andH.Ishiko.2002.Phylogeny-basedrapididentificationofmycoplasmasandureaplasmasfromurethritispatients.J.Clin.Microbiol.40105-110"idiSc^Tj法(方法一)對三種支原體分別進行檢測；使用本發(fā)明實施例4所述方法(方法二)同時對三種支原體進行檢測。此處將文獻記載的方法一視為“金標準”。得到以下表8-10所示的結(jié)果。表8解脲支原體測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>靈敏度(真陽性率)=49/(49+0)=100%特異度(真陰性率)=7/(1+7)=87.5%陽性預(yù)測率=49/(49+1)=98%陰性預(yù)測率=7/(0+7)=100%準確度=(49+7)/(49+1+0+7)=98.2%表9人型支原體測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>靈敏度(真陽性率)=38/(38+2)=95%特異度(真陰性率)=17/(0+17)=100%陽性預(yù)測率=38/(38+0)=100%陰性預(yù)測率=17/(2+17)=89.5%準確度=(38+17)/(38+0+2+17)=96.5%表10生殖器支原體測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>靈敏度(真陽性率)=15/(15+0)=100%特異度(真陰性率)=42/(0+42)=100%陽性預(yù)測率=15/(15+0)=100%陰性預(yù)測率=42/(0+42)=100%準確度=(15+42)/(15+0+0+42)=100%以上表8-10的結(jié)果說明本發(fā)明的組合物和試劑盒在臨床上普遍適用，必其現(xiàn)有的方法，使用本發(fā)明的組合物和試劑盒的方法準確率高，并且省時省力。SEQUENCELISTING<110>北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司<120>用于同時檢測解脲支原體、人型支原體和生殖器支原體的組合物和試劑盒<130>0ICN0931124<160>15<170>PatentInversion3.4<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸引物序列<400>1atcagatagttggtgaggtaatggc25<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸引物序列<400>2atcgttcacgcggcattg18<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸引物序列<400>3cattaaatgatccgcctgagtagta25<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸引物序列<400>4ttgcgaaggatgtcaagagtgg22<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸引物序列<400>5aacaccagtggcgaaggc18<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸引物序列<400>6tctatcgtttacggtgtggactact25<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸探針序列<400>7tggctcaccaagtcaatgacgcgta25<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸探針序列<400>8atccgcctgagtagtatgctcgcaa25<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸探針序列<400>9aggccattactgacgcttaggcttg25<210>10<211>170<212>DNA<213>解脲支原體(Ureaplasmaurealyticum)<400>10atcagatagttggtgaggtaatggctcaccaagtcaatgacgcgtagctgtactgagagg60tagaacagccacaatgggactgagacacggcccatactcctacgggaggcagcagtaggg120aatttttcacaatgggcgcaagccttatgaagcaatgccgcgtgaacgat170<21D>11<211>135<212>DNA<213>人型支原體(Mycoplasmahominis)<220><221>misc_feature<222>(61)..(62)<223>nisa,c,g,ort<220><221>misc_feature<222>(72)..(72)<223>nisa,c,g,ort<400>11cattaaatgatccgcctgagtagtatgctcgcaagagtgaaacttaaaggaattgacggg60nnacgcacaagnggagcatgtggtttaatttgaagatacacggaaaaccttacccactct120tgacatccttcgcaa135<210>12<211>109<212>DNA<213>生殖器支原體(Mycoplasmagenitalium)<400>12aacaccagtggcgaaggcgaaaacttaggccattactgacgcttaggcttgaaagtgtgg60ggagcaaataggattagataccctagtagtccacaccgtaaacgataga109<210>13<211>1585<212>DNA<213>解脲支原體(Ureaplasmaurealyticum)<400>13tagaatccgtcaatttttaaagagtttgatcctggctcaggattaacgctggcggcatgc60ctaatacatgcaaatcgaacgaagccttttaggcttagtggtgaacgggtgagtaacacg120tatccaatctacccttaagttggggataactagtcgaaagattagctaataccgaataat180aacatcaatatcgcatgagaagatgtagaaagtcgctctttgtggcgacgcttttggatg240agggtgcgacgtatcagatagttggtgaggtaatggctcaccaagtcaatgacgcgtagc300tgtactgagaggtagaacagccacaatgggactgagacacggcccatactcctacgggag360gcagcagtagggaatttttcacaatgggcgcaagccttatgaagcaatgccgcgtgaacg420atgaaggtcttatagattgtaaagttcttttatatgggaagaaacgctaagataggaaat480gattttagtttgactgtaccatttgaataagtatcggctaactatgtgccagcagccgcg540gtaatacataggatgcaagcgttatccggatttactgggcgtaaaacgagcgcaggcggg600ccggaattattgggcgtaaagcgttcgtaggctgtttgttaagtctggagttaaatcccg600gggctcaaccccgctcgctttggatactagcaaactagagttagatagaggtaagcggaa660ttccatgtgaagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccaaaggcgaaggcagct720tactgggtctatactgacgctgggacgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccct780ggtagtccacgccgtaaacgatgatcattagtcggtggagaatcactgacgcagctaacg840cattaaatgatccgcctgagtagtatgctcgcaagagtgaaacttaaaggaattgacggg900nnacgcacaagnggagcatgtggtttaatttgaagatacacggaaaaccttacccactct960tgacatccttcgcaaagctatagagatatagtggaggttatcggagtgacagatggtgca1020tggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgtttggtcaagtcctgcaacgagcgcaacccc1080tatctttagttactaacattaagttgaggactctagagatactgcctgggtaactgggag1140gaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgcctcttacgagtggggccacacacgtgctac1200aatggtcggtacaaagagaagcaatatggcgacactgagcaaatctcaaaaagccgatct1260cagttcggattggagtctgcaattcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcaga1320tcagctatgctgcggtgaatacgttctcgggtcttgtacacaccgcccgtcacaccatgg1380gagctggtaatacccaaagtcggtttgctaacctcggaggcgaccgcctaaggtaggact1440ggtgactggg1450<210>15<211>1490<212>DNA〈213〉生殖器支原體(Mycoplasmagenitalium)<400>15agagtttgatcctggctcaggattaacgctggcggcatgcctaatacatgcaagtcgatc60ggaagtagcaatactttagaggcgaacgggtgagtaacacgtatccaatctaccttataa120tgggggataactagttgaaaaactagctaataccgcataagaactttagttcgcatgaat180taaagttgaaaggacctgcaagggttcgttatttgatgagggtgcgccatatcagctagt240tggtagggtaatggcctaccaaggcaatgacgtgtagctatgctgagaagtagaatagcc300acaatgggactgagacacggcccatactcctacgggaggcagcagtagggaatttttcac360aatgagcgaaagcttgatggagcaatgccgcgtgaacgatgaaggtctttttgattgtaa420agttcttttatttgggaagaatgactctagcaggcaatggctggagtttgactgtaccac480tttgaataagtgacgactaactatgtgccagcagtcgcggtaatacataggtcgcaagcg540ttatccggatttattgggcgtaaagcaagcgcaggcggattgaaaagtctggtgttaaag600gcagctgcttaacagttgtatgcattggaaactatcagtctagagtgtggtagggagttt660tggaatttcatgtggagcggtgaaatgcgtagatatatgaaggaacaccagtggcgaagg720cgaaaacttaggccattactgacgcttaggcttgaaagtgtggggagcaaataggattag780ataccctagtagtccacaccgtaaacgatagatactagctgtcggagcgatcccttcggt840agtgaagttaacacattaagtatctcgcctgggtagtacattcgcaagaatgaaactcaa900acggaattgacggggacccgcacaagtggtggagcatgttgcttaattcgacggtacacg960aaaaaccttacctagacttgacatccttggcaaagttatggaaacataatggaggttaac1020cgagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcc108033cgcaacgagcgcaacccttatcgttagttacattgtttaacgagactgctaatgtaaatt1140ggaggaaggaagggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgtctagggctgcaaacgtg1200ctacaatggccaatacaaacagtagccaacttgtaaaagtgagcaaatctgaaaagttgg1260tctcagttcggattgagggctgcaattcgtcctcatgaagctggaatcactagtaatcgc1320gaatcagctatgtcgcggtgaatacgttctcgggtcttgtacacaccgcccgtcaaacta1380tgaaagctggtaatatttaaaaacgtgttgctaacctttattggaagcgcatgtcaagga1440tagcaccggtgattggagttaagtcgtaacaaggtacccctacgagaacg1490權(quán)利要求用于同時檢測解脲支原體、人型支原體和生殖器支原體的組合物，其特征在于，所述組合物包括以下序列1)長度為15-30個核苷酸的用于PCR擴增解脲支原體靶核酸序列的第一引物，該引物的GC含量為20-80％，該引物的序列包括a)SEQIDNo1所示的序列，b)SEQIDNo1所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有至多5個核苷酸差異的序列；2)長度為15-30個核苷酸的用于PCR擴增解脲支原體靶核酸序列的第二引物，該引物的GC含量為20-80％，該引物的序列包括a)SEQIDNo2所示的序列，b)SEQIDNo2所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有至多5個核苷酸差異的序列；3)長度為15-30個核苷酸的用于PCR擴增人型支原體靶核酸序列的第一引物，該引物的GC含量為20-80％，該引物的序列包括a)SEQIDNo3所示的序列，b)SEQIDNo3所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有至多5個核苷酸差異的序列；4)長度為15-30個核苷酸的用于PCR擴增人型支原體靶核酸序列的第二引物，該引物的GC含量為20-80％，該引物的序列包括a)SEQIDNo4所示的序列，b)SEQIDNo4所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有至多5個核苷酸差異的序列；5)長度為15-30個核苷酸的用于PCR擴增生殖器支原體靶核酸序列的第一引物，該引物的GC含量為20-80％，該引物的序列包括a)SEQIDNo5所示的序列，b)SEQIDNo5所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有至多5個核苷酸差異的序列；6)長度為15-30個核苷酸的用于PCR擴增生殖器支原體靶核酸序列的第二引物，該引物的GC含量為20-80％，該引物的序列包括a)SEQIDNo6所示的序列，b)SEQIDNo6所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有至多5個核苷酸差異的序列；7)長度為15-45個核苷酸的與1)和2)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的GC含量為20-80％，該探針的序列包括a)SEQIDNo7所示的序列或其互補序列，b)SEQIDNo7所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，c)SEQIDNo7所示序列的互補序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者d)與a)或b)或c)具有至多5個核苷酸差異的序列；8)長度為15-45個核苷酸的與3)和4)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的GC含量為20-80％，該探針的序列包括a)SEQIDNo8所示的序列或其互補序列，b)SEQIDNo8所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，c)SEQIDNo8所示序列的互補序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者d)與a)或b)或c)具有至多5個核苷酸差異的序列；9)長度為15-45個核苷酸的與5)和6)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的GC含量為20-80％，該探針的序列包括a)SEQIDNo9所示的序列或其互補序列，b)SEQIDNo9所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，c)SEQIDNo9所示序列的互補序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者d)與a)或b)或c)具有至多5個核苷酸差異的序列；其中，7)-9)所述的探針在5’端帶有互不相同的熒光報告基團，并且在除5′端外的任意一個位置上帶有淬滅基團。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物包括以下序列1)長度為25-30個核苷酸的用于PCR擴增解脲支原體靶核酸序列的第一引物，該引物的GC含量為25-75%，該引物的序列包括a)SEQIDNo1所示的序列，b)SEQIDNo1所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有至多3個核苷酸差異的序列；2)長度為18-30個核苷酸的用于PCR擴增解脲支原體靶核酸序列的第二引物，該引物的GC含量為25-75%，該引物的序列包括a)SEQIDNo2所示的序列，b)SEQIDNo:2所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有至多3個核苷酸差異的序列；3)長度為25-30個核苷酸的用于PCR擴增人型支原體靶核酸序列的第一引物，該引物的GC含量為25-75%，該引物的序列包括a)SEQIDNo3所示的序列，b)SEQIDNo:3所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有至多3個核苷酸差異的序列；4)長度為22-30個核苷酸的用于PCR擴增人型支原體靶核酸序列的第二引物，該引物的GC含量為25-75%，該引物的序列包括a)SEQIDNo:4所示的序列，b)SEQIDNo:4所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有至多3個核苷酸差異的序列；5)長度為25-30個核苷酸的用于PCR擴增生殖器支原體靶核酸序列的第一引物，該引物的GC含量為25-75%，該引物的序列包括a)SEQIDNo5所示的序列，b)SEQIDNo:5所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有至多3個核苷酸差異的序列；6)長度為18-30個核苷酸的用于PCR擴增生殖器支原體靶核酸序列的第二引物，該引物的GC含量為25-75%，該引物的序列包括a)SEQIDNo:6所示的序列，b)SEQIDNo:6所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有至多3個核苷酸差異的序列；7)長度為25-45個核苷酸的與1)和2)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的GC含量為25-75%，該探針的序列包括a)SEQIDNo:7所示的序列或其互補序列，b)SEQIDNo:7所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，c)SEQIDNo:7所示序列的互補序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者d)與a)或b)或c)具有至多3個核苷酸差異的序列；8)長度為25-45個核苷酸的與3)和4)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的GC含量為25-75%，該探針的序列包括a)SEQIDNo:8所示的序列或其互補序列，b)SEQIDNo:8所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，c)SEQIDNo:8所示序列的互補序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者d)與a)或b)或c)具有至多3個核苷酸差異的序列；9)長度為25-45個核苷酸的與5)和6)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的GC含量為25-75%，該探針的序列包括a)SEQIDNo:9所示的序列或其互補序列，b)SEQIDNo:9所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，c)SEQIDNo:9所示序列的互補序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者d)與a)或b)或c)具有至多3個核苷酸差異的序列；其中，7)-9)所述的探針在5’端帶有互不相同的熒光報告基團，并且除5'端外的任意一個位置上帶有淬滅基團。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物包括以下序列1)長度為25-30個核苷酸的用于PCR擴增解脲支原體靶核酸序列的第一引物，該引物的GC含量為30-70%，該引物的序列包括a)SEQIDNo1所示的序列，b)SEQIDNo1所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有一個或兩個核苷酸差異的序列；2)長度為18-30個核苷酸的用于PCR擴增解脲支原體靶核酸序列的第二引物，該引物的GC含量為30-70%，該引物的序列包括a)SEQIDNo2所示的序列，b)SEQIDNo:2所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有一個或兩個核苷酸差異的序列；3)長度為25-30個核苷酸的用于PCR擴增人型支原體靶核酸序列的第一引物，該引物的GC含量為30-70%，該引物的序列包括a)SEQIDNo3所示的序列，b)SEQIDNo:3所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有一個或兩個核苷酸差異的序列；4)長度為22-30個核苷酸的用于PCR擴增人型支原體靶核酸序列的第二引物，該引物的GC含量為30-70%，該引物的序列包括a)SEQIDNo:4所示的序列，b)SEQIDNo:4所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有一個或兩個核苷酸差異的序列；5)長度為25-30個核苷酸的用于PCR擴增生殖器支原體靶核酸序列的第一引物，該引物的GC含量為30-70%，該引物的序列包括a)SEQIDNo5所示的序列，b)SEQIDNo:5所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有一個或兩個核苷酸差異的序列；6)長度為18-30個核苷酸的用于PCR擴增生殖器支原體靶核酸序列的第二引物，該引物的GC含量為30-70%，該引物的序列包括a)SEQIDNo:6所示的序列，b)SEQIDNo:6所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有一個或兩個核苷酸差異的序列；7)長度為25-45個核苷酸的與1)和2)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的GC含量為30-70%，該探針的序列包括a)SEQIDNo:7所示的序列或其互補序列，b)SEQIDNo:7所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，c)SEQIDNo:7所示序列的互補序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者d)與a)或b)或c)具有一個或兩個核苷酸差異的序列；8)長度為25-45個核苷酸的與3)和4)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的GC含量為30-70%，該探針的序列包括a)SEQIDNo:8所示的序列或其互補序列，b)SEQIDNo:8所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，c)SEQIDNo:8所示序列的互補序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者d)與a)或b)或c)具有一個或兩個核苷酸差異的序列；9)長度為25-45個核苷酸的與5)和6)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的GC含量為30-70%，該探針的序列包括a)SEQIDNo:9所示的序列或其互補序列，或者b)SEQIDNo:9所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，c)SEQIDNo:9所示序列的互補序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者d)與a)或b)或c)具有一個或兩個核苷酸差異的序列；其中，7)-9)所述的探針在5’端帶有互不相同的熒光報告基團，并且除5'端外的任意一個的位置上帶有淬滅基團。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述組合物由以下序列組成1)用于PCR擴增解脲支原體靶核酸序列的第一引物，該引物的序列為如SEQIDNo=I所示的序列；2)用于PCR擴增解脲支原體靶核酸序列的第二引物，該引物的序列為如SEQIDNo2所示的序列；3)用于PCR擴增人型支原體靶核酸序列的第一引物，該引物的序列為如SEQIDNo3所示的序列；4)用于PCR擴增人型支原體靶核酸序列的第二引物，該引物的序列為如SEQIDNo4所示的序列；5)用于PCR擴增生殖器支原體靶核酸序列的第一引物，該引物的序列為如SEQIDNo5所示的序列；6)用于PCR擴增生殖器支原體靶核酸序列的第二引物，該引物的序列為如SEQIDNo6所示的序列；7)與1)和2)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的序列為如SEQIDNo7所示的序列或其互補序列；8)與3)和4)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的序列為如SEQIDNo8所示的序列或其互補序列；9)與5)和6)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的序列為如SEQIDNo9所示的序列或其互補序列；其中，7)-9)所述的探針在5’端帶有互不相同的熒光報告基團，并且在3’端帶有淬滅基團。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項所述的組合物，其中，所述熒光報告基團的發(fā)射波長小于所述淬滅基團的吸收波長；并且所述熒光報告基團和所述淬滅基團選自由6-羧基熒光素、四氯-6-羧基熒光素、六氯-6-甲基熒光素、6-羧基四甲基羅丹明、磺酰羅丹明、羧基-X-羅丹明、花菁3、花菁3.5、花菁5、花菁5.5、BHQl、BHQ2、BHQ3、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、6-羧基-4’，5’-二氯_2’，7’-二甲氧基熒光素琥珀酰亞胺酯和VIC熒光染料所組成的組中。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中，所述熒光報告基團選自由6-羧基熒光素、六氯-6-甲基熒光素、VIC熒光染料、四氯-6-羧基熒光素、羧基-X-羅丹明、6-羧基四甲基羅丹明、磺酰羅丹明、6-羧基_4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基熒光素琥珀酰亞胺酯、花菁3、花菁5和花菁5.5所組成的組中；所述淬滅基團選自由6-羧基四甲基羅丹明、4-(4_二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、BHQ1、BHQ2和BHQ3所組成的組中。7.用于同時檢測解脲支原體、人型支原體和生殖器支原體的試劑盒，該試劑盒含有聚合酶鏈式反應(yīng)液、耐熱DNA聚合酶及陰性對照品，其特征在于，所述試劑盒還含有權(quán)利要求1-6中任意一項所述的組合物。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其中，所述試劑盒還包括陽性對照品，所述陽性對照品為IO3-IO8拷貝/毫升的解脲支原體質(zhì)粒DNA溶液、IO3-IO8拷貝/毫升的人型支原體質(zhì)粒DNA溶液和IO3-IO8拷貝/毫升的生殖器支原體質(zhì)粒DNA溶液，其中，所述支原體質(zhì)粒DNA由支原體DNA片段和質(zhì)粒載體組成，所述解脲支原體DNA片段為如SEQIDNo:10所示的解脲支原體核糖體16SrRNA基因擴增產(chǎn)物，所述人型支原體DNA片段為如SEQIDNo:ll所示的人型支原體核糖體16SrRNA基因擴增產(chǎn)物，所述生殖器支原體DNA片段為如SEQIDNo12所示的生殖器支原體核糖體16SrRNA基因擴增產(chǎn)物；所述陰性對照品為水。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其中，所述陰性對照品選自由蒸餾水、去離子水、注射用水、重蒸水和超純水所組成的組中。10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其中，所述試劑盒檢測的樣品選自由尿液、精液、前列腺液、尿道分泌物、宮頸分泌物和白帶所組成的組中。全文摘要本發(fā)明公開了用于同時檢測解脲支原體、人型支原體和生殖器支原體的組合物和試劑盒，它們均包括有關(guān)SEQIDNo1-6所示序列或其至少15個核苷酸連續(xù)的片段、或與它們存在具有至多5個核苷酸差異的序列的特異性引物；以及SEQIDNo7-9所示的序列或其互補序列或它們的至少15個核苷酸連續(xù)的片段、或與它們存在具有至多5個核苷酸差異的序列的特異性探針。本發(fā)明的用于同時檢測解脲支原體、人型支原體和生殖器支原體的組合物和試劑盒可以在一個反應(yīng)體系內(nèi)同時檢測三種不同的支原體，不僅提高了泌尿生殖系統(tǒng)感染性疾病的早期檢出率，而且減少了操作人員的操作時間，降低了檢測成本，還減輕了病人經(jīng)濟負擔。文檔編號C12Q1/68GK101824471SQ200910253189公開日2010年9月8日申請日期2009年12月14日優(yōu)先權(quán)日2009年12月14日發(fā)明者葉鋒,趙洪斌申請人:北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司