專利名稱：一種高效表達(dá)幾丁質(zhì)酶編碼基因和β-1,3-葡聚糖酶編碼基因的木霉生防重組工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域。具體涉及一種利用幾丁質(zhì)酶編碼基因和13 -1，3_葡聚 糖酶編碼基因構(gòu)建木霉菌生防工程菌的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
幾丁質(zhì)是由N-乙酰-D-葡萄糖胺經(jīng)(l-4)-P鍵連接的多聚體，是生物圈中含量 豐富的多聚物之一。幾丁質(zhì)酶(裂解酶)存在于生物圈的各個(gè)角落，例如原生生物、細(xì)菌、 真菌、植物、無脊椎動(dòng)物及脊椎動(dòng)物中，甚至包括人類。在許多生化過程中都包含有對(duì)幾丁 質(zhì)的酶降解過程，例如自我分解過程，形態(tài)發(fā)生過程及營養(yǎng)吸收過程，在有機(jī)物之間，包括 植物_真菌，昆蟲_真菌，及真菌_真菌之間的互作中起著關(guān)鍵的作用。
在有效對(duì)抗R. solani的寄生作用中包括三種幾丁質(zhì)內(nèi)切酶的表達(dá) 52kDa(CHIT52) ，42kDa(CHIT42)和33kDa (CHIT33)，還有CHIT102中的N-乙酰葡糖胺酶的 活性。相反，在無效對(duì)抗S.rolfsii的重寄生作用中，只有兩種兩種外切N-乙酰葡糖胺 酶(CHIT102和CHIT73)的活性被檢測(cè)到。Carsolio等在哈茨木霉MI206040與絲核菌 (R. solani)直接對(duì)峙分析中研究長(zhǎng)約42kDa的幾丁質(zhì)內(nèi)切酶的表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CHIT42 在拮抗過程中受到強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)。在拮抗病原菌作用中哈茨木霉體內(nèi)幾丁質(zhì)酶的表達(dá)是以 特異而又精確的模式調(diào)控的，而且受特異性宿主的影響。 葡聚糖有a和|3兩種構(gòu)象，它們都是D-葡萄糖的聚合物。a-葡聚糖和P-葡 聚糖廣泛存在于自然界中。葡聚糖酶降解的多聚體在自然界中以纖維素和半纖維素大量存 在，其中a-l，4葡聚糖作為細(xì)胞多糖的一種基本儲(chǔ)存模式——糖原廣泛存在于除了卵菌以 外的含有P-l，3-葡聚糖的真菌中。葡聚糖是真菌細(xì)胞壁的組成成分，同時(shí)也存在于胞外 多糖中。 葡聚糖裂解酶廣泛存在于高等植物、細(xì)菌、真菌和依靠它們生存的各種各樣的寄 主中。在高等植物中，葡聚糖裂解酶被認(rèn)為是植物抵御病原真菌的防御系統(tǒng)之一 (Mauch et al. ， 1988) 。 13 -葡聚糖酶具有很多不同功能細(xì)胞壁中葡聚糖的轉(zhuǎn)移和饑餓狀態(tài)下儲(chǔ)存糖 原；降解植物病原體的胼胝質(zhì)；腐生生物的營養(yǎng)；包括致病機(jī)理和真菌寄生物的營養(yǎng)。葡聚 糖酶在胞外產(chǎn)生或在壁間產(chǎn)生是高Km值、器官形成、進(jìn)化發(fā)展的常見特征。另外，從綠木霉 中分離出的P-l，3葡聚糖酶和P-l，4葡聚糖酶能破壞真菌細(xì)胞壁的完整及導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)滲 漏(Jeffries andYoung， 1994)。其中，P _1， 3葡聚糖是真菌細(xì)胞壁的重要成分。|3_1，3 葡聚糖酶(包括外切酶和內(nèi)切酶)直接參與哈茨木霉菌與其寄主真菌之間的重寄生作用。 Clarkson發(fā)現(xiàn)哈茨木霉的P _1， 3葡聚糖酶有抑菌作用，P _1， 3葡聚糖酶單獨(dú)存在時(shí)不能 在真菌細(xì)胞壁平板中產(chǎn)生透明水解圈，但是它能阻止病原真菌和其它的水解酶相結(jié)合。內(nèi) 切P-l，3葡聚糖酶的這種特殊誘導(dǎo)作用和裂解活性，使之被認(rèn)為是木霉對(duì)抗一些病原真 菌的拮抗酶。 木霉菌屬于半知菌亞門，絲孢綱、絲孢目，粘孢菌類，普遍存在于土壤、植物根圍、
3葉圍及種子、球莖表面等，具有重要經(jīng)濟(jì)意義，是目前研究最多的植物病害生防真菌。關(guān)于 木霉的生防機(jī)制有一種觀點(diǎn)就是有生防作用的木霉能產(chǎn)生一些蛋白質(zhì)酶類(如幾丁質(zhì) 酶、葡聚糖酶、蛋白酶)可抑制病原菌的生長(zhǎng)。這些木霉菌種能降解真菌細(xì)胞壁，降解真菌 細(xì)胞壁主要是由于幾丁質(zhì)酶，葡聚糖酶和蛋白酶活性。當(dāng)生防木霉粘附并盤繞到植物病原 菌后，寄生菌絲開始移動(dòng)，露出溶解位點(diǎn)，通過溶解孔滲入宿主，木霉菌在侵入或穿透寄主
菌絲細(xì)胞時(shí)，產(chǎn)生了幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶(包括|3-1，3， |3-1，4， P-l，6葡聚糖酶)、纖維素
酶以及蛋白酶、脂酶等一系列水解酶類，來消解病原菌的細(xì)胞壁。它們大都由多糖和真菌細(xì)
胞壁誘導(dǎo)，并受代謝降解物如高濃度葡萄糖的阻遏。在這些細(xì)胞壁降解酶中，幾丁質(zhì)酶和葡
聚糖酶成為目前研究的熱點(diǎn)，被公認(rèn)為是影響生防真菌重寄生能力的重要因子。 Elad等(1984)，在使用木霉生防制劑防治白絹病菌(S.rolfsii)時(shí)發(fā)現(xiàn)，能攻擊
病原菌的哈茨木霉菌株比不能攻擊的菌株分泌更多的P-l，3葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶。通
過這些胞壁酶活性能極為有效地攻擊病原菌的活體結(jié)構(gòu)，當(dāng)哈茨木霉菌絲入侵白絹病菌
(S.rolfsii)菌核，并在其表面留下孔洞，這些菌核最終失去正常的形狀，細(xì)胞漿外泄，從而
達(dá)到防治效果。據(jù)Metcalf和Wilson報(bào)道，康寧木霉可抑制洋蔥根部的白腐小核菌，并發(fā)現(xiàn)
木霉的菌絲伸人洋蔥根部的表皮及皮層后破壞內(nèi)部病原菌的菌絲體，但對(duì)植物組織無害。
其原因是康寧木霉產(chǎn)生了內(nèi)、外幾丁質(zhì)酶。Woo等發(fā)現(xiàn)喪失了幾丁質(zhì)酶基因(ech42)活性的
哈茨木霉，對(duì)大豆葉片灰霉病的抗性明顯下降。K即at等發(fā)現(xiàn)通過增加哈茨木霉P-l，4葡
聚糖酶基因拷貝數(shù)會(huì)使突變株的生防能力提高。 但是，上述關(guān)于P-l，3葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶的報(bào)道內(nèi)容，僅限于探討木霉作為對(duì) 抗一些病原真菌的拮抗酶的機(jī)理探討和試驗(yàn)測(cè)試階段，只是確認(rèn)了原始木霉菌具有防治真 菌的功能，而原始木霉菌因其中功能基因含量不穩(wěn)定，生防效果較差。目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)如 何穩(wěn)定和提高木霉中幾丁質(zhì)酶和P _葡聚糖酶基因、如何獲得較高生防效果的木霉生防重 組工程菌的文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的局限性，本發(fā)明人認(rèn)為通過基因工程的方法，重組木霉生防 工程菌，提高和穩(wěn)定生防木霉幾丁質(zhì)酶和P-葡聚糖酶基因，將是提高其生防效果的一種 有效途徑。 本發(fā)明的目的是提供一種同時(shí)含有幾丁質(zhì)酶編碼基因和13 -1， 3-葡聚糖酶編碼 基因的木霉生防重組工程菌，該重組工程菌是通過土壤桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化，在原始生 防木霉菌中同時(shí)引入幾丁質(zhì)酶編碼基因和P-l，3-葡聚糖酶編碼基因，實(shí)現(xiàn)這兩種基因在 重組工程菌中同時(shí)、穩(wěn)定的表達(dá)，使其發(fā)揮協(xié)同作用，提高了其拮抗病原菌的能力。
本發(fā)明所述的木霉生防重組工程菌，是一種可高效表達(dá)木霉來源幾丁質(zhì)酶和 13 -1 ， 3-葡聚糖酶基因的木霉重組工程菌，是將帶有幾丁質(zhì)酶和13 -1 ， 3-葡聚糖酶基因的 表達(dá)元件轉(zhuǎn)化重組到木霉菌染色體中，使重組工程菌染色體中同時(shí)含有幾丁質(zhì)酶編碼基因 chi42和P-l，3-葡聚糖酶編碼基因glultr-2。 本發(fā)明提供的用于轉(zhuǎn)化的木霉菌可以是哈茨木霉(Trichoderma harzia皿m)、綠 色木霉(Trichoderma viride)、長(zhǎng)枝木霉(Trichoderima longibrachiatum)、康寧木霉 (Trichoderma. koningii)或黃綠木霉(Trichoderma aureoviride)。
其中，優(yōu)選哈茨木霉(Trichoderma harzianum)LTR_2。對(duì)番茄灰霉病具有較好生 防效果。 本發(fā)明選用幾丁質(zhì)酶編碼基因chi42，來源于本申請(qǐng)人實(shí)驗(yàn)室分離的哈茨木霉， Genbank登陸號(hào)為EF635427。 本發(fā)明選用的P-l，3葡聚糖酶編碼基因glultr-2來源于本實(shí)驗(yàn)室分離的哈茨木 霉，Genbank登陸號(hào)為EF176582。 本發(fā)明提供了通過土壤桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化所需的一系列質(zhì)粒載體，包括 pl300-chi42、pl302-chi42和pl302-chi42-glultr_2。 本發(fā)明木霉生防重組工程菌是通過土壤桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化方法(Agrobac teriumtumefaciens—mediated transformation, ATMT)獲得的，具體包括木霉幾丁質(zhì)酶 Chi42和P-l，3葡聚糖酶編碼基因glultr-2的克隆，質(zhì)粒1300_chi42、 pl302-chi42和 pl302-chi42-glultr-2的構(gòu)建，通過土壤桿菌介導(dǎo)T-DNA插入突變構(gòu)建重組木霉工程菌及 工業(yè)化培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)重組工程菌生防產(chǎn)品。 本發(fā)明所述的木霉生防重組工程菌中的幾丁質(zhì)酶編碼基因和P-l，3-葡聚糖酶 編碼基因，是通過利用pl300-chi42、pl302-chi42或pl302-chi42-glultr-2中所含CAMV35 啟動(dòng)子和polyA site構(gòu)建的表達(dá)框?qū)崿F(xiàn)表達(dá)。其中由pl302-chi42-glultr-2載體通過土 壤桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化木霉菌LTR-2后獲得菌株LTR-2/CG23是對(duì)番茄灰霉病生 防效果最好的菌株。能穩(wěn)定表達(dá)幾丁質(zhì)酶編碼基因chi42和P-l，3-葡聚糖酶編碼基因 glultr-2。 本發(fā)明所述的木霉生防重組工程菌的生產(chǎn)方法是一種工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)重組工程 菌的生產(chǎn)方法，其特征是將通過土壤桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化法獲得的重組菌株LTR-2/CG23 進(jìn)行種子培養(yǎng)、工業(yè)規(guī)?；合喟l(fā)酵或液-固聯(lián)合發(fā)酵，制備液體發(fā)酵產(chǎn)品或固體發(fā)酵產(chǎn)
PR o 上述培養(yǎng)發(fā)酵過程中可使用PDA培養(yǎng)基，其配方和制備方法如下 將200g馬鈴薯去皮，切成小塊，于鍋中加水1000mL煮沸半個(gè)小時(shí)，用雙層紗布過
濾，取其濾液加葡萄糖15g，瓊脂15g ;去離子水定容至1000mL 本發(fā)明所述工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的木霉生防重組工程菌可以單獨(dú)使用，也可以與其他 生物生防成分或植物生長(zhǎng)激素或誘導(dǎo)因子及微量元素和肥料等復(fù)合使用；可添加相應(yīng)的助 劑和其他輔料制備多種單一或復(fù)合生防制劑，例如水分散粒劑、可分散液劑、混懸劑、顆粒 劑、微粒劑、微膠囊等。 應(yīng)用本發(fā)明所述工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的木霉生防重組工程菌可以制成的多種生防制
劑，用于蔬菜、糧食、果樹、經(jīng)濟(jì)作物以及其他植物真菌病害的生物防治，例如用于蕃茄、黃
瓜等蔬菜霜霉病、白粉病，煙草青枯病、小麥紋枯病、赤霉病等植物病害的防治。 本發(fā)明的穩(wěn)定表達(dá)幾丁質(zhì)酶編碼基因chi42和P-l，3-葡聚糖酶編碼基因
glultr-2重組工程菌株也可用于發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶等酶制劑等方面。 本發(fā)明提供了液固聯(lián)合發(fā)酵法大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)重組工程菌株LTR-2/CG23，并提供
了利用重組工程菌株LTR-2/CG23發(fā)酵產(chǎn)生的分生孢子制備木霉水分散性微粒劑的制備方法。


圖1含幾丁質(zhì)酶編碼基因chi42和13 -1 ， 3葡聚糖酶編碼基因glultr-2表達(dá)框質(zhì) 粒載體構(gòu)建示意圖 圖2含幾丁質(zhì)酶編碼基因chi42和13 -1 ， 3葡聚糖酶編碼基因glultr-2表達(dá)框質(zhì) 粒載體的酶切分析電泳圖 1質(zhì)粒pl302-chi42-glultr-2的Spel酶切結(jié)果
2質(zhì)粒pl302-chi42-glultr-2的EcoRI酶切結(jié)果
3質(zhì)粒pCAMBIA1302的Spel酶切結(jié)果
4質(zhì)粒pCAMBIA1302的EcoRI酶切結(jié)果M lkbDNAmarker(10000， 8000， 7000， 6000， 5000， 4000， 3000， 2000，1000)bp
圖3重組工程菌株的Southern鑒定分析結(jié)果 1-5分別是使用hph基因?yàn)樘结槍?duì)重組工程菌株LTR-2/CG3、 LTR_2/CG11、 LTR-2/ CG23、 LTR-2/CG26、 LTR-2/CG29基因組DNA經(jīng)EcoRI酶切的Southern bloting結(jié)果
6使用hph基因?yàn)樘结槍?duì)出發(fā)菌LTR-2基因組DNA經(jīng)EcoRI酶切的Southern bloting結(jié)果
具體實(shí)施例方式
下面用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，實(shí)施例不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成任何限制。
實(shí)施例1 :木霉幾丁質(zhì)酶Chi42和13 _1，3葡聚糖酶編碼基因glultr-2的克隆
將綠色木霉LTR-2分生孢子接種在在PDB培養(yǎng)基中(配方為馬鈴薯200g ;葡 萄糖15g;去離子水定容至lOOOmL，將馬鈴薯去皮，切成小塊，于鍋中加水1000mL煮沸半 個(gè)小時(shí)，用雙層紗布過濾，取其濾液加糖，并加水補(bǔ)足lOOOmL)，培養(yǎng)48-72h，提取基因組 DNA，電泳方法檢查DNA純度和定量。以基因組DNA為模板，使用上游引物Chi42XhoI-F : 5' GCCTCGAGATGTTGGGCTTCCTCGG 3'(劃線部分為Xhol酶切位點(diǎn))下游引物Chi42XhoI-R : 5'GCCTCGAGCTTGTCGAACAAGCTTCTAGTTGAGACC 3'(劃線部分為Xhol酶切位點(diǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò) 增。在50ii L反應(yīng)體系中分別加入10XTaq DNA聚合酶buffer 5 ii L，上下游引物至20 ii M， dNTP 100 iiM， MgC12 lmM，模板DNA 10ng/ii L， 0. 5 ii L rTaqDNA聚合酶，加滅菌的去離子水 補(bǔ)足到50ii L，充分混勻并離心。放入PCR儀(GeneAmp PCR System9600)中，94。C充分變 性min ;30個(gè)循環(huán):94。C變性lmin，47。C退火1. 5min，72。C延伸2min ;72。C延伸10min。得 到約1.5kb的DNA片段，瓊脂糖電泳后該片段凝膠回收純化，與載體pMD18-T直接連接，轉(zhuǎn) 化大腸桿菌DH5a ，在含IPTG和X-gal的篩選培養(yǎng)基平板上挑選白色菌落，得到陽性克隆， 所攜帶的質(zhì)粒命名為pMChi42。重組質(zhì)粒pMChi42送上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序。即 得到木霉幾丁質(zhì)酶chi42。 將綠色木霉LTR-2分生孢子接種在在PDB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48_72h，提取基因組 DNA，電泳方法檢查DNA純度和定量。以基因組DNA為模板，使用上游引物glultr-2F: CGGAATTCATGTTGAAGCTCACGGCG (劃線部分為EcoR I酶切位點(diǎn))glultr-2R :CGGAATTCGTATA ACGGGCAACGTCACCACCTCC(劃線部分為EcoR I酶切位點(diǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 y L PCR反應(yīng) 體系為10XTaq DNA buffer 5 ii L，上下游引物20 ii M， dNTP 100 ii M， MgCl2lmM，模板DNA 10ng/ii L，0. 5ii L rTaqDNA聚合酶，ddH20補(bǔ)足到50ii L。反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性5min ;94。C變性lmin， 58。C退火1. 5min， 72。C延伸2min， 30個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min?；厥誔CR產(chǎn) 物并連接pMD18-T Vector,轉(zhuǎn)化E. coli ToplOF'，獲得重組質(zhì)粒pMD18-T-glultr-2，測(cè)序 鑒定。測(cè)序工作由上海生工公司完成。即得到木霉P-l，3葡聚糖酶編碼基因glultr-2。
實(shí)施例2 :pl302-chi42的構(gòu)建 利用pCAMBIA1300的潮霉素基因hph的CaMV35S啟動(dòng)子和終止子作為42kDa幾丁 質(zhì)酶基因啟動(dòng)子和終止子，然后插入到表達(dá)載體pCAMBIA1302中。構(gòu)建獲得pl302-chi42。 具體方法如下 首先是質(zhì)粒pCAMBIA1300和幾丁質(zhì)酶基因的連接，利用42kDa幾丁質(zhì)酶基因的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物兩端含有Xhol酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接經(jīng)Xhol酶切后與經(jīng)Xhol酶切 后去磷酸化pCAMBIA1300載體用T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。由于單酶切存在正反向 的問題，因此我們采用PCR和Sacl酶切鑒定的方法。正向連接，兩酶切位點(diǎn)之間序列約有 2. 4kb，反向連接約有1. lkb，用SacI酶切PCR篩選出的陽性克隆，得了一條2. 4kb左右的 條帶，可以確定其為正向連接質(zhì)粒，連接產(chǎn)物命名為pl300-chi42。利用載體中35S啟動(dòng)子 和35S-polyA終止子序列設(shè)計(jì)另外一對(duì)引物，引入酶切位點(diǎn)EcoR I，上游引物35SPEcoRI-F 5， GCGAATTCCGACACTCTCGTCTACTCC-3'下游引物35PolyEcoRI-R 5' CGAATTCTGTACTGAATTA ACGCCGAAT-3'，從pl300-chi42中擴(kuò)增與35S啟動(dòng)子和35S-polyA終止子正向連接的幾丁 質(zhì)酶基因，退火溫度為60°C。瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物，包括35S啟動(dòng)子和35S-polyA 終止子，獲得幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)框大小約為2. 4kb。 EcoRI酶切42kDa幾丁質(zhì)酶基因片段和 經(jīng)去磷酸化處理后的EcoRI酶切的pCAMBIA1302載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。通過菌落PCR 篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，利用EcoRI酶切，酶切后，出現(xiàn)一條約為2. 4kb的條帶，確定此為 pl302-chi42重組質(zhì)粒。 實(shí)施例3 :pl302-chi42-glultr-2的構(gòu)建 以重組質(zhì)粒pMD18-T-glultr-2為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 ii L PCR反應(yīng)體系為 lOXpyrobestbufferII 5 ii L，上下游弓|物20 ii M， dNTP 100iiM，MgC12 lmM，模板1 ii L， pyrobest DNA PolymeraseO. 5 ii L， ddH20補(bǔ)足至lj 50 ii L。弓l物序列如下
gluEZF5' CTCTTGACCATGGTAGATCTGACTAGTATGTTGAAGCTCACGGCGCTCG
(劃線部分為與經(jīng)Spel線性化pCAMBIA1302載體一端相同的核酸序列)
線部分為與經(jīng)Spel線性化pCAMBIA1302載體另一端相同的核酸序列)反應(yīng)條件為94。C預(yù) 變性5min ;94"C變性lmin， 58"C退火1. 5min，72。C延伸2min，30個(gè)循環(huán);72。C延伸10min?；?收PCR產(chǎn)物并利用CloneEZ⑧重組克隆試劑盒(南京金瑞斯)與Spel線性化pl302-chi42 載體反應(yīng)。反應(yīng)條件如下 線性化pl302-chi42載體(100-200ng/ii 1)6ii 1，純化的glultr-2PCR產(chǎn)物 (100_200ng/ii 1)6ii 1， 10X CloneEZ Buffer 2iil，CloneEZ Enzyme 2iil，去離子水補(bǔ)足 20 iU ;將其混合物在25t:保持30分鐘，之后在冰上保持5分鐘，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。通過菌落 PCR篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，利用Spel酶切檢測(cè)，酶切后，出現(xiàn)一條約為2. 4kb的條帶，確 定此為pl302-chi42-glultr-2重組質(zhì)粒。 實(shí)施例4 :通過土壤桿菌介導(dǎo)T-DNA插入突變構(gòu)建重組木霉工程菌 利用土壤桿菌EHA105介導(dǎo)的T-DNA法轉(zhuǎn)化哈 木霉LTR-2，獲得重組木霉工程菌，具體步驟如下 挑取EHA105的單菌落(含pl302-chi42-glultr-2質(zhì)粒)在LB培養(yǎng)基中28°C、 200rpm培養(yǎng)過夜后，將培養(yǎng)物用IM(誘導(dǎo)培養(yǎng)基)液體培養(yǎng)基稀釋至0D66。為0. 15，在AS 含量為200 M的IM液體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)6h，至0D66。值為0. 6_0. 7時(shí)，與106個(gè)/ml的 木霉分生孢子液等體積混勻，吸取0. 4ml的混合菌液涂布在pH為6. 0、AS濃度為200 y M共 培養(yǎng)培養(yǎng)基的平板上，2『C條件下培養(yǎng)48h，然后在IM培養(yǎng)基平板上覆蓋一層含100 g/mL 潮霉素的PDA培養(yǎng)基(含有50i!g/mL的四環(huán)素以殺死根癌土壤桿菌)。繼續(xù)培養(yǎng)4-7d，將 長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子挑到含潮霉素培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)。將抗性菌轉(zhuǎn)接到含藥培養(yǎng)基上繼續(xù)培 養(yǎng)，提取基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增和Southern雜交來鑒定篩選疑似轉(zhuǎn)化子以及插入T-DNA 的拷貝數(shù)。 以重組木霉菌DNA為模板，以Hra-F :5' CCGGTTTCCACTATCGGCGA3，和IPH-R : 5' CAAAGCCTGAACTCACCGC3'為引物PCR擴(kuò)增潮霉素抗性基因hph ，擴(kuò)增的片斷大小約1 kb 左右。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示以重組木霉菌DNA為模板可以擴(kuò)增出大 小為lkb左右的片段，而未轉(zhuǎn)化的出發(fā)菌株基因組DNA為模板沒有條帶出現(xiàn)，這表明hph基 因插入到重組木霉菌染色體基因組內(nèi)。綠色木霉LTR-2及其重組工程菌基因組DNA經(jīng)過 EcoR I酶切之后，然后電泳、轉(zhuǎn)膜與以重組質(zhì)粒pl302-chi42-glultr-2質(zhì)粒為模板，HPH-F 和HPH-R作為引物，擴(kuò)增潮霉素抗性基因hph制備生物素標(biāo)記探針雜交和BCIP/NBT顯色， 雜交結(jié)果顯示在經(jīng)過EcoR I酶切的重組工程菌基因組DNA中出現(xiàn)了雜交帶，而LTR-2中沒 有出現(xiàn)，這證明了 hph基因在重組工程菌的存在。同時(shí)證明T-DNA隨機(jī)插入到染色體基因 組中，并進(jìn)一步表明含有幾丁質(zhì)酶編碼基因chi42和P-l，3葡聚糖酶編碼基因glultr-2 表達(dá)框的pl302-chi42-glultr-2整合到木霉LTR-2基因組中。
實(shí)施例5 :重組木霉菌的幾丁質(zhì)酶和13 -1， 3葡聚糖酶活性測(cè)定
將獲得的轉(zhuǎn)化木霉菌株進(jìn)行液體發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基為PDB培養(yǎng)基，發(fā)酵96h后，抽 濾后取上清測(cè)定菌液中幾丁質(zhì)酶和P-l，3葡聚糖酶活性。測(cè)定方法如下
幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定取4支試管，分別加入0. 5mL濾液(即粗酶液)和0. 5mL幾丁 質(zhì)膠體，其中三支試管于4(TC水浴60min，另外一支于4t:放置，作為對(duì)照；水浴60min后， 在樣品和對(duì)照中均加入0. 5mLDNS，沸水浴10min ;在樣品中加入4. 5mL蒸餾水，對(duì)照中加入 13mL蒸餾水，離心取上清于540nm測(cè)定吸光度。定義lmin內(nèi)產(chǎn)生1 y mol還原糖定為1個(gè) 酶活力單位(U)。 |3 -1， 3葡聚糖酶活性測(cè)定采用砷鉬酸法測(cè)定13 -1， 3-葡聚糖酶的活性.以昆布 多糖為底物，測(cè)定時(shí)，取1. Oml酶液，加0. 4ml的lmg/ml昆布多糖檸檬酸_磷酸氫二鈉緩沖 液溶液(pH5. 6) ， 37"水浴15min后，加入0. 5ml銅試劑，IO(TC沸水浴10min，置冰水浴中迅 速冷卻。加入0. 5ml砷鉬酸試劑，搖勻后呈藍(lán)色。加3ml蒸餾水，混勻后于660nm下比色測(cè) 透光率。重復(fù)測(cè)定三次，取平均值。在0 1300yg/ml之間設(shè)置葡萄糖濃度梯度，在與樣 品同樣的條件下測(cè)定透光率。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活。用蒸餾水代替酶液做對(duì)照。 實(shí)際酶活是測(cè)量值減去對(duì)照值。定義lmin內(nèi)產(chǎn)生1 P g葡萄糖的酶量定為1個(gè)酶單位(U)。
通過活性測(cè)定我們篩選獲得了可在PDB培養(yǎng)基穩(wěn)定表達(dá)幾丁質(zhì)酶編碼基因chi42 和P _1，3葡聚糖酶編碼基因glultr-2的重組工程菌株LTR-2/CG23，其發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶 和P -1， 3葡聚糖酶活性分別為0. 761U/mL和310U/mL。
實(shí)施例6 :重組工程菌株LTR-2/CG23液固發(fā)酵及其分生孢子的水分散性微粒劑制 備方法 刮取PDA培養(yǎng)基中的重組工程菌株LTR-2/CG23分生孢子，配制成107個(gè)/mL的孢 子懸液，按1%接種于裝液量為200mL的500mL三角瓶中，液體培養(yǎng)基配方為玉米粉2%， 葡萄糖1%，豆餅粉1%，磷酸氫二鉀0.2%，磷酸二氫鉀0.3%，碳酸鈣1X，pH6.0，150轉(zhuǎn)/ 分，25-28t:條件下培養(yǎng)24-48h。然后，按30%接種于固體培養(yǎng)基中，固體培養(yǎng)基配方為麩 皮玉米粉稻殼=7 : 2 : l，含硫酸亞鐵100ppM，含水量70%。在培養(yǎng)溫度25-28°C， 濕度30-40%條件下，發(fā)酵72-96h至固體發(fā)酵培養(yǎng)料變成綠色即可收獲，作為有效殺菌成 分使用。 將固體發(fā)酵后長(zhǎng)滿重組工程菌株LTR-2/CG23分生孢子的固體發(fā)酵培養(yǎng)料，添加 相應(yīng)的輔料，混合均勻，在35-4(TC下干燥，制成水分散性微粒劑。 所說的輔料包括具有分散劑，崩解劑、防脫水、防紫外線、穩(wěn)定劑、乳化劑、潤(rùn)濕劑、 營養(yǎng)物質(zhì)、誘導(dǎo)劑、黏結(jié)劑功能的多種添加劑。 本發(fā)明人優(yōu)選的水分散性微粒劑具體組分及重量份數(shù)如下
分生孢子(108cfu/g) 20. 0份 淀粉或玉米粉 80 85份 SDS 2. 5份 幾丁質(zhì) 0. 3份 黃原膠 1. 0份 聚黃腐酸鈉 0. 1份 乙二醇 1. 0份 上述重組菌生防制劑通過拌種或作物生長(zhǎng)期間通過穴施、混土、灌根等方式，可以 直接用于防治蕃茄灰霉病、小麥紋枯病等植物真菌病害。盆栽實(shí)驗(yàn)表明重組工程菌對(duì)蕃茄 灰霉病和小麥紋枯病具有比出發(fā)菌LTR-2有更顯著的防治效果。
權(quán)利要求
一種可高效表達(dá)木霉來源幾丁質(zhì)酶chi42和β-1，3-葡聚糖酶基因的木霉重組工程菌，其特征在于通過將帶有幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶基因的表達(dá)元件轉(zhuǎn)化重組到木霉菌染色體中，獲得的同時(shí)含有幾丁質(zhì)酶編碼基因chi42和β-1，3-葡聚糖酶編碼基因glultr-2的重組工程菌。
2. 如權(quán)利要求l種所述的重組工程菌，其特征在于用于轉(zhuǎn)化重組的木霉菌可以 是哈茨木霉(Trichoderma harzia皿m)、綠色木霉(Trichoderma viride)、長(zhǎng)枝木 霉(Trichoderimalongibrachiatum)、康寧木霉(Trichoderma. koningii)或黃綠木霉 (Trichoderma aureoviride)。
3. 如權(quán)利要求1所述的重組工程菌，其特征在于所述的幾丁質(zhì)酶編碼基因chi42和 P -1， 3-葡聚糖酶編碼基因在Genbank序列號(hào)分別為EF635427和EF176582。
4. 如權(quán)利要求l所述的重組工程菌的制備方法，其特征在于通過土壤桿菌介導(dǎo)的 T-DNA轉(zhuǎn)化方法制備，具體步驟包括木霉幾丁質(zhì)酶Chi42和13 _1，3葡聚糖酶編碼基因 glultr-2的克隆，質(zhì)粒pl302-chi42和pl302-chi42-glultr-2的構(gòu)建，通過土壤桿菌介導(dǎo) T-DNA插入突變構(gòu)建重組木霉工程菌及工業(yè)化培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)重組工程菌生防產(chǎn)品。
5. 如權(quán)利要求4所述的重組工程菌的制備方法，其特征在組工程菌中的幾丁質(zhì) 酶編碼基因和P-l，3-葡聚糖酶編碼基因，是通過利用pl300-chi42、 pl302-chi42或 pl302-chi42-glultr-2中所含CAMV35啟動(dòng)子和polyA site構(gòu)建的表達(dá)框?qū)崿F(xiàn)表達(dá)。其中 由pl302-chi42-glultr-2載體通過土壤桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化木霉菌LTR-2后，獲 得菌株LTR-2/CG23。
6. 如權(quán)利要求4所述的重組工程菌的制備方法，其特征在于所說的發(fā)酵生產(chǎn)方法是利 用液-固聯(lián)合發(fā)酵法。
7. 如權(quán)利要求1所述的重組工程菌的應(yīng)用，其特征在于所說的重組工程菌可以單獨(dú)或 與其他組分復(fù)合制備生防制劑。
8. 如權(quán)利要求1或7所述的重組工程菌的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用所說的重組工程菌為 有效殺菌成分制備用于防治植物真菌病害的水分散性微粒劑。
9. 如權(quán)利要求1或7所述的重組工程菌的應(yīng)用，其特征在于所說的重組工程菌生防制 劑用于蔬菜、糧食、果樹、經(jīng)濟(jì)作物以及其他植物真菌病害的生物防治。
10. 如權(quán)利要求1所述的重組工程菌的應(yīng)用，其特征在于所說的重組工程菌用于發(fā)酵 生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶和/或葡聚糖酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可高效表達(dá)木霉來源幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶基因的木霉重組工程菌及其應(yīng)用。本發(fā)明的重組菌株是通過土壤桿菌介導(dǎo)的含木霉來源幾丁質(zhì)酶編碼基因chi42和β-1，3-葡聚糖酶編碼基因glultr-2的T-DNA衍生載體轉(zhuǎn)化具有植物病害生物防治功能的綠色木霉LTR-2獲得的重組工程菌。重組菌可以在PDA培養(yǎng)基穩(wěn)定表達(dá)幾丁質(zhì)酶編碼基因chi42和β-1，3-葡聚糖酶編碼基因glultr-2，盆栽實(shí)驗(yàn)表明重組工程菌對(duì)蔬菜灰霉病和小麥紋枯病具有比出發(fā)菌LTR-2，更有效的防治效果。
文檔編號(hào)C12N1/15GK101724573SQ20091025640
公開日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2009年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月17日
發(fā)明者吳遠(yuǎn)征, 扈進(jìn)冬, 李紀(jì)順, 楊合同, 陳凱 申請(qǐng)人:山東省科學(xué)院中日友好生物技術(shù)研究中心