專利名稱：一種液態(tài)纖維素酶的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及在生物發(fā)酵技術領域，特別是涉及一種液體纖維素酶的制備方法。
背景技術：
纖維素酶(cellulase)是指能降解纖維素3 _1，4葡萄糖苷鍵，使纖維素變成纖維 二糖和葡萄糖的一組酶的總稱，是起協(xié)同作用的多組分酶系。纖維素酶在我國每年有幾十 億元的市場銷售額，在紡織、酒精、飼料等工業(yè)具有廣泛的應用，但目前國內(nèi)90%以上的市 場份額被國外產(chǎn)品所占領，因此開展纖維素酶發(fā)酵技術的研究，降低生產(chǎn)成本具有很重要 的現(xiàn)實意義。纖維素酶的生產(chǎn)和其它酶制劑一樣，主要有固體發(fā)酵和液體深層發(fā)酵兩種，固體 發(fā)酵法的投資少，工藝簡單，產(chǎn)品價格低廉，但是固體發(fā)酵法的自動化程度低，勞動強度大， 產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。因此，隨著液體發(fā)酵酶工藝的發(fā)展及菌種性能的提高，采用液體發(fā)酵法生 產(chǎn)纖維酶素是必然趨勢?，F(xiàn)有的液體發(fā)酵法生產(chǎn)纖維酶素主要采用機械攪拌罐或氣升式發(fā)酵罐。當使用 機械攪拌罐發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶時，在綠色木霉的呼吸高峰期，溶氧急劇下降，經(jīng)常會跌倒零 以下，因此必須提高溶氧，在發(fā)酵過程中提高發(fā)酵液中溶氧的方法主要是提高通氣量、增加 罐壓、提高攪拌轉(zhuǎn)速。為了提高綠色木霉發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶呼吸高峰期醪液中的溶氧水平， 可以分別提高通氣量、增加罐壓、提高攪拌轉(zhuǎn)速。但是實際應用中發(fā)現(xiàn)，通氣量的提高達到 1 1.5已是上限，而且增加通氣量對溶氧的提高有限。提高罐壓到0.8kg/cm3也已是普通 發(fā)酵罐的承壓的上限。發(fā)酵過程中通過攪拌可以促進混合、傳熱與傳質(zhì)，對醪液中溶氧水平 提高也較大，但攪拌轉(zhuǎn)速的提高對絲狀菌的菌體產(chǎn)生剪切作用，從而影響菌的生長、形態(tài)和 產(chǎn)物的合成。發(fā)酵過程中可以很明顯的發(fā)現(xiàn)，當轉(zhuǎn)速提高到一定時，菌絲體明顯被打斷，醪 液中出現(xiàn)大量的菌絲體碎片。因此，僅僅通過上述方式，很難滿足綠色木霉在呼吸高峰對溶 氧的需求。如果直接用氣升式發(fā)酵罐生產(chǎn)纖維素酶時，由于發(fā)酵醪液中有純纖維素、微晶纖 維素和碳酸鈣等不溶性物質(zhì)，在發(fā)酵開始階段，物料混合效果不好。尤其在發(fā)酵的8 20 小時，由于綠色木霉菌絲體的快速增長，發(fā)酵醪液出現(xiàn)粘稠現(xiàn)象，氣升式發(fā)酵罐無法完成物 料的充分混合，菌絲出現(xiàn)缺氧狀態(tài)，過早出現(xiàn)菌絲結(jié)節(jié)，大大降低液體纖維素酶的產(chǎn)量。因此，有必要提出一種高效制備纖維素酶的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是針對纖維素酶現(xiàn)有發(fā)酵技術的不足，提供一種操作簡便，成本低，酶 活力穩(wěn)定的利用綠色木霉大量制備纖維素酶的方法。綠色木霉發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶過程主要分為三個階段一、綠色木霉利用培養(yǎng)基中 較易利用的碳源，菌體細胞快速增長，菌絲長，蔓延生長，呼吸強度明顯，溶氧消耗很快，此 時不分泌或少量分泌纖維素酶；二、綠色木霉利用培養(yǎng)基中較難利用碳源，菌體細胞濃度基本保持穩(wěn)定，菌絲長，細胞中有不均勻顆粒，此時大量分泌纖維素酶；三、培養(yǎng)基中的碳源和 氮源基本被消耗，菌絲體變粗，出現(xiàn)結(jié)節(jié)，開始衰老與死亡，分泌纖維素酶速率明顯下降。為保證綠色木霉能夠以其最大能力生產(chǎn)液態(tài)纖維素酶，就有必要根據(jù)其發(fā)酵特 點，控制發(fā)酵過程中的各參數(shù)，促進綠色木霉的發(fā)酵進程，因此提出本發(fā)明所述的制備纖維 素酶的方法。本發(fā)明所述的制備纖維素酶的方法，是利用機械攪拌罐和氣升式發(fā)酵罐聯(lián)合培養(yǎng) 綠色木霉。具體的說，本發(fā)明所述的制備纖維素酶的方法包括下述步驟(1)先將綠色木霉接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的機械攪拌罐中，保溫培養(yǎng)；(2)當機械攪拌罐中發(fā)酵液中葡萄糖消耗至含量小于0. 01 %，且菌絲體重達到 0. 8g/100ml，轉(zhuǎn)入氣升式發(fā)酵罐進行發(fā)酵培養(yǎng)，整個發(fā)酵周期為90 100小時。機械攪拌罐的參數(shù)控制也可以根據(jù)具體菌種的需要進行選擇，一般可控制攪拌轉(zhuǎn) 速為100 260r/min，風量為1 0. 2 0. 5vvm,罐壓為0. 02 0. 05Mpa ；優(yōu)選攪拌轉(zhuǎn)速 為 150 230r/min，風量為 1 0. 3 0. 4vvm,罐壓為 0. 03Mpa。氣升式發(fā)酵罐的參數(shù)控制也可以根據(jù)具體菌種的需要進行選擇，一般可控制罐面 壓差為0. 025 0. 045Mpa,通風為0. 7 1. Ovvm,罐壓為0. 04 0. 06Mpa ；優(yōu)選的罐面壓 差為0. 04Mpa,通風為0. 8vvm,罐壓為0. 05Mpa。機械攪拌罐中所述發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為機械攪拌罐容積的70% 90%。綠色木霉的接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基總體積的5% 12%。發(fā)酵過程中培養(yǎng)溫度為28_32°C，優(yōu)選30°C。本發(fā)明所述的方法中，步驟1)和2)之間，還包括步驟1’)培養(yǎng)期間每隔3 5小 時取樣測葡萄糖含量、測菌絲體重、鏡檢；步驟2)之后，還包括步驟2’ )培養(yǎng)期間每隔6 10小時取樣測纖維素酶含量。其中，纖維素酶的測定方法為用0. lg濾紙作為底物，加0. 9mLpH4. 8檸檬酸緩沖 液，再加0. lmL粗酶離心上清液，50°C恒溫水浴搖床反應30min，用3，5- 二硝基水楊酸法測 定生成的還原糖，以葡萄糖為標準糖，以每分鐘生成1 P mol還原糖所需的酶量定義成一個 纖維素酶酶活力單位(IU)。液體發(fā)酵好的醪液離心取上清液即為粗酶液。檸檬酸緩沖液為 21g無水檸檬酸、7. 8g氫氧化鈉加蒸餾水定容至2L，pH為4. 8。葡萄糖測定方法為采用DNS法，以葡萄糖為標準。菌絲體重的測定方法為取100ml發(fā)酵液，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，對離心下 的固體稱濕重即為每100ml中菌絲體濕重。所述綠色木霉可選擇本領域常用的制備液體纖維素酶的菌株，優(yōu)選保藏編號為 CICC13052的綠色木霉，根據(jù)上述條件，利用該菌株制備的纖維素酶的產(chǎn)量可達13 36IU/ ml。所述發(fā)酵培養(yǎng)基是綠色木霉發(fā)酵生產(chǎn)液體纖維素酶常用的培養(yǎng)基各成分含量為 微晶纖維素3 5 %、玉米漿1 2 %、葡萄糖1 2 %、尿素0. 1 0. 2 %、硫酸銨0. 1 0. 2%和磷酸氫二鉀0. 05 0. 1%，優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基中含有微晶纖維素4%、玉米漿2%、 葡萄糖2%、尿素0. 2%、硫酸銨0. 和磷酸氫二鉀0. 05%。所述步驟2)中還包括發(fā)酵70-80小時后流加新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基。
所述新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分可與發(fā)酵培養(yǎng)基相同或不同，優(yōu)選以下成分的新 鮮培養(yǎng)基微晶纖維素3-5%、玉米漿1-3%、豆粕粉1_2%、硫酸銨0. 1_1%、磷酸氫二鉀 0. 1-0. 5% ；更優(yōu)選以下成分的新鮮培養(yǎng)基微晶纖維素5%、玉米漿2%、豆粕粉1%、硫酸 銨0.5%、磷酸氫二鉀0.2%。將綠色木霉種子接種到裝有含纖維誘導物微晶纖維素和營養(yǎng)鹽的培養(yǎng)基的機械 攪拌罐中。當葡萄糖消耗完畢，菌濃達到標準后，轉(zhuǎn)入氣升式發(fā)酵罐進行發(fā)酵培養(yǎng)。所述方法中，在步驟1)之前，還包括以下步驟斜面培養(yǎng)在無菌操作條件下，將綠色木霉原種接入PDA試管斜面培養(yǎng)基中，30°C 培養(yǎng)5 7天；種子培養(yǎng)在無菌條件下，將斜面菌種接入三角瓶中，置搖瓶機上振蕩28 32°C 培養(yǎng)20 24小時；然后將搖瓶種子轉(zhuǎn)接種子罐繼續(xù)28 32°C培養(yǎng)20 24小時；種子培 養(yǎng)基成分為葡萄糖1 2 %，玉米漿1 2 %、尿素0. 1 0. 2 %、硫酸銨0. 1 0. 2 %，磷酸 二氫鉀0. 1 0.2%，硫酸鎂0. 05 0. ；三角瓶與種子罐培養(yǎng)基成分相同。優(yōu)選的種子培養(yǎng)基成分為葡萄糖1 %，玉米漿1 %、尿素0. 1 %、硫酸銨0. 2%，磷酸 二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.05%。本發(fā)明所述的利用綠色木霉生產(chǎn)液體纖維素酶的方法，通過機械攪拌罐和氣升 式發(fā)酵罐聯(lián)用，既可以促進綠色木霉菌體細胞生長，同時又避免了發(fā)酵過程中當溶氧不足 時提高攪拌轉(zhuǎn)速對菌絲體的剪切力，可以高效率的制備纖維素酶，與只用機械攪拌罐或只 用氣升式發(fā)酵罐生產(chǎn)纖維素酶相比，用這種方法生產(chǎn)纖維素酶可以使濾紙酶活提高50 150%,特別適合在工業(yè)生產(chǎn)中推廣應用。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。如無特別指明，實施例 中采用的綠色木霉購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏編號為CICC13052。實施例1作為對照例，只采用機械攪拌發(fā)酵罐制備液體纖維素酶。用綠色木霉(CICC13052)在裝液量為35m3的50m3機械攪拌發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)纖 維素酶，攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min，通風為1 0. 5vvm，罐壓為0. 05Mpa。其中發(fā)酵培養(yǎng)基中含有 微晶纖維素3%、玉米漿1%、葡萄糖1%、尿素0. 1%、硫酸銨0. 和磷酸氫二鉀0. 05%。發(fā)酵過程中溫度控制在30°C，發(fā)酵周期為94小時。發(fā)酵每8小時測樣一次，每次放出的發(fā)酵液都要立即測定纖維素酶活力和殘葡萄 糖。結(jié)果表明，使用機械攪拌罐產(chǎn)纖維素酶的濾紙酶活力最高為15.42IU/ml。發(fā)酵終 體積為33m3。實施例2作為對照例，只采用氣升式發(fā)酵罐制備液體纖維素酶。用綠色木霉在裝液量為35m3的50m3氣升式發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，罐面壓差 為0. 04Mpa，通風為0. 8vvm，罐壓為0. 05Mpa。其中發(fā)酵培養(yǎng)基中含有微晶纖維素3%、玉米 漿1%、葡萄糖1%、尿素0. 1%、硫酸銨0. 和磷酸氫二鉀0. 05%。
發(fā)酵過程中溫度控制在30°C，發(fā)酵周期為92小時。發(fā)酵每8小時測樣一次，每次放出的發(fā)酵液都要立即測定纖維素酶活力和殘?zhí)?。結(jié)果表明，使用微晶纖維素濾紙酶活力最高為13. 24IU/ml。發(fā)酵終體積為33m3。實施例3將綠色木霉(菌種保藏編號CICC13052)在裝液量為35m3的50m3機械攪拌發(fā)酵 罐中保溫培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min，通風為1 0. 5vvm，罐壓為0. 05Mpa。其中發(fā)酵培養(yǎng) 基中含有微晶纖維素3%、玉米漿1%、葡萄糖1%、尿素0. 1%、硫酸銨0. 和磷酸氫二鉀 0. 05%。發(fā)酵每4小時測樣一次。當葡萄糖消耗至含量小于0. 01 %，菌絲體重達到0. 8g/100ml后轉(zhuǎn)入氣升式發(fā)酵 罐進行發(fā)酵培養(yǎng)，罐面壓差為0. 04Mpa,通風為0. 8vvm,罐壓為0. 05Mpa。發(fā)酵每8小時測樣 一次，每次放出的發(fā)酵液都要立即測定纖維素酶活力。發(fā)酵過程中溫度控制在30°C，整個發(fā)酵周期為94小時。結(jié)果表明，使用機械攪拌罐和氣升式發(fā)酵罐耦合發(fā)酵，纖維素酶濾紙酶活力最高 為25. 30IU/ml。發(fā)酵終體積為33m3。實施例4將綠色木霉(菌種保藏編號CICC13052)在裝液量為30m3的50m3機械攪拌發(fā)酵 罐中保溫培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)速為220r/min，通風為1 0. 3vvm，罐壓為0. 02Mpa。其中發(fā)酵培養(yǎng) 基中含有微晶纖維素4%、玉米漿2%、葡萄糖2%、尿素0. 2%、硫酸銨0. 和磷酸氫二鉀 0. 05%。發(fā)酵每4小時測樣一次。當葡萄糖消耗至含量小于0. 01 %，菌絲體重達到0. 8g/100ml后轉(zhuǎn)入氣升式發(fā)酵 罐進行發(fā)酵培養(yǎng)，罐面壓差為0. 025Mpa，通風為0. 96vvm，罐壓為0. 04Mpa。發(fā)酵每8小時測樣一次，每次放出的發(fā)酵液都要立即測定纖維素酶活力。發(fā)酵70 小時后流加新鮮培養(yǎng)基。流加的培養(yǎng)基中成分為微晶纖維素5%、玉米漿2%、豆粕粉1%、 硫酸銨0. 5%、磷酸氫二鉀0. 2%。每次放出的發(fā)酵液都要立即測定纖維素酶活力和殘?zhí)?。發(fā)酵過程中溫度控制在30°C，整個發(fā)酵周期為96小時。結(jié)果表明，使用機械攪拌罐和氣升式發(fā)酵罐耦合流加發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，濾紙酶 活力最高為35. 21IU/ml。發(fā)酵終體積為33m3。實施例5將綠色木霉(菌種保藏編號CICC13052)在裝液量為30m3的50m3機械攪拌發(fā)酵 罐中保溫培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)速為260r/min，通風為1 0. 2vvm，罐壓為0. 05Mpa。其中發(fā)酵培養(yǎng) 基中含有微晶纖維素4%、玉米漿2%、葡萄糖2%、尿素0. 2%、硫酸銨0. 和磷酸氫二鉀 0. 05%。發(fā)酵每5小時測樣一次。當葡萄糖消耗至含量小于0. 01 %，菌絲體重達到0. 8g/100ml后轉(zhuǎn)入氣升式發(fā)酵 罐進行發(fā)酵培養(yǎng)，罐面壓差為0. 045Mpa，通風為0. 7vvm，罐壓為0. 06Mpa。發(fā)酵每10小時測樣一次，每次放出的發(fā)酵液都要立即測定纖維素酶活力。發(fā)酵75 小時后流加新鮮培養(yǎng)基。流加的培養(yǎng)基中成分為微晶纖維素5%、玉米漿2%、豆粕粉1%、硫酸銨0. 5%、磷酸氫二鉀0. 2%。每次放出的發(fā)酵液都要立即測定纖維素酶活力和殘?zhí)恰０l(fā)酵過程中溫度控制在30°C，整個發(fā)酵周期為100小時。結(jié)果表明，使用機械攪拌罐和氣升式發(fā)酵罐耦合流加發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，濾紙酶 活力最高為34.253U/ml。發(fā)酵終體積為33m3。
權利要求
一種利用綠色木霉制備纖維素酶的方法，其特征在于，是利用機械攪拌罐和氣升式發(fā)酵罐聯(lián)合培養(yǎng)綠色木霉。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括下述步驟(1)先將綠色木霉接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的機械攪拌罐中，保溫培養(yǎng)；(2)當機械攪拌罐中發(fā)酵液中葡萄糖消耗至含量小于0.01%，且菌絲體重達到 0. 8g/100ml以上，轉(zhuǎn)入氣升式發(fā)酵罐進行發(fā)酵培養(yǎng)，整個發(fā)酵周期為90 100小時。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述機械攪拌罐的攪拌轉(zhuǎn)速為100 260r/min,風量為 1 0. 2 0. 5vvm,罐壓為 0. 02 0. 05Mpa。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述機械攪拌罐的攪拌轉(zhuǎn)速為150 230r/ min,風量為 1 0. 3 0. 4vvm,罐壓為 0. 03Mpa。
5.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述氣升式發(fā)酵罐的罐面壓差為 0. 025 0. 045Mpa,通風為 0. 7 1. Ovvm,罐壓為 0. 04 0. 06Mpa。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述氣升式發(fā)酵罐的罐面壓差為0.04Mpa, 通風為0. 8vvm,罐壓為0. 05Mpa。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中還包括發(fā)酵70 80小時 后流加發(fā)酵培養(yǎng)基。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)和2)之間，還包括步驟1’)培養(yǎng)期 間每隔3 5小時取樣測葡萄糖含量、測菌絲體重、鏡檢；步驟2)之后，還包括步驟2’)培 養(yǎng)期間每隔6 10小時取樣測纖維素酶含量。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟1)之前，還包括以下步驟a)斜面培養(yǎng)在無菌操作條件下，將綠色木霉原種接入PDA試管斜面培養(yǎng)基中，30°C培 養(yǎng)5 7天；b)種子培養(yǎng)在無菌條件下，將斜面菌種接入三角瓶中，置搖瓶機上振蕩28 32°C培 養(yǎng)20 24小時；然后將搖瓶種子轉(zhuǎn)接種子罐繼續(xù)28 32°C培養(yǎng)20 24小時；種子培養(yǎng) 基成分為葡萄糖1 2 %，玉米漿1 2 %、尿素0. 1 0. 2 %、硫酸銨0. 1 0. 2 %，磷酸二 氫鉀0. 1 0.2%，硫酸鎂0. 05 0. ；三角瓶與種子罐培養(yǎng)基成分相同。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述綠色木霉為菌種保藏編號CICC13052 的綠色木霉。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用綠色木霉制備液體纖維素酶的方法。本發(fā)明所述的方法為首先利用機械攪拌罐進行綠色木霉菌絲體的培養(yǎng)，在葡萄糖消耗完畢，菌絲濃度達到標準后轉(zhuǎn)入氣升式發(fā)酵罐進行培養(yǎng)。本發(fā)明所述的方法通過機械攪拌罐和氣升式發(fā)酵罐聯(lián)用，既可以促進綠色木霉菌體細胞生長，同時又避免了發(fā)酵過程中當溶氧不足時提高攪拌轉(zhuǎn)速對菌絲體的剪切力，可以高效率的制備纖維素酶，與只用機械攪拌罐或只用氣升式發(fā)酵罐生產(chǎn)纖維素酶相比，用這種方法生產(chǎn)纖維素酶可以使濾紙酶活提高50～150％，特別適合在工業(yè)生產(chǎn)中推廣應用。
文檔編號C12R1/885GK101875926SQ20091025967
公開日2010年11月3日 申請日期2009年12月22日 優(yōu)先權日2009年12月22日
發(fā)明者尚海濤, 李維理, 李榮杰, 段緒果, 穆曉玲, 符秀迪, 薛培儉 申請人:安徽豐原發(fā)酵技術工程研究有限公司