專利名稱：新的內(nèi)切葡聚糖酶的制作方法
新的內(nèi)切葡聚糖酶本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為1996年3月18日、申請(qǐng)?zhí)枮?6193494. 8、發(fā)明名稱為“新的內(nèi) 切葡聚糖酶”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及新的酶制劑，該酶制劑包含顯示內(nèi)切葡聚糖酶活性的酶，其在工業(yè)應(yīng) 用(如洗衣組合物、生物拋光(biopolishing)新制造的織物、提供纖維素織物或衣物磨損 的外觀和處理紙漿)中性能良好。此外，本發(fā)明涉及編碼這種酶的DNA構(gòu)建體、提供編碼這 種酶的基因的方法、產(chǎn)生所述酶的方法、包含這種酶的酶制劑以及這些酶在許多工業(yè)應(yīng)用 中的用途。
背景技術(shù)：
纖維素酶或溶纖酶是涉及纖維素水解的酶。在天然纖維素的水解中，已知涉 及三種主要類型的纖維素酶，即纖維二糖水解酶(1，4-β-D-葡聚糖纖維二糖水解酶EC 3.2. 1.91)、內(nèi)切-β-l，4-葡聚糖酶(內(nèi)切l(wèi)，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶EC 3.2. 1.4) 和β -葡萄糖苷酶(EC 3. 2. 1.2 1)。纖維素酶由大量微生物(包括真菌，放線菌，粘細(xì)菌和真細(xì)菌)合成，也由植物合 成。已鑒別了各種特異性的特定的內(nèi)切葡聚糖酶。溶纖酶的一種十分重要的工業(yè)用途是用來(lái)處理纖維素織物原料或織物，例如作為 洗滌劑組合物或織物軟化劑組合物中的組分、用于生物-拋光新織物(衣物修飾)和用于 獲得含纖維素織物(尤其斜紋粗棉布)的"石洗(stone-washing)"外觀。在例如下列文 獻(xiàn)中提出了幾種這樣的處理方法GB-A-I 368 599，EP-A-O 307 564和EP-A-O 435 876， WO 91/172431W0 91/10732, WO 91/17244，PCT/DK95/000108 和 PCT/DK95/00132。溶纖酶的另一個(gè)重要的工業(yè)用途是用于紙漿處理，例如為了改善導(dǎo)液(drainage) 或使再利用紙脫墨。尤其是，對(duì)所論及的工業(yè)用途而言，內(nèi)切葡聚糖酶(EC 3. 2. 1. 4)構(gòu)成了有意義的 一組水解酶。內(nèi)切葡聚糖酶催化下列鍵的內(nèi)切水解纖維素、纖維素衍生物(如羧基甲基纖 維素和羥乙基纖維素)、地衣淀粉中的1，4-β-D-配糖鍵；混合的β_1，3葡聚糖(如谷類 β-D-葡聚糖或木糖葡聚糖)和其它含纖維素部分的植物材料中的β_1，4鍵。公認(rèn)的名 稱是內(nèi)切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖基(glucano)水解酶，本發(fā)明中使用縮寫(xiě)術(shù)語(yǔ)內(nèi)切 葡聚糖酶(endoglucanase)?？梢詤⒁?jiàn)T. _M. Enveri，"微生物纖維素酶"W. M. Fogarty, 微生物酶和生物技術(shù)，應(yīng)用科學(xué)出版社，P. 183-224(1983)；酶學(xué)方法，(1988)Vol. 160， p. 200-391 (Wood，W. Α.和 Kellogg, S. Τ.編)；Beguin,P.，“纖維素降解的分子生物學(xué)，微 生物學(xué)年評(píng)(1990)，Vol. 44，pp. 219-248 ；Beguin, P.和 Aubert, J-P.，“纖維素的生物降 解〃，F(xiàn)EMS微生物學(xué)回顧13(1994)p. 25-58 ；Henrissat, B.，“纖維素酶和它們與纖維素 的相互作用〃，纖維素(1994)，Vol. 1，ρρ· 169-196。許多出版物中已描述了真菌內(nèi)切葡聚糖酶，特別是來(lái)源于例如尖鐮孢、 Trichoderma reesei, Trichoderma longibrachiatum, $$ 包 曲 _， Neocallimastix patriciarum和例如Piromyces、腐質(zhì)霉屬，毀絲霉屬，Geotricum，青霉屬，耙菌屬，鬼傘屬 的種的那些內(nèi)切葡聚糖酶。
4
例如，真菌內(nèi)切葡聚糖酶已由下列文獻(xiàn)描述SheppardP. 0.，等，用保守纖維 素酶家族-特異性的序列從尖鐮孢克隆纖維素酶同系物cDNA，基因，(1994)，vol. 15, pp. 163-167 ；Saloheimo, Α.，等，“在酵母中表達(dá)的Trichoderma reesei的新小內(nèi)切葡聚 糖酶基因 egI5〃，分子微生物學(xué)，(1994) vol. 13 (2), pp. 219-228 ；van Arsdel 1, J. N.等， (1987)，Trichoderma reesei在啤酒糖酵母內(nèi)切葡聚糖酶I的克隆，特征確定和表達(dá)，生 物 / 技術(shù) 5 :60-64 ； Pentti la，M.等，(1986)，“ Trichoderma reesei 纖維素酶基因之 間的同源性內(nèi)切葡聚糖酶I基因的完整的核苷酸序列"，基因45 :253 263 ；Saloheimo, Μ.等，(1988)，‘‘ EGIII，一種新的"Trichoderma reesei內(nèi)切葡聚糖酶基因和酶兩者的鑒 定〃，基因 63 :1121 ;Gonzales,R.等·，〃 Trichoderma longibrachiatum egll 基因的克 隆、序列分析和酵母表達(dá)"，應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)，(1992)，vol. 38，pp. 370-375 ；0oi, Τ.等棘孢曲霉纖維素酶(FI-CMCase) cDNA的克隆和序列分析〃，Curr. Genet.，(1990)， vol. 18，pp.217222 ；0oi, Τ.等，編碼棘孢曲霉纖維素酶(FI-CMCase)的基因的完整的核 苷酸序列"，核酸研究，(1990)，vol. 18，No. 19，P. 5884 ；Xue, G.等，“多種厭氧瘤胃真 菌Neocallimastix patriciarum纖維素酶cDNA在大腸桿菌中的克隆和表達(dá)〃，J. Gen. Microbiol.，(1992)，vol. 138，pp. 1413-1420 ；Xue G.等，“編碼具有高內(nèi)切葡聚糖酶、 纖維二糖水解酶和木聚糖酶活性的三個(gè)多功能催化區(qū)的Neocallimastix patriciarum的 新的多糖類水解酶 cDNA(celD) “，J. Gen. Microbiol.，(1992)，vol. 138，pp. 2397-2403 ； Zhou, L.等，“來(lái)源于厭氧真菌Neocallimastix patriciarum的編碼模式家族內(nèi)切葡 聚糖酶的無(wú)內(nèi)含子celB"，生物化學(xué)雜志，(1994)，vol. 297, pp. 359364 ；Dalb Φ ge, H.和 Heldt-Hansen, H. P.，“有效表達(dá)克隆真菌酶基因的新方法"，Mol. Gen. Genet.，(1994)， vol. 243，pp. 253260 ；Ali, B. R. S.等，“厭氧真菌Piromyces纖維素酶和半纖維素酶構(gòu)成 多蛋白纖維素-結(jié)合復(fù)合物和由多基因族編碼"，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通訊，(1995)，vol. 125， Νο,Ι, pp. 15' -21。此外，日本DNA數(shù)據(jù)庫(kù)(公眾可從hternet上獲得的DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)) 包括從微紫青霉克隆的編碼內(nèi)切葡聚糖酶的兩個(gè)DNA序列(分別由A. Koch和G. Mernitz 克隆)和從灰腐質(zhì)霉變種thermoidea克隆的編碼內(nèi)切葡聚糖酶DNA序列(由T. Uozumi 克隆)。兩種Macrophomina phaseolina的內(nèi)切葡聚糖酶已被克隆和測(cè)序，參見(jiàn)Wang， H. Y.和Jones，R. W.“植物致病真菌Macrophomina phaseolina的內(nèi)切葡聚糖酶-編碼 基因的克隆，特征確定和功能性表達(dá)"，基因，158 :125128，1995 ；和Wang，H. Y.和Jones， R. W.“從植物致病真菌Macrophomina phaseolina克隆的單一內(nèi)切葡聚糖酶-編碼基 因〃，應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)，61 :2004-2006，1995。這些內(nèi)切葡聚糖酶中的一個(gè)顯示與真 菌Trichoderma reesei egl3內(nèi)切葡聚糖酶的高同源性，另一個(gè)顯示與微生物植物病原體 Pseudomonas solanacearum egll的同源性，說(shuō)明兩種內(nèi)切葡聚糖酶都屬于糖基水解酶5族 (B. Henrissat，生物化學(xué) J 280:309-316(1991))。Schauwecker F.等(1995)公開(kāi)了二態(tài) 真菌玉米黑粉菌的纖維素酶基因的絲-特異性(filament-specific)表達(dá)。WO 91/17243 (Nordisk A/S)公開(kāi)了 一種纖維素酶制劑，該制劑由與抗高度純 化的43kDa內(nèi)切葡聚糖酶(得自Humicola insolens DSM1800)的抗體免疫反應(yīng)性的 同源內(nèi)切葡聚糖酶組成。WO 91/17244 (Nordisk A/S)公開(kāi)了一種新的(半)纖維素 降解酶，如內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶或β -葡糖苷酶，其可以來(lái)源于非木霉屬和 展齒革菌屬的真菌；WO 93/20193 21公開(kāi)了可以從棘孢曲霉獲得的內(nèi)切葡聚糖酶；WO94/21801 (Genencor公司)涉及一種纖維素酶系統(tǒng)，該系統(tǒng)是從顯示內(nèi)切葡聚糖酶活性的 Trichodermalongibrachiatum 分離至Ij的；WO 94/26880 (Gist Brocades N. V.)公開(kāi)了一種 分離的纖維素降解酶混合物(優(yōu)選地是從木霉屬、Rspergillus或Disporotrichum獲得 的)，其具有內(nèi)切葡聚糖酶，纖維二糖水解酶和木糖葡聚糖酶活性；WO 95/02043 (Nordisk A/S)描述了一種具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的來(lái)源于Trichoderma harzianum的酶，該酶可以 用于許多目的，包括例如植物細(xì)胞壁的降解或修飾。已知纖維素酶可以也可以不具有纖維素結(jié)合域(CBD)。CBD增加酶對(duì)包含纖維素 纖維的結(jié)合，并增加酶的催化活性部分的功效。仍然需要提供可以用于需要纖維素酶尤其是內(nèi)切葡聚糖酶活性的場(chǎng)合的新的纖 維素酶制劑。本發(fā)明的目的是提供新的酶制劑，該酶制劑實(shí)質(zhì)上在酸性、中性或堿性條件下具 有溶纖活性，并在紙漿處理，織物處理和洗衣過(guò)程中或者在動(dòng)物飼養(yǎng)中具有改進(jìn)的功效，優(yōu) 選地是新的纖維素酶，更優(yōu)選地是性能良好的內(nèi)切葡聚糖酶的酶制劑，所述酶被嘗試由重 組技術(shù)生產(chǎn)或產(chǎn)生。發(fā)明概述令人驚奇地是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一組內(nèi)切葡聚糖酶具有某些獨(dú)特的特征，在通常使用內(nèi) 切葡聚糖酶的那些工業(yè)應(yīng)用中性能良好。這些獨(dú)特的特征可以以酶蛋白質(zhì)氨基酸序列的保 守區(qū)進(jìn)行描述，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，具有某些保守區(qū)的溶纖酶(即顯示溶纖活性的酶)在處理要洗 的衣物、處理新制造的織物和處理造紙紙漿中十分有效。因此，本發(fā)明第一方面涉及一種酶制劑，該制劑實(shí)質(zhì)上由具有溶纖活性的酶組成， 所述酶包含具有以下序列的由14個(gè)氨基酸殘基組成的第一氨基酸序列Thr Arg Xaa Xaa Asp Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp Xaa1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14和具有以下序列的由5個(gè)氨基酸殘基組成的第二氨基酸序列Trp Cys Cys Xaa Cys12 3 4 5其中，在第一序列的3號(hào)位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe ；在第一序列的4號(hào)位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe ；在第一序列的8號(hào)位置上，氨基酸是Arg、Lys或His ；在第一序列9、10、12和14號(hào)的各位置上，在第二序列的4號(hào)位置上，氨基酸是20 個(gè)天然氨基酸殘基中的任何一個(gè)，其條件是在第一氨基酸序列中，(i)當(dāng)12號(hào)位置上的氨 基酸殘基是Ser時(shí)，14號(hào)位置上的氨基酸殘基不是義！·，和(ii)當(dāng)12號(hào)位置上的氨基酸殘 基是Gly時(shí)，14號(hào)位置上的氨基酸殘基不是Ala。盡管在性能良好的內(nèi)切葡聚糖酶內(nèi)發(fā)現(xiàn)其它相當(dāng)顯著的變異，但可清楚識(shí)別保守 區(qū)的這一驚人的發(fā)現(xiàn)是大量真菌DNA序列研究的結(jié)果，所述DNA序列編碼具有有效的溶纖 (尤其是內(nèi)切葡聚糖酶)活性之酶的特定氨基酸序列?；谶@一發(fā)現(xiàn)，開(kāi)發(fā)了一種用于特異性篩選以編碼本發(fā)明的酶為特征的基因組 DNA或cDNA的分子方法。構(gòu)建了作為其工具的三套簡(jiǎn)并引物。因此，本發(fā)明在其第二方面
6涉及提供編碼具有上述保守區(qū)之溶纖酶基因的方法。通過(guò)使用這種方法(即供基因組DNA PCR篩選的引物套)，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)編碼所 述酶的DNA可以從寬范圍的真菌中發(fā)現(xiàn)，所述真菌屬于分類學(xué)上很不相同的生物體，并且 棲息于生態(tài)學(xué)上十分不同的小生境中。進(jìn)一步地，通過(guò)使用這一方法，發(fā)現(xiàn)編碼所述酶核心區(qū)(催化活性區(qū)或域)而無(wú)任 何連接的纖維素結(jié)合域(CBD)之DNA序列已經(jīng)可能，所述酶的核心區(qū)將不通過(guò)采用基于篩 選方法的常規(guī)手段來(lái)選擇。發(fā)明人經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)CBD區(qū)與本發(fā)明的酶核心區(qū)(包括所述酶的 催化活性區(qū)或域)的連接導(dǎo)致多域酶的功效明顯改善，例如，高出50倍的功效。因此，本發(fā)明提供了新的纖維素酶，尤其內(nèi)切葡聚糖酶，以其天然形式或者同源或 異源形式產(chǎn)生的這些酶在工業(yè)應(yīng)用中具有改善的功效。另一方面，本發(fā)明涉及新的溶纖酶制劑，該制劑是可以從分類學(xué)上的特定門(mén) (phyli)、綱、目、科、屬和種產(chǎn)生的，例如可以從擔(dān)子菌門(mén)的(Basidiomycotous)層菌綱 (Hymenomycetes)、接合菌門(mén)(Zygomycota)、壺菌門(mén)(Chytridiomycota)；或從綱盤(pán)菌綱 (Discomycetes)、 腔菌綱(腔菌綱)、不整囊菌綱(Plectomycetes) ；Archaeascomycetes, 半子囊菌綱(Hemiascomycetes)或者從間座殼目、炭角菌目(Xylariales)、假毛球殼 目(Irichosphaeriales)、黑疲菌目(Phyllachorales)或從禾斗叢赤殼禾斗(Nectriaeae)、 1 ^ (Sordariaceae) > ^ ^ (Chaetomiaceae, )、Ceratostomaceae> ^ ^ (Lasiosphaeriaceae)；或從屬柱抱屬(Cylindrocarpon)、粘帚霉屬(Gliocladium)、 周刺座霉屬(Volutella)、Scytalidium、頂孢霉屬(Acremonium)、或從種番茄鐮孢 (Fusariumlycopersici)、Fusarium passiflora、腐皮鍵抱(Fusarium solani)、蛇 形鐮孢(Fusarium anguioides)、早熟禾鐮孢(Fusarium poae)、黑腐質(zhì)霉(Humicola nigrescens)、灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)產(chǎn)生的，尤其是實(shí)質(zhì)上由包含選自以下序列的 氨基酸序列的酶組成的那些Xaa Thr Arg Xaa Phe Asp Xaa1 2 3 4 5 6 7；Xaa Thr Arg Xaa Tyr Asp Xaa1 2 3 4 5 6 7 ；和Xaa Thr Arg Xaa Trp Asp Xaa1 2 3 4 5 6 7其中，在4號(hào)位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe ；和在1和7號(hào)位置上，Xaa是20個(gè)天然氨基酸殘基中的任何一個(gè)。更具體地說(shuō)，本發(fā)明的酶制劑優(yōu)選地是可以從以上提到的分類學(xué)上的特定門(mén) (phyli)、綱、目、科、屬和種產(chǎn)生的，所述的所有微生物都產(chǎn)生內(nèi)切葡聚糖酶，該酶包含具有 以下序列的由13個(gè)氨基酸殘基組成的第一肽Thr Arg Xaa Xaa Asp Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13和具有以下序列的由5個(gè)氨基酸殘基組成的第二肽Trp Cys Cys Xaa Cys12 3 4 5
其中，在第一序列的3號(hào)位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe ；在第一序列的4號(hào)位 置上，氨基酸是Trp、Tyr或Wie ；在第一序列的8號(hào)位置上，氨基酸是Arg、Lys或His ；在第 一序列9、10和12號(hào)的各位置上，在第二序列的4號(hào)位置上，氨基酸是20個(gè)天然氨基酸殘 基中的任何一個(gè)。本發(fā)明另一方面提供了包含編碼顯示內(nèi)切葡聚糖酶活性的酶的DNA序列之DNA構(gòu) 建體，所述DNA序列包含分別在SEQ ID NO :1、4、5、10、12、16和19中所示的DNA序列或者 它們的類似物。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明DNA構(gòu)建體的重組表達(dá)載體；涉及包含本發(fā)明DNA構(gòu)建 體或重組表達(dá)載體的細(xì)胞；涉及產(chǎn)生本發(fā)明酶(例如，重組體酶)的方法；涉及通過(guò)使用本 發(fā)明的酶使要洗的衣物顏色澄清的方法；涉及包含本發(fā)明的酶的洗衣組合物；涉及本發(fā)明 的酶在降解或改性植物材料(例如細(xì)胞壁)，處理織物原料、織物或衣物，處理紙漿中的用 途；并涉及富含本發(fā)明的酶的酶制劑。附圖簡(jiǎn)要描述

圖1是下列微生物的推定編碼的氨基酸序列的序列對(duì)比=Acremoniumsp. (I), Volutella colletotrichoides, Crinipellis scabella, Acremonium sp. (II), Myceliophthora thermophila, Thielaviaterrestris, Macrophomina phaseolina。 M Pileup程序(Feng和Doolittle 1987) (GCG包，版本8. 0)產(chǎn)生最好的序列對(duì)比。在至少四 個(gè)序列中相同的殘基(方框中)在相應(yīng)的氨基酸周圍表示出來(lái)。圖2圖加，b，c說(shuō)明在真菌界內(nèi)的本文所討論的所有微生物(其能夠產(chǎn)生本發(fā)明 的酶制劑和酶)的分類學(xué)分類。本文使用的分類學(xué)分類基于用于NIH數(shù)據(jù)庫(kù)(Entrez 1996春天版)的系統(tǒng)，該 ^^π!Ι^ ,/ΛWorld Wide Web (http://www3. ncbi. nlm. nih. gov/htbin/ef/entrez TAX) 1 得。對(duì)未包含在Entrez數(shù)據(jù)庫(kù)中的生物體的分類，使用了下列一般可獲得的和世界 范圍內(nèi)接受的參考書(shū)對(duì)于子囊菌綱(Ascomycetes) :Eriksson，0. Ε. &Hawksworth, D. L.子囊菌綱系 統(tǒng)，vol 12(1993)。對(duì)于擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes) Julich, W，擔(dān)子菌綱的較高分類群， Bibliotheca Mycologia 85，485pp (1981)。對(duì)于接合菌綱0' Donnel 1，K.培養(yǎng)中的接合菌綱，佐治亞大學(xué)，美國(guó)， 257pp(1979)。一般性的微生物學(xué)參考書(shū)Hawksworth, D. L.，Kirk, P. Μ.，Sutton, B. C.禾口 Pegler，D. N.真菌詞典，國(guó)際真 菌學(xué)研究所，616pp (1995)；Von Arx, J. A,培養(yǎng)中形成孢子的真菌屬，4Mpp (1981)。迄今仍不清楚腐質(zhì)霉屬(Humicola)的分類學(xué)位置(implacement)。然而，糞 殼目(Sordariales)廣泛選擇的18SRNA的研究已給出腐質(zhì)霉屬歸于糞殼目的有力的提 示(Taylor，Clausen & Oxenb Φ 11，未發(fā)表)。此外，這些數(shù)據(jù)表明腐質(zhì)霉屬與蛾柱霉屬 (Scytalidium) 一起與糞殼科、毛殼科，長(zhǎng)喙殼科(Ceratostoma taceae)和毛球殼科僅有相當(dāng)遠(yuǎn)的關(guān)系。依據(jù)上述，在這里將腐質(zhì)霉屬和Scytalidium置于糞殼目?jī)?nèi)，科未知。圖3是推定的部分氨基酸序列的序列對(duì)比，所述序列來(lái)源于實(shí)施例5中描述的46 種微生物中選擇的沈種。發(fā)明詳述在本文中，術(shù)語(yǔ)“20種天然氨基酸殘基”指通常在蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的20種氨基酸殘 基，照慣例被認(rèn)為是丙氨酸(Ala或A)、纈氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、異亮氨酸(lie 或I)、脯氨酸(Pro或P)、苯丙氨酸(Phe或F)、色氨酸(Trp或W)、甲硫氨酸(Met或Μ)、甘 氨酸(Gly或G)、絲氨酸(Ser或幻、蘇氨酸(Thr或Τ)、半胱氨酸(Cys或C)、酪氨酸(Tyr或 Y)、天冬酰胺(Asn或N)、谷氨酰胺(Gln或Q)、天門(mén)冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、 賴氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)、和組氨酸(Hi s或H)。按照本發(fā)明，本發(fā)明提供了新的性能良好的內(nèi)切葡聚糖酶，其包含保守氨基酸序 列區(qū)，尤其是具有以下序列的由14個(gè)氨基酸殘基組成的第一氨基酸序列Thr Arg Xaa Xaa Asp Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp Xaa1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14和具有以下序列的由5個(gè)氨基酸殘基組成的第二氨基酸序列Trp Cys Cys Xaa Cys12 3 4 5其中，在第一序列的3號(hào)位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe ；在第一序列的4號(hào)位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe ；在第一序列的8號(hào)位置上，氨基酸是Arg、Lys或His ；在第一序列9、10、12和14號(hào)的各位置上，在第二序列的4號(hào)位置上，氨基酸是20 個(gè)天然氨基酸殘基中的任何一個(gè)，其條件是在第一氨基酸序列中，(i)當(dāng)12號(hào)位置上的氨 基酸殘基是Ser時(shí)，14號(hào)位置上的氨基酸殘基不是義！·，和(ii)當(dāng)12號(hào)位置上的氨基酸殘 基是Gly時(shí)，14號(hào)位置上的氨基酸殘基不是Ala。優(yōu)選地，本發(fā)明的酶是微生物來(lái)源的，即是可以從微生物(如真菌)獲得的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在第一序列的9號(hào)位置上的氨基酸殘基選自脯氨酸、 蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰 胺、酪氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，優(yōu)選地選自脯氨酸和蘇氨酸。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在第一序列的10號(hào)位置上的氨基酸殘基選自脯氨 酸、蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷 氨酰胺、酪氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，優(yōu)選地是絲氨酸。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，在第一序列的12號(hào)位置上氨基酸殘基選自脯氨酸、蘇 氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰 胺、酪氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，優(yōu)選地選自丙氨酸和甘氨酸。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在第一序列的14號(hào)位置上的氨基酸殘基選自脯氨 酸、蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷 氨酰胺、酪氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、谷氨酸和天冬氨酸，優(yōu)選地選自脯氨酸、蘇氨 酸、絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸和天冬氨酸。
優(yōu)選地，在第二序列的4號(hào)位置上的氨基酸殘基選自脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、丙 氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、絲氨 酸、甲硫氨酸、色氨酸、谷氨酸和天冬氨酸，更優(yōu)選地選自丙氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺。更優(yōu)選的實(shí)施方案的例子是這樣的一些，其中，在第一序列中，第3號(hào)位置上的氨 基酸殘基是酪氨酸；或在第4號(hào)位置上的氨基酸殘基是色氨酸；或在第8號(hào)位置上的氨基 酸殘基是賴氨酸。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶包括選自以下序列的氨基酸序列Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Ala Trp1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13，Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Thr Ser Cys Ala Trp1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13，和Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13在第二方面，本發(fā)明提供了用于發(fā)現(xiàn)和克隆編碼這種酶的基因的方法，該方法包 括在標(biāo)準(zhǔn)條件下與來(lái)源于任何保守區(qū)的寡核苷酸雜交(例如PCR擴(kuò)增)，如圖1所說(shuō)明的。一種有用的寡核苷酸包含編碼包含在選自以下序列的肽中的至少五肽的核苷酸 序列a.Thr Arg Xaa Xaa Asp Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp Xaa1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14在3或4在號(hào)位置上的氨基酸是Trp、Tyr或Wie ；在8號(hào)位置上的氨基酸是Arg、 Lys或His ；在9、10、12和14號(hào)位置上的氨基酸分別是20個(gè)天然氨基酸殘基中的任何一 個(gè)；和b.Trp Cys Cys Xaa Cys Tyr1 2 3 4 5 6在4號(hào)位置上的氨基酸是20個(gè)天然氨基酸殘基中的任何一個(gè)；和c.Xaa Pro Gly Gly Gly Xaa Gly Xaa Phe1234567891號(hào)位置上的氨基酸是Met或lie ;6和8號(hào)位置上的氨基酸分別是Leu、Ile或 Val ；和d.Gly Cys Xaa Xaa Arg Xaa Asp Trp Xaa123456789在3號(hào)位置上的氨基酸是20個(gè)天然氨基酸殘基中的任何一個(gè)；在4和6號(hào)位置上 的氨基酸分別是iTrp、Tyr或Phe ；并且在9號(hào)位置上的氨基酸是Phe或Met。
所述有用的寡核苷酸也包括與以上所述序列互補(bǔ)的核苷酸序列。在本發(fā)明的方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸相應(yīng)于選自以下PCR引 物的PCR引物有義，5，-CCCCAAGCTTACIa/cGITA7tTGGGA7tTGc/tTG7tAAa/ga/cC-3，反義1，5，CTAGTCTAGATAa/gCAIGCa/gCAa/gCACC-3，；反義2，CTAGTCTAGAAAIAa/g/tICCIAa/c/gICCICCICCIGG-3，；禾口反義3，5，-CTAGTCTAGAIAACCAa/gTCAa/ga/tAIC7tCC-3.在第三方面，本發(fā)明提供了一種酶制劑，該制劑實(shí)質(zhì)上由具有溶纖活性和具有發(fā) 明人所發(fā)現(xiàn)的保守區(qū)的酶組成，該酶包含具有下列序列的由7個(gè)氨基酸序列組成的肽Xaa Thr Arg Xaa Phe Asp Xaa1 2 3 4 5 6 7Xaa Thr Arg Xaa Tyr Asp Xaa1 2 3 4 5 6 7 ；和Xaa Thr Arg Xaa Trp Asp Xaa1 2 3 4 5 6 7其中，在4號(hào)位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe ；和在1和7號(hào)位置上，Xaa是20個(gè)天然氨基酸殘基中的任何一個(gè)。這種酶是可以從屬于擔(dān)子菌門(mén)的層菌綱菌株優(yōu)選地屬于蘑菇目、木耳目和非褶菌 目的菌株，更優(yōu)選的屬于黑耳科、口蘑科、鬼傘科、裂褶菌科、煙管菌科和多孔菌科的菌株， 特別是屬于黑耳屬、毛皮傘屬、層孔菌屬、斑褶菇屬、栓菌屬、裂褶菌屬和綿皮孔菌屬的菌株 獲得的(參見(jiàn)圖2)。特定的例子是可以從屬于黑膠耳、Crinipellis scabella、木蹄層孔菌和 Spongipellis sp.的菌株，特別是可以從黑膠耳 CBS 277. 96、Crinipellis scabella CBS 280. 96、木蹄層孔菌CBS 276. 96和Spongipellis sp. CBS 283. 96獲得的內(nèi)切葡聚糖酶。按照布達(dá)佩斯條約，黑膠耳于1996年3月12日以保藏號(hào)CBS 277. 96保藏在真 菌菌種保藏中心，Oosterstraat 1，Postbus 273，NL-3740 AGBaarn，荷蘭；Crinipellis scabella于1996年3月12日以保藏號(hào)CBS280. 96保藏在真菌菌種保藏中心，Oosterstraat 1，Postbus 273，NL-3740 AG Baarn,荷蘭；木蹄層孔菌于1996年3月12日以保藏號(hào) CBS276. 96 保藏在真菌菌種保藏中心，Oosterstraat LPostbus 273，NL-3740AG Baarn，荷 蘭；Spongipellis sp.于1996年3月12日以保藏號(hào)CBS觀3. 96保藏在真菌菌種保藏中 AsOosterstraat 1, Postbus273, NL-3740AG Baarn,荷蘭。本發(fā)明的酶制劑是也可以從屬于壺菌門(mén)的菌株，優(yōu)選地屬于壺菌綱的菌株，更優(yōu) 選地屬于Spizellomycetales目的菌株，特別優(yōu)選地屬于Spizellomycetaceae科的菌株， 尤其是屬于囊壺菌屬的菌株獲得的。所說(shuō)菌株的特定的例子是屬于紅根囊壺菌的菌株，尤其是紅根囊壺菌CBS282. 96。按照布達(dá)佩斯條約，紅根囊壺菌于1996年3月12日以保藏號(hào)CBS282. 96保藏在 真菌菌種保藏中心，Oosterstraat 1，Postbus 273，NL-3740 AG Baarn，荷蘭。本發(fā)明的酶制劑也可以從屬于接合菌門(mén)的菌株，優(yōu)選地從屬于接合菌綱的菌株， 更優(yōu)選地從毛霉目的菌株，尤其是從屬于毛霉科和枝霉科的菌株，尤其是屬于根毛霉屬、須 霉屬和刺枝霉屬的菌株獲得。特定菌株的例子是屬于Miizomucor pusillus，閃光須霉和弗 雷生刺枝霉的菌株，特別是Rhizomucor pusillus IFO 4578、閃光須霉IFO 4814和弗雷生 刺枝霉NRRL2305。此外，本發(fā)明的酶制劑也可以從屬于Archaeascomycetes、盤(pán)菌綱，半子囊菌亞 綱，腔菌綱和不整囊菌綱的菌株，優(yōu)選地從屬于由盤(pán)菌目、斑痣盤(pán)菌目(Miytismatales)、 座囊菌目和散囊菌目的菌株獲得。尤其是所述酶可以從屬于葫蘆霉科、糞盤(pán)菌科、斑痣盤(pán) 菌科和發(fā)菌科的菌株，優(yōu)選地從屬于色二孢屬、Microsphaeropsis, Ulospora、殼球孢屬， 糞盤(pán)菌屬，Saccobolus、青霉屬和Thermomyces的菌株獲得。特定的例子是可以從以下菌 株獲得的酶，所述菌株是屬于由棉色二孢、Microsphaeropsis sp.、Ulospora bilgramii、 Aureobasidium sp.、Macrophomina phaseolina、Ascobolus stictoides、Saccobolus dilutellus、盤(pán)菌屬(Peziza)、撫抱青霄、產(chǎn)黃青霄禾口 Thermomyces verrucosus tT、J 囷休, 特別是棉色二孢 CBS274. 96、Ulospora bilgramii NKBC 1444、Macrophomina phaseolina CBS281. 96、Saccobolus dilutellus CBS 275. 96、撫孢青霉 ATCC 62396、產(chǎn)黃青霉 ATCC 9480 禾口 Thermomyces verrucosus CBS 285.96。按照布達(dá)佩斯條約，棉色二孢于1996年3月12日以保藏號(hào)CBS 274. 96保藏在真 菌菌種保藏中心；Macrophomina phaseolina于1996年3月12日以保藏號(hào)CBS 281. 96保 藏在真菌菌種保藏中心；Saccobolus dilutellus于1996年3月12日以保藏號(hào)CBS 275.96 保藏在真菌菌種保藏中心；Thermomyces verrucosus于1996年3月12日以保藏號(hào)CBS 285. 96保藏在真菌菌種保藏中心。此外，所述酶可以從屬于間座殼目、炭角菌目、假毛球殼目和黑痣菌目的菌株， 優(yōu)選地從屬于炭角菌科、黑腐皮殼科和Wiyllachoraceae的菌株，更優(yōu)選地從屬于由間 座殼屬、刺盤(pán)孢屬、黑孢屬、炭角菌屬、Nodulisporum和孔座殼屬的菌株獲得。特定的菌 株的例子是屬于Diaporthesyngenesia、葫蘆科刺盤(pán)孢、鹿角團(tuán)炭角菌、Nigrospora sp.、 Nodulisporum sp.和點(diǎn)孔座殼的菌株，特別是 Diaporthe syngenesia CBS278. 96、葫蘆科 刺盤(pán)孢 ATCC 52609、Nigrospora sp. CBS 272. 96、鹿角團(tuán)炭角菌 CBS 284，96。按照布達(dá)佩斯條約，Diaporthe syngenesia于1996年3月12日以保藏號(hào)CBS 278. 96保藏在真菌菌種保藏中心；Nigrospora sp.于1996年3月12日以保藏號(hào)CBS 272. 96保藏在真菌菌種保藏中心；鹿角團(tuán)炭角菌于1996年3月12日以保藏號(hào)CBS 284. 96 保藏在真菌菌種保藏中心。所述酶也可從按照布達(dá)佩斯于1996年3月12日分別以保藏號(hào)CBS270. 96、 CBS 271. 96和CBS273. 96保藏在真菌菌種保藏中心的未鑒別的真菌(有絲分裂孢子的， coleomycetous)獲得。所述酶也可從以下菌株獲得，所述菌株是屬于柱孢屬、粘帚霉屬、赤殼屬、 M ji β M> ^ ^ M> Scytalidium、 包冑屬、Syspastospora> Cladorrhinum> 毛 ^屬、Myceliphthora禾口頂抱霄屬的菌株，特別是屬于Cylindrocarpon sp. 、Nectria pinea、Volutella colletotrichoides、獎(jiǎng)生獎(jiǎng)殼、大抱獎(jiǎng)殼、Thielavia terrestris、 Thielavia thermophila> Syspastospora boninensis> Cladorrhinum foecundissimum> 墻毛殼、Chaetomium virescens> Chaetomium brasiliensis> Chaetomiumcunicolorum> Myceliophthora thermophila、鏈抱粘帚霉、Scytalidiumthermophila 禾口 Acremonium sp 的菌株，尤其是 Nectria pinea CBS 279. 96> Volutella colletotrichoides CBS 400. 58、糞生糞殼 ATCC 52644、大孢糞殼 ATCC 60255、Thielavia terrestris NRRL 8126、 Thielaviathermophila CBS 174. 70、墻毛殼 CBS 163. 52> Chaetomium virescensCBS 547. 75、Chaetomium brasiliensis CBS 122. 65、Chaetomiumcunicolorum CBS 799. 83、 Syspastospora boninensis NKBC 1515、Cladorrhinum foecrundissimum ATCC 62373> Myceliophthorathermophila CBS 117. 65,Scytalidium thermophila ATCC 28085、鏈孢粘 帚霉 ATCC 10523 和 Acremonium sp. CBS 478. 94。按照布達(dá)佩斯條約，Nectria pinea于1996年3月12日以保藏號(hào)CBS279. 96保 藏在真菌菌種保藏中心；Acremonium sp.于1994年9月28日以保藏號(hào)CBS 478. 94保藏。所述酶也可以從屬于腐皮鐮孢、蛇形鐮孢、早熟禾鐮孢、尖鐮孢ssp. Iycopersici, 尖鐮孢ssp. passiflora、黑腐質(zhì)霉和灰腐質(zhì)霉的菌株，尤其是番茄尖鐮孢ssp Iycopersici CBS 645. 78、尖鐮孢 ssppassiflora CBS 744. 79、腐皮鐮孢 IMI 107. 511、蛇形鐮孢 IFO 4467、早熟禾鐮孢ATCC 60883、黑腐質(zhì)霉CBS 819. 73和灰腐質(zhì)霉ATCC 227 獲得。應(yīng)當(dāng)注 意灰腐質(zhì)霉不同于灰腐質(zhì)霉thermoidea變種。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶制劑來(lái)源于所公開(kāi)的綱、目、科、屬和種，并 且實(shí)質(zhì)上由下述酶組成，所述酶包含具有以下序列的由13個(gè)氨基酸殘基組成的第一肽Thr Arg Xaa Xaa Asp Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13和具有以下序列的由5個(gè)氨基酸殘基組成的第二肽Trp Cys Cys Xaa Cys12 3 4 5其中，在第一序列的3號(hào)位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe ；在第一序列的4號(hào)位 置上，氨基酸是Trp、Tyr或Wie ；在第一序列的8號(hào)位置上，氨基酸是Arg、Lys或His ；在第 一序列9、10和12號(hào)的各位置上，在第二序列的4號(hào)位置上，氨基酸是20個(gè)天然氨基酸殘 基中的任何一個(gè)。優(yōu)選地，在第一序列的9號(hào)位置上的氨基酸殘基選自脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、丙 氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、絲氨 酸、甲硫氨酸和色氨酸，更優(yōu)選地選自脯氨酸和蘇氨酸；在第一序列的10號(hào)位置上的氨基 酸殘基選自脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨 酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，優(yōu)選地是絲氨酸；在第一序列 的12號(hào)位置上的氨基酸殘基選自脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙 氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，優(yōu)選地 選自丙氨酸和甘氨酸；在第二序列的4號(hào)位置上的氨基酸殘基選自脯氨酸、蘇氨酸、纈氨 酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、谷氨酸和天冬氨酸，更優(yōu)選地選自丙氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺。另一方面，本發(fā)明提供了一種DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含編碼顯示內(nèi)切葡聚糖酶 活性之酶的DNA序列，所述DNA序列包括a)分別在SEQ ID NO :1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列和/或可以分 別從啤酒糖酵母 DSM 9770、DSM 10082、DSM 10080、DSM 10081，大腸桿菌 DSM 10512、DSM 1051UDSM 10571, DSM 10576中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，或者b)分別在SEQ ID NO 1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列的類似物或可以 分別從啤酒糖酵母 DSM 9770、DSM 10082、DSM10080、DSM 10081，大腸桿菌 DSM 10512、DSM 1051UDSM 10571, DSM 10576中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的類似物，該類似物i)同源于分別在SEQ ID NO :1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列和/或 可以分別從啤酒糖酵母 DSM 9770、DSM 10082、DSM10080、DSM 10081，大腸桿菌 DSM 10512、 DSM 1051UDSM 10571, DSM 10576 中的質(zhì)粒獲得的 DNA 序列，ii)與分別在SEQ ID NO :1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列和/或可以 分別從啤酒糖酵母 DSM 9770、DSM 10082、DSM10080、DSM 10081、大腸桿菌 DSM 10512、DSM 1051UDSM 10571, DSM 10576中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的相同核苷酸探針雜交，iii)編碼一種多肽，該多肽同源于由一種DNA序列編碼的多肽，所述DNA序列包 含分別在SEQ ID NO :1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列和/或可以分別從啤酒 糖酵母 DSM 9770、DSM 10082、DSM10080、DSM 10081，大腸桿菌 DSM 10512、DSM 10511、DSM 10571, DSM 10576中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，iv)編碼一種多肽，該多肽是與一種抗純化內(nèi)切葡聚糖酶的抗體免疫學(xué)反應(yīng)性的， 所述內(nèi)切葡聚糖酶由分別在SEQ ID NO :1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列或可以 分別從啤酒糖酵母 DSM 9770、DSM10082、DSM 10080、DSM 10081，大腸桿菌 DSM 10512、DSM 1051UDSM 10571, DSM 10576中的質(zhì)粒獲得的DNA序列編碼。按照布達(dá)佩斯條約，大腸桿菌DSM 10512已于1996年2月2日保藏在DSM(德意 志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 16，D_38124Braunschweig，德國(guó))。按照布達(dá)佩斯條約，大腸桿菌DSM 10511已于1996年2月2日保藏在DSM(德意 志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 16，D_38124Braunschweig，德國(guó))。按照布達(dá)佩斯條約，大腸桿菌DSM 10571已于1996年3月6日保藏在DSM(德意 志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 16，D_38124Braunschweig，德國(guó))。按照布達(dá)佩斯條約，大腸桿菌DSM 10576已于1996年3月12日保藏在DSM (德意 志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 16，D_38124Braunschweig，德國(guó))。按照布達(dá)佩斯條約，大腸桿菌DSM 10583已于1996年3月13日保藏在DSM (德意 志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 16，D_38124Braunschweig，德國(guó))。按照布達(dá)佩斯條約，大腸桿菌DSM 10584已于1996年3月13日保藏在DSM (德意 志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 16，D_38124Braunschweig，德國(guó))。按照布達(dá)佩斯條約，大腸桿菌DSM 10585已于1996年3月13日保藏在DSM (德意 志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 16，D_38124Braunschweig，德國(guó))。按照布達(dá)佩斯條約，大腸桿菌DSM 10586于1996年3月13日保藏在DSM (德意志 微生物保藏中心，Mascheroder Weg 16，D_38124Braunschweig，德國(guó))。
按照布達(dá)佩斯條約，大腸桿菌DSM 10587已于1996年3月13日保藏在DSM (德意 志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 16，D_38124Braunschweig，德國(guó))。按照布達(dá)佩斯條約，大腸桿菌DSM 10588已于1996年3月13日保藏在DSM (德意 志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 16，D_38124Braunschweig，德國(guó))。按照布達(dá)佩斯條約，啤酒糖酵母DSM 9770已于1995年2月M日保藏在DSM(德 意志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 16，D_38124Braunschweig，德國(guó))。按照布達(dá)佩斯條約，啤酒糖酵母DSM 10082已于1995年6月30日保藏在DSM (德 意志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 16，D_38124Braunschweig，德國(guó))。按照布達(dá)佩斯條約，啤酒糖酵母DSM 10080已于1995年6月30日保藏在DSM (德 意志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 16，D_38124Braunschweig，德國(guó))。按照布達(dá)佩斯條約，啤酒糖酵母DSM 10081已于1995年6月30日保藏在DSM(德 意志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 16，D_38124Braunschweig，德國(guó))。與SEQ ID NO 1有關(guān)的本發(fā)明DNA構(gòu)建體可以從毀絲霉屬的菌株，特別是 M. thermophila的菌株，尤其是M. thermophila CBS 117. 65的DNA文庫(kù)分離或者基于該文 庫(kù)產(chǎn)生。與SEQ ID NO :4和6有關(guān)的本發(fā)明DNA構(gòu)建體可以從頂孢霉屬的菌株，尤其是 Acremonium sp. CBS 478. 94的DNA文庫(kù)分離或者基于該文庫(kù)產(chǎn)生。與SEQ ID NO :8有關(guān)的本發(fā)明DNA構(gòu)建體可以從梭孢殼屬的菌株，特別是 Thielavia terrestris 的菌株，尤其是 Thielavia terrestris NRRL8126 的 DNA 文庫(kù)分離
或者基于該文庫(kù)產(chǎn)生。與SEQ ID NO :10有關(guān)的本發(fā)明DNA構(gòu)建體可以從殼球孢屬的菌株，特別是 M. phaseolina的菌株，尤其是M. phaseolina CBS沘1. 96的DNA文庫(kù)分離或者基于該文庫(kù)產(chǎn)生。與SEQ ID NO :12有關(guān)的本發(fā)明DNA構(gòu)建體可以從毛皮傘屬的菌株，特別是 C. scabella的菌株，尤其是C. scabella CBS觀0. 96的DNA文庫(kù)分離或者基于該文庫(kù)產(chǎn)生。與SEQ ID NO 19有關(guān)的本發(fā)明DNA構(gòu)建體可以從糞殼屬的菌株，特別是糞生糞殼 的菌株的DNA文庫(kù)分離或者基于該文庫(kù)產(chǎn)生。在本發(fā)明中，分別在SEQ ID NO :1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列的〃
類似物"意指任何編碼顯示內(nèi)切葡聚糖酶活性的酶的DNA序列，其具有性質(zhì)i)-iv)的任一 或全部。類似的DNA序列a)可以基于分別在SEQ ID NO :1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列，采用
例如本文所公開(kāi)的方法，從產(chǎn)生具有內(nèi)切葡聚糖酶活性之酶的其它或者相關(guān)(例如，相同) 生物體分離；同系物可以是包含本文所示的DNA序列的DNA序列的等位變體，即經(jīng)突變產(chǎn)生 的基因的另一種形式。突變可以是沉默的(在編碼的酶上無(wú)變化)或可以編碼具有改變的 氨基酸序列的酶；所述DNA序列的同系物也可以是屬或種同系物，編碼來(lái)源于另一個(gè)種的 具有類似性質(zhì)的酶。b)可以基于分別在SEQ ID NO :1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列構(gòu)建，
例如通過(guò)引入不產(chǎn)生另一個(gè)由所述DNA序列編碼的內(nèi)切葡聚糖酶的氨基酸序列(但其相應(yīng)于用于產(chǎn)生所述酶的生物體的密碼子使用)的核苷酸取代，和能夠產(chǎn)生一種不同的氨基酸 序列的核苷酸取代。然而，在后一種情況下，氨基酸的變化優(yōu)選地是次要性質(zhì)的改變(其是 保守氨基酸取代，不明顯地影響蛋白質(zhì)的折疊或活性)、小的缺失(典型地是1到約30個(gè) 氨基酸)；小的氨基-或羧基-末端延伸(如氨基-末端甲硫氨酸殘基)，至大約20-25個(gè) 殘基的小的接頭肽或有利于純化的小的延伸(如聚-組氨酸束，抗原表位或結(jié)合域)，總的 情況參見(jiàn)R)rd等，蛋白質(zhì)表達(dá)和純化，2 :95-107，1991。保守取代的例子在下列氨基酸的范 圍內(nèi)堿性氨基酸(如精氨酸，賴氨酸，組氨酸)，酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)，極性 氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水氨基酸(如亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸)，芳族氨基 酸(如苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸)和小氨基酸(如甘氨酸，丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，甲硫氨 酸)。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，可以進(jìn)行這樣的取代，其在對(duì)所述分子的功能關(guān) 鍵性的區(qū)域之外，并且仍然產(chǎn)生活性多肽?？梢园凑毡绢I(lǐng)域已知的方法鑒別對(duì)本發(fā)明的 DNA構(gòu)建體編碼的多肽之活性必需的氨基酸，所述方法例如定向誘變或丙氨酸-掃描誘 變(Cunningham和Wells，科學(xué)244，1081-1085，1989)。在后一技術(shù)中，在分子中的任何殘 基上引入突變，試驗(yàn)形成的突變體分子的生物學(xué)(即內(nèi)切葡聚糖酶)活性，以鑒別對(duì)所說(shuō) 分子活性關(guān)鍵性的氨基酸殘基。底物-酶相互作用的位點(diǎn)也可以通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)(由核磁 共振、結(jié)晶學(xué)或光親和性標(biāo)記法之類的技術(shù)測(cè)定的)分析測(cè)定。參見(jiàn)例如de Vos等，科 學(xué) 255 :306-312,1992 ；Smith 等，分子生物學(xué)雜志· 224 :899-904,1992 ；Wlodaver 等，F(xiàn)EBS Lett. 309 :59-64,1992。由本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的DNA序列編碼的內(nèi)切葡聚糖酶可以包括纖維素結(jié)合域 (CBD)，以編碼完整酶一部分存在，或者其它來(lái)源的CBD可以引入進(jìn)內(nèi)切葡聚糖酶酶，由此 產(chǎn)生酶雜合體。在本文中，術(shù)語(yǔ)"纖維素-結(jié)合域"應(yīng)如Peter Tomme等“不溶性碳水 化合物的酶促降解”中的“纖維素-結(jié)合域分類和性質(zhì)”，John N. Saddler and Michael H. Penner (編者)，ACS專題研討系列No. 618，1996所定義的來(lái)理解。這一定義把120種以 上的纖維素-結(jié)合域(CBD)分類成10個(gè)家族(I-X)，并且其說(shuō)明CBD在各種酶中發(fā)現(xiàn)，如 纖維素酶，木聚糖酶，甘露聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，乙酰酯酶和殼多糖酶。CBD也在藻類 中發(fā)現(xiàn)，例如，作為-非水解多糖類-結(jié)合的紅藻Porphyra purpurea蛋白質(zhì)，參見(jiàn)Peter Tomme等，同上。然而，大多數(shù)CBD來(lái)源于纖維素酶和木聚糖酶。CBD在蛋白質(zhì)的N或C末 端或內(nèi)部發(fā)現(xiàn)。酶雜合體在本領(lǐng)域是已知的，參見(jiàn)例如WO 90/00609和W095/16782，并且可 以通過(guò)將包含至少一種編碼纖維素-結(jié)合域的DNA片段(其帶有或不帶有接頭，與編碼目 的酶的DNA序列連接)的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞中，并培養(yǎng)該宿主細(xì)胞以表達(dá)融合基 因來(lái)制備。酶雜合體可以用下式來(lái)描述CBD-MR-X，其中CBD是相應(yīng)于至少纖維素-結(jié)合域的氨基酸序列的N-末端或C-末端區(qū)；MR 是中間區(qū)(接頭)，和可以是化學(xué)鍵或者短的連接基團(tuán)，這些基團(tuán)優(yōu)選地具有約2至100個(gè) 碳原子，更優(yōu)選地具有2至40碳原子；或者優(yōu)選地是約2至約100個(gè)氨基酸，更優(yōu)選地是2 至40個(gè)氨基酸；X是由本發(fā)明的DNA序列編碼的多肽的N-末端或者C-末端區(qū)。以兩種序列之間的等同性的程度測(cè)定以上i)中提及的同源性，表示第一序列和 第二序列的差別。同源性可以用本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序合適地測(cè)定，例如在GCG程序包
16中提供的 GAP(Needleman，S. B.和 Wunsch，C. D.，分子生物學(xué)雜志，48 :443-453,1970)。采 用GAP和下列設(shè)置進(jìn)行DNA序列比較GAP產(chǎn)生罰分5. 0和GAP延伸罰分0. 3，所述DNA序 列的編碼區(qū)顯示與分別在SEQ ID NO :1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列或者可以 分別從啤酒糖酵母 DSM 9770、DSM 10082、DSM 10080、DSM10081，大腸桿菌 DSM 10512、DSM 10511、DSM 10571或DSM 10576中的質(zhì)粒獲得的DNA序列具有優(yōu)選地至少60%，更優(yōu)選地 至少65%，更優(yōu)選地70%，更優(yōu)選地至少80%，尤其是至少90%的等同性程度。以上ii)中提及的雜交意指在某些特點(diǎn)的條件下(在此后的材料和方法中詳細(xì)描 述)，類似的DNA序列雜交到編碼內(nèi)切葡聚糖酶的DNA序列的相同探針上。所使用的寡核 苷酸探針是相應(yīng)于分別在SEQ ID NO :1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列或者可以 分別從啤酒糖酵母 DSM9770、DSM 10082、DSM 10080、DSM 10081，大腸桿菌 DSM 10512、DSM
10511、DSM10571或DSM 10576中的質(zhì)粒獲得的DNA序列之內(nèi)切葡聚糖酶編碼部分的DNA 序列。以兩種序列之間的等同性的程度測(cè)定以上iii)中提及的同源性，表示第一序列 和第二序列的差別。同源性可以用本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序合適地測(cè)定，例如在GCG程序 包中提供的 GAP (Needleman，S. B.和 Wunsch，C. D.，分子生物學(xué)雜志，48 :443-453,1970)。 采用GAP和下列設(shè)置進(jìn)行多肽序列比較GAP產(chǎn)生罰分3. 0和GAP延伸罰分0. 1，類似DNA 序列編碼的多肽顯示與包含分別在SEQ ID N0:l、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序 列或者可以分別從啤酒糖酵母DSM 9770、DSM 10082、DSM10080、DSM 10081，大腸桿菌DSM
10512、DSM10511、DSM 10571或DSM10576中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的DNA構(gòu)建體所編碼 的酶具有優(yōu)選地至少陽(yáng)%，更優(yōu)選地至少60 %，更優(yōu)選地65 %，更優(yōu)選地至少70 %，更優(yōu)選 地至少80 %，尤其是至少90 %的等同性程度。關(guān)于以上iv)提及的性質(zhì)，意指分別由從啤酒糖酵母DSM 9770、DSM10082、DSM 10080、DSM 10081，大腸桿菌 DSM 10512、DSM 10511、DSM 10571 或 DSM 10576 分離的 DNA
序列編碼和由用所說(shuō)DNA序列轉(zhuǎn)化的宿主生物體產(chǎn)生的內(nèi)切葡聚糖酶酶，或者分別由 Myceliophthora thermophila、Acremonium sp.、Thielavia terrestris、Macrophomina phaseolina、Crinipellis scabella、Volutella colletotrichoides 或獎(jiǎng)生獎(jiǎng)殼天然內(nèi)切 葡聚糖酶?？梢杂靡韵虏牧虾头椒ú糠置枋龅姆椒y(cè)定免疫學(xué)反應(yīng)性。本發(fā)明的另一方面涉及具有本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的表達(dá)載體、包含所說(shuō)DNA構(gòu)建 體和表達(dá)載體的細(xì)胞以及產(chǎn)生顯示內(nèi)切葡聚糖酶活性之酶的方法，該方法包括在可以產(chǎn)生 所說(shuō)酶的條件下培養(yǎng)所說(shuō)的細(xì)胞，并從培養(yǎng)物回收所說(shuō)的酶。本發(fā)明的另一方面涉及一種顯示內(nèi)切葡聚糖酶活性的酶，這種酶a)由本發(fā)明的DNA構(gòu)建體編碼b)用本發(fā)明的方法產(chǎn)生 c)與一種抗純化內(nèi)切葡聚糖酶的抗體是免疫學(xué)反應(yīng)性的，所述內(nèi)切葡聚糖酶由分 別在SEQ ID NO :1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列或者可以分別從啤酒糖酵母 DSM 9770、DSM 10082、DSM 10080、DSM 10081，大腸桿菌 DSM 10512、DSM 10511、DSM 10571 或DSM 10576中的質(zhì)粒獲得的DNA序列編碼。以上c)中提及的內(nèi)切葡聚糖酶可以是由從啤酒糖酵母DSM 9770、DSM10082、 DSM 10080、DSM 10081，大腸桿菌 DSM 10512、DSM 10511、DSM 10571 或 DSM 10576 分
17離的DNA序列編碼和由用所說(shuō)DNA序列轉(zhuǎn)化的宿主生物體產(chǎn)生的內(nèi)切葡聚糖酶，或 者分別 由 Myceliophthorathermophila、Acremonium sp.、Thielavia terrestris、 Macrophominaphaseolina>Crinipel 1 is scabella、Volutella colletotrichoides 或獎(jiǎng)生 糞殼天然相應(yīng)的內(nèi)切葡聚糖酶。一般地，在本文中，術(shù)語(yǔ)"酶"被理解為包括成熟蛋白質(zhì)或其前體形式以及其實(shí) 質(zhì)上具有全長(zhǎng)酶活性的功能性片段。此外，術(shù)語(yǔ)"酶"旨在包括所說(shuō)酶的同系物。所述酶的同系物可以具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，缺失或者添加。這些變化優(yōu)選 地是次要性質(zhì)的改變(其是保守氨基酸取代，不明顯地影響蛋白質(zhì)的折疊或活性)、小的缺 失(典型地是1到約30個(gè)氨基酸)；小的氨基-或羧基-末端延伸(如氨基-末端甲硫氨 酸殘基)，多至大約20-25個(gè)殘基的小的接頭肽或有利于純化的小的延伸(如聚-組氨酸 束，抗原表位或結(jié)合域)，總的情況參見(jiàn)i^ord等，蛋白質(zhì)表達(dá)和純化，2 :95-107，1991。保守 取代的例子在下列氨基酸的范圍內(nèi)堿性氨基酸(如精氨酸，賴氨酸，組氨酸)，酸性的氨基 酸(如谷氨酸和天冬氨酸)，極性氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水氨基酸(如亮氨 酸，異亮氨酸，纈氨酸)，芳族氨基酸(如苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸)和小氨基酸(如甘氨 酸，丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，甲硫氨酸)。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，可以進(jìn)行這樣的取代，其在對(duì)所述分子的功能關(guān) 鍵性的區(qū)域之外，并且仍然產(chǎn)生活性酶?？梢园凑毡绢I(lǐng)域已知的方法鑒別對(duì)本發(fā)明的 DNA構(gòu)建體編碼的酶之活性必需的氨基酸，所述方法例如定向誘變或丙氨酸-掃描誘變 (Cunninghan^P flfells，科學(xué)M4，1081-1085，1989)。在后一技術(shù)中，在分子中的任何殘基上 引入突變，試驗(yàn)形成的突變體分子的生物學(xué)(即內(nèi)切葡聚糖酶)活性，以鑒別對(duì)所說(shuō)分子活 性關(guān)鍵性的氨基酸殘基。配體-受體相互作用的位點(diǎn)也可以通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)(由核磁共振、 結(jié)晶學(xué)或光親和性標(biāo)記法之類的技術(shù)測(cè)定的)分析測(cè)定。參見(jiàn)例如de Vos等，1992 ；Smith 等，1992 ；Wlodaver 等，1992。同系物可以是等位變體，即經(jīng)突變產(chǎn)生的基因的另一種形式或可以是由突變基因 編碼的改變的酶(但具有與本發(fā)明的酶實(shí)質(zhì)上相同的活性)。由此突變可以是沉默的(編 碼的酶無(wú)改變)或者可以編碼具有改變的氨基酸序列的酶。所述酶的同系物也可以是屬或種同系物，即來(lái)源于另一物種的具有類似性質(zhì)的酶。所述酶的同系物可以通過(guò)本文描述的方法分離。經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)分子篩選和克隆使用從合適的來(lái)源(例如任何本文提及的生物體)分離的基因組DNA或者雙鏈 cDNA和基于本文公開(kāi)的DNA序列和氨基酸序列制備的合成寡核苷酸引物，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)進(jìn)行本發(fā)明的DNA序列的分子篩選。例如，合適的寡核苷酸引物可以是在材料和方法 部分中所描述的引物。依據(jù)眾所周知的方法，在分子篩選中所產(chǎn)生的PCR片段可以被分離和亞克隆進(jìn)合 適的載體中。經(jīng)例如菌落或者噬斑雜交，PCR片段可以用于篩選DNA文庫(kù)。酵母中的克隆表達(dá)可以通過(guò)一般性的方法分離編碼顯示內(nèi)切葡聚糖酶活性的酶的本發(fā)明的DNA序 列，所述方法包括
-在合適的載體中從合適的來(lái)源(例如任何本文提及的生物體)克隆DNA文庫(kù)，-用所說(shuō)的載體轉(zhuǎn)化合適的酵母宿主細(xì)胞，-在合適的條件之下培養(yǎng)所說(shuō)宿主細(xì)胞，以表達(dá)由DNA文庫(kù)中的克隆編碼的任何 興趣酶，-通過(guò)測(cè)定由這些克隆產(chǎn)生的酶的任何內(nèi)切葡聚糖酶活性篩選陽(yáng)性克隆，-從這些克隆分離編碼所述酶的DNA。在WO 94/14953中進(jìn)一步公開(kāi)了一般性的方法，該文獻(xiàn)的內(nèi)容本文一并參考。篩 選方法更詳細(xì)的描述在以下實(shí)施例1中給出?？梢苑蛛x編碼酶的DNA序列，所述分離是例如通過(guò)篩 選 Macrophominaphaseolina、Crinipel1 is scabella、 獎(jiǎng) 生 獎(jiǎng)殼或 Volutellacolletotrichoides的cDNA文庫(kù)，并選擇表達(dá)合適的酶活性(即內(nèi)切葡聚糖酶活 性)的克隆進(jìn)行分離；或者從按照布達(dá)佩斯條約于1996年2月2日保藏在DSM(德意志微 生物保藏中心，Mascheroder Weg 16，D_38124Braunschweig，德國(guó))的大腸桿菌 DSM 10512 分離；或者從按照布達(dá)佩斯條約于1996年2月2日保藏在DSM的大腸桿菌DSM 10511分離； 或者從按照布達(dá)佩斯條約于1996年3月12日保藏在DSM的大腸桿菌DSM 10576分離；或者 從按照布達(dá)佩斯條約于1996年3月6日保藏在DSM的大腸桿菌DSM10571分離；或者通過(guò) ff 選 Myceliphthora thermophila CBS 117. 65>Acremonium sp. CBS 478. 94 5 Thielavia terrestris NRRL 81 的cDNA文庫(kù)，并選擇表達(dá)合適的酶活性(即內(nèi)切葡聚糖酶活性)的 克隆進(jìn)行分離；或者從按照布達(dá)佩斯條約于1995年2月M日保藏在DSM (德意志微生物保 藏中心，Mascheroder Weg 16，D_38124Braunschweig，德國(guó))的啤酒糖酵母DSM 9770 分離； 或者從按照布達(dá)佩斯條約于1995年6月30日保藏在DSM的啤酒糖酵母DSM 10082分離； 或者從按照布達(dá)佩斯條約于1995年6月30日保藏在DSM的啤酒糖酵母DSM 10080分離； 或者從按照布達(dá)佩斯條約于1995年6月30日保藏在DSM的啤酒糖酵母DSM 10081分離。然后，可以用標(biāo)準(zhǔn)方法(如實(shí)施例1中所描述的)從所述克隆分離合適的DNA序 列。核酸構(gòu)建體本文使用的術(shù)語(yǔ)〃核酸構(gòu)建體〃旨在指任何cDNA、基因組DNA、合成DNA或者RNA 來(lái)源的核酸分子。術(shù)語(yǔ)"構(gòu)建體"旨在指核酸區(qū)段，其可以是單鏈或雙鏈，并且其可以是基 于編碼興趣酶的全部或部分天然核苷酸序列。所述構(gòu)建體可以含有可以不含有其它核酸區(qū) 段。編碼本發(fā)明酶的核酸構(gòu)建體可以是基因組或cDNA來(lái)源的，例如通過(guò)制備基因組 或者cDNA文庫(kù)，并按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(參見(jiàn)Sambrook等，1989)使用合成寡核苷酸探針經(jīng)雜交 篩選編碼全部或部分酶的DNA序列獲得。編碼酶的核酸構(gòu)建體也可以用已建立的標(biāo)準(zhǔn)的方法經(jīng)合成制備，所述方法例如由 Beaucage和Caruthers (1981)描述的氨基亞磷酸酯方法，或Matthes等(1984)描述的方 法。按照氨基亞磷酸酯方法，在例如自動(dòng)DNA合成儀中合成寡核苷酸，純化，退火，連接和在 合適的載體中克隆。此外，所述核酸構(gòu)建體可以是合成和基因組，合成和cDNA或基因組和cDNA混合來(lái) 源的，其是經(jīng)按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)連接合成、基因組或者cDNA來(lái)源的片段(相應(yīng)于完整的核酸構(gòu)建體的各種部分的片段)制備(以合適的方式)的。也可以采用特定的引物經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)制備所述的核酸構(gòu)建體，例如按照美國(guó)專 利4，683，202或Saiki等(1988)描述的方法制備。核酸構(gòu)建體優(yōu)選地是DNA構(gòu)建體，這一術(shù)語(yǔ)將一直用于本說(shuō)明書(shū)與權(quán)利要求書(shū) 中。重組載體包含編碼本發(fā)明的酶的DNA構(gòu)建體的重組載體可以是任何易于進(jìn)行DNA操作的載 體，載體的選擇常常取決于其所要引入的宿主細(xì)胞。這樣，載體可以是自主復(fù)制載體，即作 為染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制，例如質(zhì)粒。另外，載體可以是這 樣一種，當(dāng)其被引入宿主細(xì)胞時(shí)，整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組，并且與其整合進(jìn)的染色體一道復(fù) 制。所述載體優(yōu)選地是表達(dá)載體，在其中編碼本發(fā)明的酶的DNA序列可操作地連接到 該DNA轉(zhuǎn)錄所需的附加區(qū)段上。一般來(lái)說(shuō)，表達(dá)載體是來(lái)自質(zhì)?；虿《綝NA的或可以包含 它們的成分。術(shù)語(yǔ)"可操作連接"指所述區(qū)段排列得使它們對(duì)預(yù)期的目的協(xié)調(diào)起作用，例 如轉(zhuǎn)錄在啟動(dòng)子開(kāi)始，并且經(jīng)由編碼酶的DNA序列進(jìn)行。啟動(dòng)子可以是任何DNA序列，其在所選擇的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性，并且可以 來(lái)源于編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。用于酵母宿主細(xì)胞的合適的啟動(dòng)子的例子包括來(lái)源于酵母糖解基因(Hitzeman 等，生物化學(xué)雜志.255(1980),12073-12080 ；Alber和Kawasaki，分子應(yīng)用遺傳學(xué)雜 志，1(1982)，419-434)或酒精脫氫酶基因(Young等，化學(xué)品的基因工程和微生物學(xué) (Hollaender 等，編者)，Plenum 出版社，紐約，1982)的啟動(dòng)子，或者 TPIl (US 4，599，311) 或 ADH24c (Russell 等，自然，304 (1983)，652-654)啟動(dòng)子。用于絲狀真菌細(xì)胞的合適的啟動(dòng)子是例如ADH3啟動(dòng)子(McKnight等，The EMBO J. 4 (1985) ,2093-2099)或tpiA啟動(dòng)子。其它有用的啟動(dòng)子的例子是來(lái)源于編碼下列酶的 基因的那些，所述酶是米曲霉TAKA淀粉酶、lihizomucor miehei天冬氨蛋白酶、黑曲霉中性 α -淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定α -淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(gluA)、Rhizomucor miehei脂酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶或構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶。優(yōu)選的是 TAKA-淀粉酶和gluA啟動(dòng)子。用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的合適的啟動(dòng)子的例子包括嗜熱脂肪芽孢桿菌生麥淀粉酶基 因、地衣形芽孢桿菌α -淀粉酶基因、液解化淀粉桿菌BAN淀粉酶基因、枯草桿菌堿性蛋白 酶基因或短小芽孢桿菌木糖苷酶基因的啟動(dòng)子或噬菌體λ Pk或啟動(dòng)子或者大腸桿菌 lac、trp或tac啟動(dòng)子。如果需要，編碼本發(fā)明的酶的DNA序列也可以可操作地與合適的終止子連接。本發(fā)明的重組載體還可以包含使得所述載體在所說(shuō)的宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序 列。所述載體也可以包含選擇性標(biāo)記，例如，其產(chǎn)物補(bǔ)充宿主細(xì)胞缺陷的基因，如編碼 二氫葉酸還原酶(DHFR)的基因或粟酒裂殖酵母TPI基因(由P. R. Russell，基因40，1985， pp. 125-130描述)。對(duì)于絲狀真菌，選擇性標(biāo)記包括amdS、pyrG、argB、niaD、sC。為了引導(dǎo)本發(fā)明的酶進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑，也可以在重組載體中包含分泌信號(hào)序列(也稱作前導(dǎo)序列、前序列原或前序列)，將分泌信號(hào)序列在正確的讀框中與編碼酶 的DNA序列連接。分泌信號(hào)序列一般被置于編碼酶的DNA序列的5'。分泌信號(hào)序列可以 是通常與所述酶相關(guān)的或者可以是來(lái)源于編碼另一個(gè)分泌蛋白質(zhì)的基因的。為了從酵母細(xì)胞分泌，分泌信號(hào)序列可以編碼任何信號(hào)肽，該肽確保所表達(dá)的酶 以有效的方向進(jìn)入細(xì)胞的分泌途徑。信號(hào)肽可以是天然信號(hào)肽或其功能性部分，或者其可 以是合成肽。已發(fā)現(xiàn)合適的信號(hào)肽是α -因子信號(hào)肽(參見(jiàn)美國(guó)專利4，870，008)，小鼠唾液 淀粉酶信號(hào)肽(參見(jiàn)0. Hagenbuchle等，自然2891981，pp. 643-646)，修飾的羧肽酶信號(hào)肽 (參見(jiàn) L.A. Vails 等，細(xì)胞 48，1987，pp. 887-897)，酵母 BARl 信號(hào)肽(參見(jiàn) WO 87/02670)或 酵母天冬氨蛋白酶3(YAP3)信號(hào)肽(參見(jiàn)M. Egel-Mitani等，酵母，6，1990，pp. 127-137)。為了在酵母中有效地分泌，也可以將編碼前導(dǎo)肽的序列插入到信號(hào)序列的下游 和編碼酶的DNA序列的上游。前導(dǎo)肽的功能在于允許所表達(dá)的酶從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被引導(dǎo)到達(dá)高 爾基體，并進(jìn)一步到達(dá)分泌泡以便分泌到培養(yǎng)基中(即酶穿過(guò)細(xì)胞壁或至少穿過(guò)細(xì)胞膜 進(jìn)入酵母細(xì)胞的周質(zhì)空間的輸出)。前導(dǎo)肽可以是酵母α-因子前導(dǎo)肽(其用途在例如 US 4，546，082，EP 16 201，ΕΡ123 294, EP 123 544 和 EP 163 5 中描述)。另外，前導(dǎo) 肽可以是合成的前導(dǎo)肽，這就是說(shuō)前導(dǎo)肽不是天然發(fā)現(xiàn)的。合成的前導(dǎo)肽可以按照例如WO 89/0M63或WO 92/11378中的描述構(gòu)建。對(duì)于在絲狀真菌中的使用，所述信號(hào)肽可以方便地來(lái)源于編碼Aspergillus sp.淀粉酶或葡糖淀粉酶的基因，編碼Miizomucor miehei脂酶或蛋白酶，Humicola lanuginosa脂酶的基因。所述信號(hào)肽優(yōu)選地是來(lái)源于編碼米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉中性 α -淀粉酶，黑曲霉酸-穩(wěn)定淀粉酶或黑曲霉葡糖淀粉酶的基因。分別用于連接編碼所述酶的DNA序列、啟動(dòng)子以及可操作的終止子和/或分泌信 號(hào)序列的方法和將它們插入到包含復(fù)制所需信息的合適載體中的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員 已知的(參見(jiàn)，例如，Sambrook等，以上引用的)。宿主細(xì)胞引入到宿主細(xì)胞的編碼所述酶的DNA序列對(duì)所說(shuō)的宿主細(xì)胞而言可以是同源的 或者是異源的。如果對(duì)宿主細(xì)胞是同源的，即由宿主細(xì)胞天然，則其典型地被可操作連接到 另一啟動(dòng)子或者(可用的話)另一分泌信號(hào)序列和/或終止子序列上，而不是在其天然環(huán) 境中。術(shù)語(yǔ)"同源的"旨在包括編碼所說(shuō)宿主細(xì)胞天然酶的cDNA序列。術(shù)語(yǔ)"異源的" 旨在包括所說(shuō)宿主細(xì)胞天然不表達(dá)的DNA序列。這樣，所說(shuō)的DNA序列可以來(lái)源于另一個(gè) 生物體，或者其可以是合成的序列。本發(fā)明的DNA構(gòu)建體或重組載體引入其中的宿主細(xì)胞可以是能夠產(chǎn)生本發(fā)明的 酶的任何細(xì)胞，包括細(xì)菌，酵母，真菌和高等真核細(xì)胞。經(jīng)培養(yǎng)能夠產(chǎn)生本發(fā)明的酶的細(xì)菌宿主細(xì)胞的例子是革蘭氏-陽(yáng)性菌，例如芽胞 桿菌屬的菌株(如枯草芽胞桿菌、地衣形芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪 芽孢桿菌、Bacillus alkalophilus、液解化淀粉桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛 芽孢桿菌、巨大芽胞桿菌或蘇云金芽孢桿菌菌株)或鏈霉菌屬的菌株(例如淺青紫鏈霉菌 或鼠灰鏈霉菌的菌株)，或者革蘭氏-陰性菌，例如大腸桿菌?？梢杂靡阎椒ń?jīng)原生質(zhì)體 轉(zhuǎn)化或者使用感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)菌的轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)Sambrook等，同上)。當(dāng)在細(xì)菌(如大腸桿菌)中表達(dá)酶時(shí)，酶可以被保留在細(xì)胞質(zhì)中(典型地是以被稱作包含體的不溶性顆粒)或由細(xì)菌分泌序列引導(dǎo)到周質(zhì)空間中。在前一種情況下，裂解 細(xì)胞，回收顆粒并變性，此后經(jīng)稀釋變性劑使酶再折疊。在后一種情況下，可以經(jīng)裂解細(xì)胞 從周質(zhì)空間回收所說(shuō)酶，如通過(guò)超聲波或滲透沖擊以釋放周質(zhì)空間的內(nèi)含物并回收酶。合適的酵母細(xì)胞的例子包括 Saccharomyces spp.或 Schizosaccharomyces spp. 的細(xì)胞，啤酒糖酵母或者克魯弗酵母的特定菌株。用于用異源DNA轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞并且從此 產(chǎn)生異源酶的方法在例如 US4，599，311，US 4，931，373，US 4，870，008，5，037，743，和 US 4，845，075(所有這些本文一并參考)中有描述。轉(zhuǎn)化細(xì)胞由通過(guò)選擇性標(biāo)記確定的表型 選擇。所述選擇性標(biāo)記一般是對(duì)藥物的抗性或者在缺少特殊營(yíng)養(yǎng)物(例如亮氨酸)的情況 下的生長(zhǎng)能力。用于酵母的一個(gè)優(yōu)選的載體是US 4，931，373中公開(kāi)的POTl載體。編碼本 發(fā)明的酶的DNA序列可以在信號(hào)序列和可有可無(wú)的前導(dǎo)序列之前，例如如以上所述的。合 適的酵母細(xì)胞的例子是克魯維酵母屬(如乳酸克魯維酵母)、漢遜酵母屬(例如多形漢遜 酵母)或畢赤酵母屬(如巴斯德畢赤酵母)的菌株(參見(jiàn)Gleeson等，遺傳微生物學(xué)雜志 1321986，pp. 34593465 ；US 4，882，279)。其它真菌細(xì)胞的例子是絲狀真菌的細(xì)胞，例如Aspergillus spp. , Neurospora spp.，F(xiàn)usarium spp.或Trichoderma spp.，尤其是米曲霉，構(gòu)巢曲霉，黑曲霉或禾谷鐮孢的 菌株。EP 272 277和EP 230 023中描述了 Aspergillus spp.用于表達(dá)蛋白質(zhì)的用途。尖 鐮孢的轉(zhuǎn)化可以例如按照Malardier等，1989，基因78 :147-156的描述進(jìn)行。當(dāng)絲狀真菌用作宿主細(xì)胞時(shí)，其可以用本發(fā)明的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，通常是將所說(shuō)DNA 構(gòu)建體整合進(jìn)宿主染色體中以獲得重組體宿主細(xì)胞。這一整合一般被認(rèn)為是有利的，因?yàn)?所述DNA構(gòu)建體很可能穩(wěn)定保持在細(xì)胞中?？梢园凑粘Ｒ?guī)方法(如同源或者異源重組)將 所述DNA構(gòu)建體整合進(jìn)染色體中。然后在可以表達(dá)所說(shuō)酶的條件下在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)以上描述的轉(zhuǎn)化或 轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，接著從培養(yǎng)物中回收所形成的酶。用于培養(yǎng)所說(shuō)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任何常規(guī)的適于培養(yǎng)所說(shuō)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基， 例如含有適當(dāng)補(bǔ)充物的最小或復(fù)合培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基可以從供應(yīng)商獲得或者可以按照 出版的(例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心目錄中)配方制備。然后，由所述細(xì)胞產(chǎn)生的酶可 以用常規(guī)方法從培養(yǎng)基回收，所述方法包括經(jīng)離心和過(guò)濾從培養(yǎng)基分離宿主細(xì)胞，借助鹽 (如硫酸銨)沉淀上層清液或?yàn)V液中的蛋白質(zhì)組份，依據(jù)所述酶的類型，用各種色譜分離方 法(如離子交換色譜，凝膠色譜，親合色譜)純化等。另一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生按照本發(fā)明的酶的方法，其中在可以產(chǎn)生所述酶的條 件下培養(yǎng)合適的用編碼酶的DNA序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，并從培養(yǎng)物中回收所形成的酶。用分類學(xué)和生態(tài)學(xué)進(jìn)行的酶篩選設(shè)計(jì)來(lái)檢測(cè)和選擇所說(shuō)類型的興趣酶的象分子篩選之類的強(qiáng)有力的工具其自身 仍不能滿足需要。為了使興趣發(fā)現(xiàn)的機(jī)會(huì)最大，在這一研究中將分子篩選方法與小心選擇 待篩選的真菌組合。通過(guò)全面考慮真菌的鑒別法、分類學(xué)類別和種系發(fā)生關(guān)系進(jìn)行選擇。如果包括生態(tài)學(xué)方法，則可以僅進(jìn)一步地充分探討溶纖酶產(chǎn)生的分類學(xué)熱點(diǎn)。設(shè) 計(jì)聰明的篩選和取得成功的選擇菌株和待研究的生態(tài)小生境需要適應(yīng)各種底物的全面的 知識(shí)(尤其植物材料的腐生、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)或活體營(yíng)養(yǎng)降解)。本文所公開(kāi)的分類學(xué)和生態(tài)學(xué)方法兩者的目標(biāo)都是在分子篩選程序中最多地發(fā)現(xiàn)所述酶。然而，仍然有幾百(或者如果包括了所有初期工作)幾千種真菌被培養(yǎng)，以便檢 測(cè)本文報(bào)道的所說(shuō)類型的溶纖酶的53個(gè)目標(biāo)?？梢园匆韵滤鲞M(jìn)行篩選和克隆材料和方法生物體列表啤酒糖酵母 DSM 9770,DSM 10082,DSM 10080,DSM 10081 或大腸桿菌 DSM 10512、 DSM 1051UDSM 1057UDSM 10576分別含有質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含在穿梭載體pYES 2.0中的編 碼本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶的全長(zhǎng)DNA序列。大腸桿菌DSM 10583、10584、10585、10586、10587 和 10588。棉色二孢Cooke菌株的保藏保藏號(hào)CBS 274. 96分類位置子囊菌門(mén)(Ascomycota)，腔菌綱，座囊菌目，葫蘆霉科Ulospora bilgramii (Hawksw 等)Hawksw 等菌株的保藏號(hào)NKBC 1444，日本大學(xué)，(Prof. Tubaki保藏中心)分類位置子囊菌門(mén)，腔菌綱，座囊菌目，(科未分類)Microsphaeropsis sp.分離自在中國(guó)云南省昆明植物園中生長(zhǎng)的山茶的葉片(茶科，Guttiferales)分類位置子囊菌門(mén)，腔菌綱腔菌綱，座囊菌目，(科未分類)Macrophomina phaseolina(Tassi)Goidannich另Ij名Rhizoctonia bataticola菌株的保藏保藏號(hào)CBS 281. 96分離自在泰國(guó)生長(zhǎng)的Glycine max (Leguminosa) cv CMM 60 的種子，1990分類位置子囊菌門(mén)，盤(pán)菌綱，斑痣盤(pán)菌目，斑痣盤(pán)菌科Rscobolus stictoideus Speg.分離自挪威，Svalbard,鵝糞分類位置子囊菌門(mén)，盤(pán)菌綱，盤(pán)菌目，糞盤(pán)菌科Saccobolus dilutellus(Fuck. )Sacc.菌株的保藏保藏號(hào)CBS 275. 96分類位置子囊菌門(mén)，盤(pán)菌綱，盤(pán)菌目，糞盤(pán)菌科疣孢青霉 Peyronel物種的保藏號(hào)ATCC 62396分類位置子囊菌門(mén)，不整囊菌綱，散囊菌目，發(fā)菌科產(chǎn)黃青霉Hiom菌株的保藏號(hào)ATCC 9480分類位置子囊菌門(mén)，不整囊菌綱，散囊菌目，發(fā)菌科Thermomyces verrucosus Pugh 等菌株的保藏保藏號(hào)CBS 285. 96分類位置子囊菌門(mén)，不整囊菌綱，散囊菌目，(科未分類；affiliation基于 185RNA，測(cè)序以及同源性)
鹿角團(tuán)炭角菌L. ex Greille菌株的保藏保藏號(hào)CBS 284. 96分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes，炭角菌目，炭角菌科點(diǎn)孔座殼(Fr.ex L.) Fr.分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes，炭角菌目，炭角菌科Nodulisporum sp.分離自在中國(guó)云南省昆明植物園中生長(zhǎng)的山茶的葉片(茶科，Guttiferales)分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes，炭角菌目，炭角菌科Cylindrocarpon sp.分離自海上樣品，Bahamas分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes，肉座菌目，(科未分類)Acremonium sp菌株的保藏保藏號(hào)CBS 478. 94分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes，肉座菌目，肉座菌科蛇形鐮孢Shertakoff菌株的保藏號(hào)IF0 4467分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes，肉座菌目，肉座菌科早熟禾鐮孢(Peck) fe.物種的保藏號(hào)ATCC 60883分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes，肉座菌目，肉座菌科腐皮鐮孢(Mart. ) Sacc. emnd. Snyd & Hans.菌株的保藏號(hào)IMI 107. 511分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes，肉座菌目，肉座菌科番尖鐮孢 ssp lycopersici (Sacc. ) Snyd. & Hans.菌株的保藏號(hào)CBS 645. 78分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes，肉座菌目，肉座菌科^cliife ssp passiflora菌株的保藏號(hào)CBS 744. 79分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes，肉座菌目，肉座菌科鏈孢粘帚霉Gillman & Abbott菌株的保藏號(hào)CBS 227. 48分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes，肉座菌目，肉座菌科Nectria pinea Dingley菌株的保藏保藏號(hào)CBS 279. 96分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes，肉座菌目，小赤殼科Volutella colletotrichoides菌株的保藏號(hào)CBS 400. 58分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes，肉座菌目，(科未分類)大孢糞殼 Auerswald
物種的保藏號(hào)ATCC 60255分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes，糞殼目，糞殼科H^IItE (Roberge)Cesati et De Notaris物種的保藏號(hào)ATCC 52644分離自H-Dissing 的糞，ISP，KU，丹麥分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes，糞殼目，糞殼科灰腐質(zhì)霉Traeen物種的保藏號(hào)ATCC 22726JftiJI =Hatfield Polytechnic分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes，糞殼目，(科未分類)黑腐質(zhì)霉Omvik菌株的保藏號(hào)CBS 819. 73分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes，糞殼目，(科未分類)Scytalidium thermophiIum(Cooney et Emerson)Austwick菌株的保藏號(hào)ATCC 28085分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes，糞殼目，(科未分類)Thielavia thermophi la Fergus et Sinden (別名 Corynascusthermophi lus)菌株的保藏號(hào)=CBS174. 70，IMI 145. 136分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes，糞殼目，毛殼科分離自蘑菇堆肥Thielavia terrestris (Appinis)Malloch et Cain菌株的保藏號(hào)NRRL8U6分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes，糞殼目，毛殼科Cladorrhinum foecundissimum Saccardo et Marchal物種的保藏號(hào)ATCC 62373分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes，糞殼目，毛球殼科分離自牙買力口達(dá)拉斯山 Selandin sp (Compositaceae, Asterales)的葉片Syspastospora boninensis菌株的保藏號(hào)NKBC 1515(日本大學(xué)，profe Tubaki保藏中心)分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes,獎(jiǎng)殼目，Cerastomataceae管毛殼Fuckel菌株的保藏號(hào)CBS 799. 83分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes，糞殼目，毛殼科巴西毛殼 Batista et Potual菌株的保藏號(hào)CBS 122. 65分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes，糞殼目，毛殼科墻毛殼 Corda菌株的保藏號(hào)CBS 163. 52分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes，糞殼目，毛殼科
Chaetomium virescens(yon Arx)Udagawa菌株的保藏號(hào)CBS 547. 75分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes，糞殼目，毛殼科Myceliophthora thermophila(Apinis)Oorschot菌株的保藏保藏號(hào)CBS 117. 65分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes，糞殼目，毛殼科Nigrospora sp菌株的保藏保藏號(hào)CBS 272. 96分離自在牙買力口 Christiana 中生長(zhǎng)的 Artocarpus altilis 的葉片，Moraceae, Urticales分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes, Trichosphaeriales,(禾斗未分類)Nigrospora sp分離自云南昆明植物園的Pinus yuannanensis的葉片分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes,假毛球殼目，Abietaceae, Pinales.Diaporthe syngenesia菌株的保藏保藏號(hào)CBS 278. 96分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes，Diaporthales，黑腐皮殼科葫蘆科刺盤(pán)孢(Passerini)Ellis et Halsted別名圍小叢殼orbiculare變種 Jenkinset Winstead物種的保藏號(hào)ATCC 52609分類位置子囊菌門(mén)，Pyrenomycetes，黑痣菌目黑膠耳Fr.菌株的保藏保藏號(hào)CBS 277. 96分類位置擔(dān)子菌門(mén)，層菌綱，木耳目，黑耳科Crinipellis scabella (ALb. Schw. :Fr.)Murr菌株的保藏號(hào)CBS 280. 96分類位置擔(dān)子菌門(mén)，層菌綱，蘑菇目網(wǎng)紋斑褶菇(Fr.)Gill.菌株的保藏號(hào)CBS 275. 47分類位置擔(dān)子菌門(mén)，層菌綱，蘑菇目，鬼傘科木蹄層孔菌(L.) Fr.菌株的保藏保藏號(hào)CBS 276. 96分類位置擔(dān)子菌門(mén)，層菌綱，非褶菌目，！^mitaceaeSpongipellis sp.菌株的保藏保藏號(hào)CBS 283. 96分類位置擔(dān)子菌門(mén)，層菌綱，非褶菌目，煙管菌科(由18S序列和同源性分類學(xué)鑒 別和相聯(lián)系)血紅栓菌(Fr. ) Lloyd別名血紅多孔菌；血紅密孔菌(L. :Fr.)菌株的保藏號(hào)AKU 5062 (京都大學(xué)培養(yǎng)物保藏中心)
分類位置擔(dān)子菌門(mén)，非褶菌目，多孔菌科Schizophyllum commune Fr.物種的保藏號(hào)ATCC 38548分類位置擔(dān)子菌門(mén)，非褶菌目，裂褶菌科紅根囊壺菌(de Bary & Wor)Fischer菌株的保藏號(hào)CBS 282. 96分類位置壺菌門(mén)，壺菌綱，Spizellomycetales, SpizellomycetaceaeRhizomucor pusillus (Lindt) Schipper 另Ij名微小毛霄菌株的保藏號(hào)IF0 4578物種的保藏號(hào)ATCC 46883分類位置接合菌門(mén)，接合菌綱，毛霉目，毛霉科iHjt^lM (Kunze) vanTieghem & Le Monnier菌株的保藏號(hào)IF0 4814物種的保藏號(hào)ATCC 16327分類位置接合菌門(mén)，接合菌綱，毛霉目，毛霉科弗雷生朿Ij枝霉 vanTieghem & Le Monnier 別名.Helicostylum fresenii菌株的保藏號(hào)NRRL 2305分類位置接合菌門(mén)，接合菌綱，毛霉目，rhamnidiaceae未分類的粉紅單端孢菌株的保藏號(hào)IF0 5372Coniothecium sp植物內(nèi)寄生菌，分離自在中國(guó)云南省昆明的未鑒別的高等植物的葉片未分類和未鑒別的菌株的保藏保藏號(hào)CBS 271. 96分離自牙買力口 Christiana 生長(zhǎng) Artocarpus altilis (?？?，Urticales)的葉片菌株的保藏保藏號(hào)CBS 273. 96分離自牙買加達(dá)拉斯山生長(zhǎng)的Pimenta dioica(桃金娘科，Myrtales)的葉片菌株的保藏號(hào)CBS 270. 96分離自牙買加達(dá)拉斯山生長(zhǎng)的Pseudocalymma alliaceum(紫葳科，Solanales) 葉片其它菌株大腸桿菌MC1061 和 DHlOB。酵母菌株所使用的啤酒糖酵母菌株是W3124(MATa ；ura 3-52 ；leu2_3，112 ；his 3-D200；pep 4-1137 ；prcl :HIS3 ；prbl :LEU2 ；cir+)。質(zhì)粒曲霉屬表達(dá)載體pHD414是質(zhì)粒p775 (在EP 238023中描述)的衍生物。pHD414 的構(gòu)建在WO 93/11249中有進(jìn)一步的描述。ρYES 2. O(Invitrogen)。
pA2C477, pA2C193, pA2C357, pA2C371，pA2C385, pA2C475, pA2C488, pA2C502 (參見(jiàn) 實(shí)施例1、2、3和4)。分別在SEQ ID NO :1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列的分離通過(guò)用本領(lǐng)域已知的方法(Sambrook等(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港 實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約)經(jīng)抽提質(zhì)粒，可以分別從保藏的生物體啤酒糖酵母DSM 9770、DSM 10082、DSM 10080、DSM 10081、大腸桿菌 DSM 10512、DSM 10511、DSM 10571 或 DSM 10576 獲得全長(zhǎng)DNA序列，這些全長(zhǎng)DNA序列包含分別在SEQ ID NO :1、4、6、8、10、12、16或19中 所示的編碼本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶的cDNA序列。分子篩選本發(fā)明的纖維素酶的PCR引物四個(gè)簡(jiǎn)并的含脫氧肌苷的寡核苷酸引物(有義；s和反義；asl、as2和as3)相應(yīng) 于四個(gè)高度保守氨基酸區(qū)，這些區(qū)在Thielavia terrestris纖維素酶、Myceliophthora thermophiIum纖維素酶和兩種來(lái)源于Acremonium sp.的纖維素酶的推定的氨基酸序列中 發(fā)現(xiàn)，按照Myceliophthora thermophilum序列對(duì)殘基編號(hào)。在引物序列中脫氧肌苷由I 表示，限制位點(diǎn)上有下劃線。2735NH2 -Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro/Thr-C00Hs 5' -CCCCAAGCTT ACI AGI TAC TGG GAC TGC TGC AAA AC-3'HindIIICTTTTGC106111NH2 -Trp Cys Cys Ala Cys Tyr-COOHasl 3' -CC ACA ACA CGI ACA AT AGATCTGATC-5’GGGXbaI145152NH2 -Pro Gly Gly Gly Leu/Val Gly Ile/Leu Phe-COOHas2 3' -GGI CCI CCI CCI AAI CCI AAI AA AGATCTGATC-5’CGXbaIGT193198NH2 -Trp Arg Phe/Tyr Asp Trp Phe-COOHas3 3' -CC GCI AAA CTA ACC AAA AGATCTGATC-5’T TG GG XbaI經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行分子篩選
基因組DNA和雙鏈cDNA的體外擴(kuò)增按照以下描述從5微克poly (A)+RNA定向合成雙鏈cDNA。按照hlton等的描述 分離基因組DNA。在PCR緩沖液中經(jīng)PCR擴(kuò)增約10至20ng雙鏈纖維素酶-誘導(dǎo)的cDNA或100至 200ng選擇的真菌菌株的基因組DNA，所說(shuō)緩沖液(IOmMTris-HCl (pH8. 3)、50mM KC1、1. 5mM MgCl2^O. 01% (w/v)明膠)包含200μΜ各dNTP和IOOpmol按以下組合的各簡(jiǎn)并引物:1)
28
有義，5，-CCCCAAGCTTACIa/cGITA7tTGGGA7tTGc/tTGc/tAAa/ga/cC-3，反義1，5，-CTAGTCTAGATAa/gCAIGCa/gCAa/gCACC_3，；或2)有義，，-CCCCAAGCTTACIa/cGITA7tTGGGA7tTGc/tTGc/tAAa/ga/cC-3，反義2，CTAGTCTAGAAAIAa/g/tICCIAa/c/gICCICCICCIGG-3，；或3)有義，5，-CCCCAAGCTTACIa/cGITA7tTGGGA7tTGc/tTGc/tAAa/ga/cC-3，反義3，5，CTAGTCTAGAIAACCAa/gTCAa/gA/tAIC7tCC _3 ；一種 DNA 熱循環(huán)儀(Landgraf，德國(guó))和 2. 5 單位 Taq 聚合酶(Perkin-Elmer， Cetus,US)。采用以下循環(huán)方式進(jìn)行PCR的三十個(gè)循環(huán)在94°C變性1分鐘，64°C退火2分 鐘，72°C延伸3分鐘。以HaeIII-消化的(tX174RF DNA為大小標(biāo)記，通過(guò)在3%瓊脂糖凝膠 (NuSieve, FMC)中的電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物的10微升等分試樣。PCR產(chǎn)物的直接測(cè)序按照制造商的說(shuō)明使用QIAquick PCR純化試劑盒Oliagen，US)純化PCR產(chǎn)物的 80微升等分試樣。經(jīng)雙脫氧鏈-終止方法，使用50-150ng模板，Taq尾端脫氧循環(huán)測(cè)序試 劑盒(Perkin-Elmer，USA)，熒光標(biāo)記的終止劑，和5pmol有義引物5' -CCCCAAGCTTAClV cgita7ttggga7ttg7ttg7taaa/ga/cc-3‘直接在純化的pcr產(chǎn)物上測(cè)定擴(kuò)增的pcr片段的核 苷酸序列。按照Devereux等的描述對(duì)序列數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)克隆PCR 片段的亞克隆將如以上所述所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物25微升等分試樣在0. 8 %低膠凝溫度瓊脂糖 (SeaPlaque GTG,FMC)凝膠上進(jìn)行電泳，從凝膠上切下相關(guān)的片段。通過(guò)添加0. 1體積IOX 瓊脂糖酶緩沖液(New England Biolabs)和2單位/100微升熔化的瓊脂糖到樣品中，接著 在45°C溫育1. 5小時(shí)，經(jīng)瓊脂糖酶處理回收。用酚和三氯甲烷抽提樣品，經(jīng)添加2體積96% KOH和0. 1體積3M NaAc (pH5. 2)沉淀。經(jīng)離心回收PCR片段，在70 % EtOH中洗滌，干燥 和再懸浮于 20 微升限制酶緩沖液(IOmM Tris-HCl, IOmM MgCl2, 5OmMNaCl, ImM DTT)中。 以HindIII和XbaI消化片段，用酚和三氯甲烷提取，經(jīng)2體積96% EtOH和2體積NaAc (pH 5.2)沉淀回收，并亞克隆進(jìn)HindIIIAbaI-切割的pYES 2.0載體中。篩選cDNA文庫(kù)和陽(yáng)性克隆的特征確定。以相應(yīng)的隨機(jī)引導(dǎo)的(Feinberg和 VogelsteirO32P-標(biāo)記的(> 1 X IOcpm/微克)PCR產(chǎn)物作為探針，經(jīng)菌落雜交(Sambrook， 1989)篩選按以下所說(shuō)構(gòu)建的啤酒糖酵母和大腸桿菌的cDNA文庫(kù)。于65 °C在h SSC (Sambrook，1989)、5x Denhardt ‘ s 溶液(Sambrook，1989)、0· 5 % (w/v) SDSUOOy g/ ml變性鮭精DNA中進(jìn)行雜交20小時(shí)，接著于251在切SSC(2x 15分鐘)中、于651在& SSC、0. 5% SDS(30 分鐘)中、于 65°C在 0. h SSC、0. 5 % SDS (30 分鐘)，最后于 251在切SSC(2x 15分鐘)中洗滌。采用以下方法確定陽(yáng)性cDNA克隆的特征，所述方法是用pYES 2.0多接頭引物(Invitrogen，USA)測(cè)序cDNA插入物的末端，用雙脫氧鏈終止法(Sanger 等)采用熒光標(biāo)記的終止劑測(cè)定兩條鏈的最長(zhǎng)cDNA的核苷酸序列。按照制造商的說(shuō)明，采 用應(yīng)用生物系統(tǒng)373A自動(dòng)測(cè)序儀，用Taq脫氧末端循環(huán)測(cè)序試劑盒(Perkin Elmer USA) 和pYES 2.0多接頭引物(Invitrogen，USA)或合成寡核苷酸引物測(cè)序Qiagen純化的質(zhì)粒 DNA (Qiagen USA)。按照Devereux等描述的方法進(jìn)行序列數(shù)據(jù)分析。用硫氰酸胍進(jìn)行總RNA的抽提，接著經(jīng)5. 7M CsCl墊層超離心法，采用WO 94/14953中描述的方法經(jīng)寡(dT)-纖維素親合色譜法進(jìn)行poly (A)+RNA的分離。cDNA 合成采用 RNase H 方法(Gubler 和 Hoffman (1983)基因 25 263-269, Sambrook等(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，NY)用 F. S. Hagen (pers. comm.)開(kāi)發(fā)的發(fā)夾修飾從5微克poly (A) +RNA合成雙鏈cDNA。在預(yù)硅烷 化的無(wú)核糖核酸酶的Eppendorph試管中于70°C加熱poly (A)+RNA (在5 μ 1 DEPC處理的 水中的5 μ g) 8分鐘，在冰上驟冷，添加逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液至終體積50微升，所述逆轉(zhuǎn)錄酶緩 沖液(50mM Tris-Cl (pH8. 3)、75mM KCl、3mM MgCl2, IOmM DTT，Bethesda 研究實(shí)驗(yàn)室)包含 ImM dATP、dGTP 和 dTTP ；0. 5mM 5'-甲基-dCTP (Pharmacia) ；40 單位人類胎盤(pán)核糖核酸 酶抑制劑(RNasin，Promega) ； 1. 45 微克 oligo (dT) 18_Not I 引物(Pharmacia)以及 1000 單 位superscript II核糖核酸酶H逆轉(zhuǎn)錄酶(Bethesda研究實(shí)驗(yàn)室)。通過(guò)在45°C溫育反 應(yīng)混合物1小時(shí)合成第一鏈cDNA。在合成之后，將mRNA :cDNA雜交混合物按照制造者的說(shuō) 明經(jīng) MicroSpin S-400HR(Pharmacia)旋轉(zhuǎn)柱凝膠過(guò)濾。在凝膠過(guò)濾之后，將雜交體用第二鏈緩沖液稀釋，所述緩沖液 (20mMTris-HCl (pH7. 4) ,90mM KCl、4.6mM MgCl2UOmM (NH4) 2S04、0. 16mM(NAD+)包含 200 μ M 各種dNTP、60單位大腸桿菌DNA聚合酶I (Pharmacia)、5. 25單位核糖核酸酶H(Promega) 和15單位大腸桿菌DNA連接酶(Boehringer曼海姆)。通過(guò)在16°C下溫育反應(yīng)試管2小 時(shí)和在25°C下溫育15分鐘進(jìn)行第二鏈cDNA合成。由添加乙二胺四乙酸至最終濃度20mM 終止反應(yīng)，其后用酚和三氯甲烷抽提。Mung大豆核酸酶處理通過(guò)于_20°C下添加2體積的96% EtOH.O. 2體積的IOM NH4Ac沉淀雙鏈cDNA 12小時(shí)，離心回收，用70% EtOH洗滌，干燥并再懸浮于30微升Mung 大豆核酸酶緩沖液中，該緩沖液(30mM NaAc(pH4. 6)、300mM NaCl, ImM ZnSO4,0. 35mM DTT, 2%甘油)包含25單位Mung大豆核酸酶(Pharmacia)。通過(guò)在30°C溫育反應(yīng)物30分鐘，接 著添加70微升IOmM Tris-HCl (pH7. 5)、ImM乙二胺四乙酸，苯酚抽提以及在冰上用2體積 96%乙醇和0. 1體積3M NaAc (pH 5. 2)沉淀來(lái)剪切單鏈發(fā)夾DNA。用T4DNA聚合酶鈍化末 端離心回收雙鏈cDNA，在30微升含0. 5mM各種dNTP和5單位T4DNA聚合酶(New England Biolabs)的T4 DNA聚合酶緩沖液中16°C溫育1小時(shí)，使末端鈍化。加入EDTA至終濃度 20mM,然后用苯酚和氯仿提取，加入2體積96% EtOH和0. 1體積3M NaAc (pH5. 2)于-20°C 沉淀12小時(shí)。銜接子連接，Not I消化和大小選擇在填充反應(yīng)完成后，經(jīng)離心回收cDNA，用 70% KOH洗滌并干燥。將cDNA沉淀重懸于25微升連接緩沖液中，所述緩沖液(30mM Tris-HCl (pH7. 8) UOmM MgCl2UOmM DTT、0. 5mMATP)包含 2. 5 微克非回文 BstXI 銜接子 (Invitrogen)和30單位T4連接酶(Promega)，在16°C溫育12小時(shí)。通過(guò)在65°C加熱20分鐘然后在冰上冷卻終止反應(yīng)。連接的cDNA用Not I限制酶消化，其是通過(guò)添加20微升 水，5 微升 IOXNotI 限制酶緩沖液(New England Biolabs)和 50 單位 Not I (NewEngland Biolabs)，接著在37°C溫育2. 5小時(shí)進(jìn)行的。65°C加熱10分鐘終止反應(yīng)。經(jīng)凝膠電泳在 IXTBE中的0. 8% SeaPlaque GTP低熔化溫度瓊脂糖凝膠(FMC)上大小分級(jí)分離cDNA， 以分離未連接的銜接子和小的cDNA。按照制造者的說(shuō)明，由切下0.71Λ并用β-瓊脂糖 酶(New EnglandBiolabs)從凝膠救援出，并且于_20°C添加2體積96% EtOH和0. 1體積 3MNaAc(pH5. 2)沉淀12小時(shí)來(lái)進(jìn)行cDNA的大小選擇。文庫(kù)的構(gòu)建通過(guò)離心回收定向的、選擇了大小的cDNA，在70% EtOH中洗滌，干 燥并懸浮在30μ 1的IOmM TriS-HCKpH 7. 5), ImM EDTA中。按照制造廠商的說(shuō)明通過(guò) MicroSpin S-300HR(Pharmacia)旋轉(zhuǎn)柱進(jìn)行凝膠過(guò)濾使cDNA脫鹽。在10 μ 1包含5 μ 1雙 鏈cDNA (反應(yīng)試管#1和#2)、15單位的T4連接酶(!Iomega)以及30ng (試管#1)、40ng (試 管#2)和40ng (試管#3，載體背景對(duì)照)的BstXI-NotI裂解的pYES 2. 0載體的連接緩沖 液(30mOTris-HCl(pH7.8)、10mM MgCl2UOmM DTT、0. 5mM ATP)中進(jìn)行三種試驗(yàn)連接。通過(guò) 在16°C下溫育12小時(shí)、在70°C下加熱20分鐘、然后向每個(gè)試管添加10 μ 1的水進(jìn)行連接反 應(yīng)。如上所述把1μ 1的每種連接混合物電穿孔進(jìn)40 μ 1電感受態(tài)的(electrocompetent) 大腸桿菌DH10B細(xì)胞(Bethesda研究實(shí)驗(yàn)室)中(Sambrook等，(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn) 室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，NY)。使用最優(yōu)條件在包含庫(kù)的大腸桿菌中建立文庫(kù)。各 庫(kù)通過(guò)在LB+氨芐青霉屬素瓊脂平板涂布轉(zhuǎn)化的大腸桿菌并在37°C下培養(yǎng)M小時(shí)產(chǎn)生 15000-30000克隆/平板制作。把20ml LB+氨芐青霉素添加到平板上并懸浮細(xì)胞。使細(xì)胞 懸浮液于37°C下在50ml試管中振蕩1小時(shí)。使用QIAGEN質(zhì)粒試劑盒按照按照制造廠商的 說(shuō)明從細(xì)胞分離質(zhì)粒DNA并在-20°C下保存。把得自各個(gè)庫(kù)的1 μ 1純化質(zhì)粒DNA(100ng/ μ 1)的等分試樣通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化進(jìn)啤 酒糖酵母W31M中(Becker和Guarante (1991)酶學(xué)方法，194 :182-187)，把轉(zhuǎn)化體平板接 種于包含2%葡萄糖的SC瓊脂上并在30°C下培養(yǎng)。陽(yáng)性菌落的鑒別在生長(zhǎng)3-5天之后，把瓊脂平板復(fù)制接種于一組包含0. 1%AZCL HE纖維素的SC+半乳糖-尿嘧啶瓊脂平板上。將這些平板在30°C下培養(yǎng)3-7天。內(nèi)切葡 聚糖酶陽(yáng)性菌落鑒定為藍(lán)環(huán)圍繞的菌落。為了在瓊脂上分離單個(gè)菌落，涂布得自酶-陽(yáng)性菌落的細(xì)胞，為了鑒別產(chǎn)生內(nèi)切 葡聚糖酶的菌落，選擇產(chǎn)生酶的單個(gè)菌落。陽(yáng)性克隆的鑒定陽(yáng)性克隆作為單個(gè)菌落獲得，使用生物素化的多接頭引物直接 從酵母菌落擴(kuò)增cDNA插入片段，通過(guò)磁性小珠(Dynabead M-280, Dynal)系統(tǒng)純化，并通過(guò) 使用鏈-末端方法(Sanger等(1977)美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)，74 =5463-5467)和kquenase系統(tǒng) (美國(guó)生物化學(xué))測(cè)定每個(gè)cDNA克隆的5'-末端序列單個(gè)地確定其特征。使用熒光標(biāo)記的終止子通過(guò)雙脫氧鏈終止方法(Sanger等)測(cè)定得自兩條鏈的 最長(zhǎng)cDNA的核苷酸序列。通過(guò)如下所述轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌救援(rescue)質(zhì)粒DNA。使用 Applied Biosystems 373A自動(dòng)測(cè)序儀按照制造廠商的說(shuō)明用Taq脫氧末端循環(huán)測(cè)序試劑 盒(Perkin Elmer, US)和pYES 2. 0多接頭引物(Invitrogen，USA)或合成的寡核苷酸引 物測(cè)定Qiagen純化的質(zhì)粒DNA (Qiagen，USA)的序列。序列數(shù)據(jù)的分析按照Devereux等進(jìn) 行。
在曲霉中表達(dá)的cDNA基因的分離把產(chǎn)生內(nèi)切葡聚糖酶的酵母菌落接種于在 50ml玻璃試管中的20ml YPD培養(yǎng)液中。試管在30°C下振蕩2天。通過(guò)在3000rpm下離心 10分鐘收獲細(xì)胞。按照WO 94/14953分離DNA并將其溶解在50 μ 1水中。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法把DNA轉(zhuǎn)化 進(jìn)大腸桿菌。使用標(biāo)準(zhǔn)方法從大腸桿菌分離質(zhì)粒DNA并通過(guò)限制酶分析進(jìn)行分析。使用適 當(dāng)?shù)南拗泼盖谐齝DNA插入片段并連接進(jìn)曲霉表達(dá)載體中。米曲霉或黑曲霉的轉(zhuǎn)化如WO 95/02043的16頁(yè)，21行-17頁(yè)，12行(本文一并參考)所述制備原生質(zhì)體。把100 μ 1的原生質(zhì)體懸浮液和5-25 μ g在10 μ 1 STC (1. 2Μ山梨醇， IOmMTris-HCl, pH = 7. 5, IOmMCaCl2)中的適當(dāng)DNA混合。將原生質(zhì)體與p3SR2 (攜帶 A. nidulans amdS基因的質(zhì)粒)混合?；旌衔镌谑覝叵路胖?5分鐘。添加0. 2ml 60% PEG 4000 (BDH 29576) UOmM CaCl2UOmM Tris-HCl (pH 7.5)并小心地混合(兩次)，最后添加 0. 85ml的相同溶液并小心地混合?；旌衔镌谑覝叵路胖?5分鐘，在2500g下旋轉(zhuǎn)15分鐘， 把沉淀懸浮在2ml的1. 2M山梨醇中。在再次沉淀之后把原生質(zhì)體涂布在最小的包含1. OM 蔗糖(pH 7.0)，IOmM乙酰胺作為氮源以及20mM CsCl以抑制背景生長(zhǎng)的平板上Wove，生 物化學(xué)學(xué)報(bào)，113(1966)51-56)。于37°C下培養(yǎng)4_7天之后，選擇孢子并涂布以形成單個(gè)菌 落。重復(fù)該過(guò)程，保存第二次再分離之后的單個(gè)菌落的孢子作為所定義的轉(zhuǎn)化體。米曲霉轉(zhuǎn)化體的試驗(yàn)把每個(gè)轉(zhuǎn)化體接種在IOml的YPM中并繁殖。在于37°C下接種2_5天之后，除去 IOml的上清液。如上所述通過(guò)AZCL HE纖維素鑒別內(nèi)切葡聚糖酶活性。用于評(píng)價(jià)本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的性質(zhì)ii)的雜交條件測(cè)定核苷酸探針和同源DNA或RNA序列之間的雜交的合適條件包括在 5XSSC(標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽)中預(yù)浸漬包含待雜交DNA片段或RNA的濾膜10分鐘，濾膜在 5XSSC(Sambrook 等 1989)、5XDenhardt ‘ s 溶液(Sambrook 等 1989)、0· 5 % SDS 和 100 μ g/ml變性的聲處理的鮭精DNA (Sambrook等1989)中預(yù)雜交，然后在包含隨機(jī)引物的 (Feinberg,A. P.和 Vogelstein，B. (1983)生物化學(xué)年評(píng)，132 :6-13)、32P_dCTP-標(biāo)記的(比 活> lX109cpm/y g)的探針的相同溶液中于約45°C下雜交12小時(shí)。然后濾膜在2XSSC、 0. 5% SDS中洗滌兩次30分鐘，溫度優(yōu)選地不高于50°C，更優(yōu)選地不高于55°C，更優(yōu)選地是 不高于60°C，更優(yōu)選地是不高于70°C，尤其是不高于75°C。用于雜交的核苷酸探針是對(duì)應(yīng) 于分別在SEQ ID NO :1、4、6、8，、10、12或16中所示的DNA序列和/或分別可以從在啤酒糖 酵母 DSM 9770、DSM 10082、DSM 10080、DSM 10081，大腸桿菌 DSM 10512、DSM 10511、DSM 10571或DSM 10576中的質(zhì)粒獲得的DNA序列的內(nèi)切葡聚糖酶編碼部分的DNA序列。免疫交叉反應(yīng)用于測(cè)定免疫交叉反應(yīng)的抗體可以通過(guò)使用純化的纖維素酶制 備。更具體地說(shuō)，抗本發(fā)明的纖維素酶的抗血清可通過(guò)按照N. Axelsen在“定量免疫電 泳手冊(cè)”，Blackwell科學(xué)出版社，1973，23章中或A. Johns tone和R. Thorpe,實(shí)踐免疫 化學(xué)，Blackwell科學(xué)出版社，1982(更具體地說(shuō)在27-31頁(yè))中描述的方法制備。純 化的免疫球蛋白可從抗血清獲得，如通過(guò)鹽沉淀((NH4)2SO4)并進(jìn)行滲析和離子交換色 譜(如在DEAE-kphadex上)。蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)定性可通過(guò)Outcherlony雙擴(kuò)散分析 (0. Ouchteriony 試驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)(D. M. Weir, Ed.)，Blackwell 科學(xué)出版社，1967，655-706
32頁(yè))、交叉免疫電泳(N. Axelsen等，同上，第3和4章)或火箭免疫電泳(N. Axelsen等，第 2章)完成。培養(yǎng)基YPD IOg酵母提取物，20g蛋白胨，加H2O至900ml。高壓滅菌，添加IOOml 20%的
葡萄糖(無(wú)菌過(guò)濾的)。YPD IOg酵母提取物，20g蛋白胨，加H2O至900ml。高壓滅菌，添加IOOml 20%的
麥芽糖糊精(無(wú)菌過(guò)濾的)。IOX 堿鹽(basel salt) :75g酵母氮堿(nitrogen base)，113g琥珀酸，68g NaOH, 加吐0至1000ml，無(wú)菌過(guò)濾。SC-URA :100ml IOX堿鹽，28ml無(wú)維生素的20%酪蛋氨基酸，IOml 的色氨酸， 加H2O至900ml，高壓滅菌，添加3.6ml 5%蘇氨酸以及IOOml 20%葡萄糖或20%半乳糖。SC-URA 瓊脂SC_URA，添加 20g/l 瓊脂。PD瓊脂39g馬鈴薯右旋糖瓊脂，DIFCO 0013 ；添加去離子水至IOOOml ；高壓滅菌 (121°C 下 15-20 分鐘)。PC瓊脂馬鈴薯和胡蘿卜(研磨，每種20g)，添加水至1000ml，煮沸1小時(shí)；瓊脂 (20g/l Merck 1614)；高壓滅菌(121°C下 20 分鐘)。PC液態(tài)培養(yǎng)基如PC瓊脂，但沒(méi)有瓊脂。PD液態(tài)培養(yǎng)基24g馬鈴薯右旋糖培養(yǎng)液，Difco 0M9，添加去離子水至IOOOml ； 高壓滅菌(121°C下15-20分鐘)。具有纖維素的PC和PD液態(tài)培養(yǎng)基每IOOOml添加30g Solcafloc (Dicacel可從 Dicalite-Europe-Nord, 9000Gent,比利時(shí)獲得)。PB-9 液態(tài)培養(yǎng)基把 12g Rofec (Roquette 101-0441)和 24g 葡萄糖添加至 IOOOml 水中；PH值調(diào)整到5. 5 ；每IOOOml添加5ml礦物油和5gCaC03。高壓滅菌(121°C下40分 鐘)。YPG 液態(tài)培養(yǎng)基4g 酵母提取物(Difco 0127)，IgKH2PO4 (Merck4873), 0. 5g MgSO4 · 7H20 Merck 5886，15g 右旋糖，Roquettel01-0441，0. Iml Pluronic (101-3088)；添 加去離子水至1000ml ；高壓滅菌(121°C下20分鐘)稀釋鹽溶液(此)制備兩種母液P-母液13. 61g KH2PO4 ；13. 21 g (NH4) 2P04，17. 42g KH2PO4 ；添加去離子水至 100ml。Ca/Mg 母液7. 35g CaCl2 · 2H20,10. 17g MgCl2 · 6H20，添加去離子水至 IOOml ；把 PH值調(diào)整至7. 0 ；高壓滅菌(121°C ；20分鐘)把0. . 5mlP-母液和0. Iml Ca/Mg母液混合添加去離子水至IOOOmlAZCL HE 纖維素(Megazyme，澳大利亞)。用途在洗滌和穿著過(guò)程中，染色的織物或衣物的染料通常滲色，從而使衣物看起來(lái)已 褪色和穿舊。從織物表面除去纖維將部分地恢復(fù)織物初始的顏色和外觀。本文所使用的術(shù) 語(yǔ)“顏色澄清”是指通過(guò)多次洗滌循環(huán)織物或衣物的初始顏色部分地恢復(fù)。術(shù)語(yǔ)“除去丸狀物”指從織物表面除去丸狀物。
術(shù)語(yǔ)“浸泡液體”指這樣的一種含水的液體，要洗的衣物在進(jìn)行常規(guī)洗滌過(guò)程前要 浸泡在其中。浸泡液體可包含一種或多種通常用于洗滌或洗滌方法的組分。術(shù)語(yǔ)“洗液”指這樣的一種含水的液體，在其中要洗的衣物進(jìn)行洗滌過(guò)程，即通常 是一種手工或在洗衣機(jī)中的化學(xué)或機(jī)械結(jié)合的作用。通常，洗液是粉劑或液體洗滌劑組合 物的水溶液。術(shù)語(yǔ)“沖洗液體”指這樣的一種含水的液體，為了沖洗要洗的衣物，即實(shí)質(zhì)上從要 洗的衣物中除去洗滌劑溶液，在其中浸泡并處理要洗的衣物，通常是在洗滌過(guò)程之后立即 進(jìn)行。沖洗液體可包含織物條理或軟化組合物。按照本發(fā)明的方法要洗的衣物可以是常規(guī)的可洗的衣物。優(yōu)選地，要洗的衣物的 主要部分是縫合或未縫合的織物，包括從棉制造的編織物(knits)、編織物(wovens)、斜紋 粗棉布、紗線和毛巾、棉混紡物或天然或人造纖維素(如制自包含木聚糖的纖維素織物，如 制自木漿)或其混合物?；旌衔锏睦邮蔷哂幸环N或多種輔助材料的棉或人造纖維/纖維 膠(如羊毛、合成纖維(如聚酰胺纖維、丙烯酸纖維、聚酯纖維、聚乙烯醇纖維、聚氯乙烯纖 維、聚偏二氯乙烯纖維、聚氨甲酸乙酯纖維、聚脲纖維、aramid纖維)以及包含纖維素的纖 維(如人造纖維/纖維膠、苧麻、亞麻/亞麻布、黃麻、乙酸纖維素纖維、lyocell)。洗滌劑組合物按照本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶可典型地是洗滌劑組合物的組 分。同樣地，它們可以以非塵狀粒劑、穩(wěn)定液體或受保護(hù)的酶形式包括在洗滌劑組合物中。 非塵狀粒劑可按照，如在US 4，106，991和4，661，452所(二者都屬于Novo Industri A/S) 公開(kāi)的方法產(chǎn)生并可有可無(wú)地按照本領(lǐng)域的方法包衣。蠟狀的表面蓋覆劑的例子是平均分 子量為1000至20000的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)物(聚乙二醇，PEG)；具有16至50個(gè)環(huán)氧乙烷 單位的乙氧基化的壬基酚；乙氧基化的脂肪醇(其中醇包含12至20個(gè)碳原子，具有15至 80個(gè)環(huán)氧乙烷單位)；脂肪醇；脂肪酸；脂肪酸的甘油單、雙和三酸酯。在專利GB 1483591 中給出了通過(guò)流化床技術(shù)制成的適于應(yīng)用的形成薄片的表面蓋覆劑的例子。如液態(tài)酶制劑 可按照已制定的方法通過(guò)添加多羥基化合物(如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸)穩(wěn)定。其 它酶穩(wěn)定劑在本領(lǐng)域中是已知的。受保護(hù)的酶按照在EP 238，216中公開(kāi)的方法制備。本發(fā)明的洗滌劑組合物可以是任何方便的形式，如粉劑、粒劑、糊劑或液體。液體 洗滌劑可是水溶液，典型地包含多達(dá)70%的水和0-30%的有機(jī)溶劑，或非水溶液。洗滌劑組合物包含一種或多種表面活性劑，每種活化劑可以是陰離子、非離子、 陽(yáng)離子或兩性離子的。洗滌劑通常包含0-50%陰離子表面活性劑，如線性烷基苯磺酸鹽 (LAS)、α -烯烴磺酸鹽(AOS)、烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸酯)(AQ、脂肪醇乙氧基硫酸鹽 (AE0S或AEQ、仲烷烴磺酸鹽(SAQ、α -硫代脂肪酸甲基酯、烷基或烯基琥珀酸或皂。它可 以包含0-40%的非離子表面活性劑，如脂肪醇乙氧基化物(ΑΕ0或AE)、羧化的脂肪醇乙氧 基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基聚苷、烷基二甲胺氧化物、乙氧基化的脂肪酸單乙醇酰胺、 脂肪酸單乙醇酰胺或聚羥烷脂肪酸酰胺(如如在WO 92/061Μ中所描述的)。洗滌劑組合物還可包含一種或多種其它酶，如淀粉酶、脂酶、角質(zhì)酶、蛋白酶、過(guò)氧 化物酶和氧化酶，如漆酶。洗滌劑可包含1-65%洗滌劑助洗劑或配位劑，如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、膦酸 酯、檸檬酸鹽、次氨基三乙酸(NTA)、乙二氨四乙酸(EDTA)、二乙三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽或?qū)庸杷猁}(如得自Hoechst的SKS-6)。洗滌劑也可無(wú)助洗 劑，即實(shí)質(zhì)上不含洗滌劑助洗劑。洗滌劑可包含一種或多種聚合物。例子是羧甲基纖維素(CMC)、聚(乙烯吡咯烷 酮)(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚羧酸酯，如聚丙烯酸酯、馬來(lái)酸/丙烯酸 共聚物和甲基丙烯酸月桂基酯/丙烯酸共聚物。洗滌劑可包含漂白系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含H2O2源，如與形成過(guò)酸的漂白活化劑(如四乙 基乙二胺(TAED)或壬酰氧苯磺酸鹽(NOBQ)結(jié)合的過(guò)硼酸鹽或過(guò)碳酸鹽。另外，漂白系統(tǒng) 可包含過(guò)酸，如酰胺、酰亞胺或砜型。本發(fā)明的洗滌劑組合物的酶可以使用常規(guī)的穩(wěn)定劑穩(wěn)定，如多羥基化合物(如丙 二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，如芳族硼酸酯，組合物可按照在如WO 92/19708和WO 92/19709中所述制成制劑。洗滌劑也可包含其它常規(guī)的洗滌劑組份，如織物調(diào)理劑，包括粘土、泡沫輔助劑、 抑泡劑、抗腐蝕劑、污物懸浮劑、抗污物再沉積劑、染料、殺菌劑、熒光增白劑或香料。pH(于使用濃度下在水溶液中測(cè)量)通常是中性或堿性的，如在7-11的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的范圍之內(nèi)洗滌劑組合物的具體形式包括1) 一種制成粒劑的具有至少600g/l的堆密度的洗滌劑組合物，該組合物包含
3權(quán)利要求
1.一種顯示內(nèi)切葡聚糖酶活性的酶，該酶a)具有SEQID NO. 9所示的氨基酸序列；b)與SEQID NO. 9所示氨基酸序列有至少90%的等同性c)通過(guò)對(duì)SEQID NO. 9所示氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代，缺失或添加而 獲得的氨基酸序列；或d)在于5X SSC中45°C下雜交和于2X SSC中70°C下洗滌的條件下，與下列序列雜交的 核酸序列所編碼的多肽i)SEQID NO 8中所示的DNA序列，ii)從啤酒糖酵母DSM10081中的質(zhì)粒獲得的DNA序列，或iii)所述i)或ii)的序列的互補(bǔ)鏈。
2.權(quán)利要求1所述的酶，其中該酶由SEQID NO. 9所示的氨基酸序列組成，或由SEQ ID NO. 9所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代，缺失或添加而獲得的氨基酸序列 組成。
3.權(quán)利要求1或2所述的酶，其中該酶得自Thielaviaterrestris的菌株。
4.一種編碼權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的酶的DNA序列。
5.一種DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含權(quán)利要求4所述的DNA序列。
6.一種重組表達(dá)載體，該載體包含權(quán)利要求5所述的DNA構(gòu)建體。
7.一種細(xì)胞，該細(xì)胞包含權(quán)利要求5所述的DNA構(gòu)建體或權(quán)利要求6的重組表達(dá)載體。
8.一種用于制備權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的酶的方法，該方法包括在可以產(chǎn)生所述酶 的條件下，培養(yǎng)按照權(quán)利要求7所述的細(xì)胞，并從培養(yǎng)物中回收所述的酶。
9.一種使要洗的衣物顏色澄清的方法，該方法包括用包含權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的 酶的制劑的浸泡、洗滌或沖洗液體處理要洗的衣物。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所說(shuō)的內(nèi)切葡聚糖酶在機(jī)器循環(huán)使用條件下，以每升液體 1到1000S-CEVU的有效量存在于浸泡、洗滌或沖洗液體中。
11.一種洗衣組合物，該組合物包含用權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述酶的制劑，以及選自表 面活性劑、助洗劑化合物和織物軟化劑的化合物。
12.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的酶在降解或修飾植物材料上的用途。
13.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的酶在處理織物原料或織物中的用途。
14.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的酶在處理紙漿中的用途。
全文摘要
一種在洗滌劑，洗滌，紡織和造紙紙漿應(yīng)用中性能良好的酶制劑，該制劑實(shí)質(zhì)上由具有溶纖活性的酶組成，所述酶包含具有序列Thr Arg X3 X4 AspCys Cys X8 X9 X10 Cys X12 Trp X14(其中X3和X4各自分別是Trp、Tyr或Phe；X8是Arg、Lys或His；X9、X10、X12和X13各自是20個(gè)天然氨基酸殘基中的任何一個(gè))的14個(gè)殘基的第一氨基酸序列和具有序列TrpCys Cys XX4 Cys(其中XX4是20個(gè)天然氨基酸殘基中的任何一個(gè))的5個(gè)殘基的第二氨基酸序列，其條件是在第一氨基酸序列中，(i)當(dāng)X12是Ser時(shí)，X14不是Ser，和(ii)當(dāng)X12是Gly時(shí)，X14不是Ala。
文檔編號(hào)C12N15/00GK102080070SQ200910253759
公開(kāi)日2011年6月1日 申請(qǐng)日期1996年3月18日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月17日
發(fā)明者L·N·安德森, L·朗厄, M·S·考皮寧, M·伊哈拉, M·肖萊恩, R·I·尼爾森, S·F·拉森, S·塔卡基 申請(qǐng)人:諾沃奇梅茲有限公司