專利名稱：：一種能夠?qū)崿F(xiàn)同一管內(nèi)密閉檢測(cè)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)管的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種能夠?qū)崿F(xiàn)同一管內(nèi)密閉檢測(cè)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)管。
背景技術(shù)：
：近年來，多種烈性傳染病諸如SARS，禽流感H5N1，豬鏈球菌，甲型流感H1N1等在全世界范圍內(nèi)廣泛流傳，給人類造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)嚴(yán)重威脅人類的生命健康。病原微生物檢測(cè)方法主要有顯微鏡形態(tài)觀察，免疫法檢測(cè)，核酸檢測(cè)等等。核酸檢測(cè)較其他檢測(cè)病原微生物檢測(cè)法具有靈敏度高，特異性好，窗口期短，檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。目前病原微生物核酸檢測(cè)方法主要有聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)，滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RollingCircleAmplification,RCA)，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop—mediatedisothermalAmplification,LAMP)等。目前對(duì)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方式主要有電泳檢測(cè)、熒光檢測(cè)、紫外吸收檢測(cè)等。這些檢測(cè)方法都已作為常規(guī)檢測(cè)方法廣泛用于臨床核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)。其中電泳檢測(cè)和紫外吸收檢測(cè)需要在反應(yīng)結(jié)束后將擴(kuò)增產(chǎn)物取出，有可能造成產(chǎn)物的滯后污染。熒光檢測(cè)目前大都不需要開管進(jìn)行檢測(cè)，但是熒光染料提前加入至擴(kuò)增體系中會(huì)抑制擴(kuò)增反應(yīng)，造成擴(kuò)增效率下降，降低反應(yīng)靈敏度。以上幾種常規(guī)核酸產(chǎn)物檢測(cè)方法均需要擴(kuò)增反應(yīng)儀以外的儀器進(jìn)行檢測(cè)，增加了核酸檢測(cè)病原微生物的成本。雖然核酸檢測(cè)病原微生物技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床，但是以上提到的一些缺點(diǎn)仍然難以根本解決。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種能夠?qū)崿F(xiàn)同一管內(nèi)密閉檢測(cè)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)管。利用該核酸擴(kuò)增反應(yīng)管可實(shí)現(xiàn)不開管，在一管內(nèi)完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，進(jìn)而進(jìn)行熒光檢測(cè)。本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的—種能夠?qū)崿F(xiàn)同一管內(nèi)密閉檢測(cè)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)管，該反應(yīng)管管蓋內(nèi)壁吸附有熒光染料，核酸擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，不需要將管蓋打開，只需將反應(yīng)體系與吸附在管蓋內(nèi)壁的熒光染料混合，即可在激發(fā)光源下檢測(cè)熒光產(chǎn)生情況以實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)。所述的反應(yīng)管，其中熒光染料固定吸附于管蓋內(nèi)壁的吸附性材料上，核酸擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)不與反應(yīng)管底部的核酸擴(kuò)增體系接觸，核酸擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后通過倒置反應(yīng)管使核酸擴(kuò)增產(chǎn)物與熒光染料混合，使熒光染料解吸附并嵌合入核酸擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，在激發(fā)光源下實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測(cè)。所述的反應(yīng)管，其中核酸擴(kuò)增反應(yīng)主要包括聚合酶鏈反應(yīng)、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增。所述的反應(yīng)管，其中熒光染料為SYBRGreen1(SYBRGreen1染料能夠嵌入核酸雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部，并且在激發(fā)光照射下產(chǎn)生熒光)。所述的反應(yīng)管，其中管蓋內(nèi)壁吸附熒光染料的吸附材料為惰性大孔吸附材料。所述的反應(yīng)管，其中惰性大孔吸附材料主要包括纖維素、大孔吸附樹脂、單寧吸附材料、硅膠吸附材料。進(jìn)一步，所述反應(yīng)管的制備和使用的詳細(xì)情況為將惰性大孔吸附材料固定于反應(yīng)管管蓋內(nèi)側(cè)，固定方式采用Araldite高性能快速粘合劑(愛牢達(dá)⑧萬能超強(qiáng)膠)粘合。按照說明書操作，將粘合劑涂布于管蓋內(nèi)側(cè)，將惰性大孔吸附材料置于粘合劑表面，并予以合貼輕壓，粘合時(shí)間8小時(shí)。本發(fā)明所稱的惰性大孔吸附材料可以采用纖維素(如醋酸纖維素，硝酸纖維素，羥丙基甲基纖維素等)、大孔吸附樹脂(如D101大孔吸附樹脂，XDA-1B大孔吸附樹脂，H-60大孔吸附樹脂等)、硅膠吸附材料(如細(xì)孔硅膠，大孔硅膠，B型硅膠和變壓吸附硅膠等)、單寧吸附材料等。進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)前，根據(jù)擴(kuò)增反應(yīng)體積選擇熒光染料SYBRGreenl的量，按照每10iil加入3ii1采用二甲亞砜(DMS0)20倍稀釋的SY服Green1。將反應(yīng)管倒置，使管蓋內(nèi)側(cè)向上。將選取的合適體積的SYBRGreen1點(diǎn)于固定在反應(yīng)管管蓋內(nèi)側(cè)的惰性大孔吸附材料表面，待染料全部吸附進(jìn)入惰性大孔吸附材料內(nèi)部后，即實(shí)現(xiàn)熒光染料的固定。在此反應(yīng)管內(nèi)配制反應(yīng)體系，加入模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，配制反應(yīng)體系過程以及核酸擴(kuò)增過程，不可將反應(yīng)管倒置，避免反應(yīng)體系提前接觸熒光染料。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)管取出冷卻后，倒置反應(yīng)管并輕微震蕩，使反應(yīng)管內(nèi)液體與管蓋內(nèi)側(cè)的惰性大孔吸附材料充分接觸，倒置靜置5分鐘后，正置反應(yīng)管并離心，使管內(nèi)液體全部位于反應(yīng)管底部。此時(shí)，吸附于惰性大孔吸附材料的該熒光染料已經(jīng)進(jìn)入反應(yīng)體系(吸附材料為親水性物質(zhì)，水溶液能夠進(jìn)入其內(nèi)部，熒光染料是極性物質(zhì)，易溶于水溶液中，在解吸附過程，熒光染料能夠溶于進(jìn)入吸附性材料內(nèi)部的水溶液中，在離心的作用下，絕大部分水溶液能夠到達(dá)反應(yīng)管底部，即使有少量水溶液和熒光染料殘留，由于熒光染料過量，并且擴(kuò)增產(chǎn)物很多，仍然能夠達(dá)到熒光檢測(cè)的要求)，核酸擴(kuò)增產(chǎn)物與熒光染料混合，熒光染料嵌合入核酸擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，將此反應(yīng)管置于紫外燈或其他激發(fā)光源下，觀察反應(yīng)管內(nèi)熒光產(chǎn)生情況，即可對(duì)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明有益效果本發(fā)明提供的反應(yīng)管能夠?qū)⒑怂釘U(kuò)增反應(yīng)和熒光檢測(cè)反應(yīng)在同一管內(nèi)偶聯(lián)進(jìn)行，不需要打開反應(yīng)管即可對(duì)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光檢測(cè)，可以在減少操作步驟的同時(shí)最大可能的避免反應(yīng)產(chǎn)物的滯后污染，同時(shí)避免了熒光染料摻入核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系造成核酸擴(kuò)增反應(yīng)的抑制。本發(fā)明以簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)同一管內(nèi)熒光染料與反應(yīng)體系分離，反應(yīng)結(jié)束后只需簡(jiǎn)單的倒置反應(yīng)管使熒光染料與核酸擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合用于熒光檢測(cè)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物，操作簡(jiǎn)單易行，成本低廉，適合用于臨床快速檢測(cè)。圖1:反應(yīng)管示意圖。其中1、反應(yīng)管管蓋；2、惰性大孔吸附材料；3、反應(yīng)管。圖2:管蓋內(nèi)側(cè)俯視圖。具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。實(shí)施例1利用反應(yīng)管進(jìn)行LAMP反應(yīng)檢測(cè)豬流感H1N11、制備結(jié)合圖l，按照Araldite高性能快速粘合劑(愛牢達(dá)《萬能超強(qiáng)膠)說明書操作，將其涂布于反應(yīng)管管蓋1內(nèi)壁，將惰性大孔吸附材料2(如0.45i！m纖維素濾紙)置于粘合劑表面，并予以合貼輕壓，粘合時(shí)間8小時(shí)。進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)前，根據(jù)擴(kuò)增反應(yīng)體積選擇熒光染料SYBRGreenl的量，按照每10iil加入3ii1采用二甲亞砜(DMS0)20倍稀釋的SYBRGreen1。將反應(yīng)管3倒置，使管蓋內(nèi)壁向上。將選取的合適體積的SYBRGreen1點(diǎn)于固定在反應(yīng)管管蓋內(nèi)壁的0.45ym纖維素濾紙表面，待染料全部吸附進(jìn)入纖維素濾紙后，即實(shí)現(xiàn)熒光染料的固定。2、應(yīng)用在此反應(yīng)管內(nèi)配制LAMP反應(yīng)體系，反應(yīng)體系如表1。H1N1LAMP引物SWH1-F3:5'-GGTGCTATAAACACCAGCC-3，SWH1-B3SWHl-LFSWHl-LBSWHl-FIP(Flc+F2)SWHl-BIP(Blc+B2)5，-TGATGGTGATAACCGTACC-3，5'-GGACATTYTCCAATTGTG-3'5'-TTGCCGGTTTCATTGAAGG-3'5'-CTGTRGCCAGTCTCAATTTTGTGttttCTGAAGTYCCATTTCAGAATATACATCCR-3'5'-ATCCCGTCTATTCAATCTAGAGGCttttCTGAAGATCCATCTACCATCCCTGTC-3'Y:t/ll或C;R:g或a。表1:25iiLLAMP反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>LAMP反應(yīng)程序63。C/1.5h—80°C/5min加入模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，配制反應(yīng)體系過程以及核酸擴(kuò)增過程，不可將反應(yīng)管倒置，避免反應(yīng)體系提前接觸熒光染料。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)管取出冷卻后，倒置反應(yīng)管并輕微震蕩，使反應(yīng)管內(nèi)液體與管蓋內(nèi)側(cè)的惰性大孔吸附材料0.45m纖維素濾紙充分接觸，倒置靜置5分鐘后，正置反應(yīng)管并離心，使管內(nèi)液體全部位于反應(yīng)管底部。此時(shí)，吸附于0.45m纖維素濾紙熒光染料已經(jīng)進(jìn)入反應(yīng)體系，將此反應(yīng)管置于紫外燈或其他激發(fā)光源下，觀察反應(yīng)管內(nèi)熒光產(chǎn)生情況，即可對(duì)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)(如產(chǎn)生熒光則待測(cè)樣品含有檢測(cè)病原微生物)。實(shí)施例2利用反應(yīng)管進(jìn)行LAMP反應(yīng)檢測(cè)禽流感H5N11、制備結(jié)合圖l，按照Araldite高性能快速粘合劑(愛牢達(dá)⑧萬能超強(qiáng)膠)說明書操作，將其涂布于反應(yīng)管管蓋1內(nèi)壁，將惰性大孔吸附材料2(如直徑為1毫米的B型硅膠顆粒0.5g)置于粘合劑表面，并予以合貼輕壓，粘合時(shí)間8小時(shí)。進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)前，根據(jù)擴(kuò)增反應(yīng)體積選擇熒光染料SYBRGreenl的量，按照每10iil加入3ii1采用二甲亞砜(DMSO)20倍稀釋的SYBRGreen1。將反應(yīng)管3倒置，使管蓋內(nèi)壁向上。將選取的合適體積的SYBRGreen1點(diǎn)于固定在反應(yīng)管管蓋內(nèi)壁的B型硅膠顆粒表面，待染料全部吸附進(jìn)入B型硅膠顆粒后，即實(shí)現(xiàn)熒光染料的固定。2、應(yīng)用在此反應(yīng)管內(nèi)配制LAMP反應(yīng)體系，反應(yīng)體系如下表2。H5N1LAMP引物F3:5'-TATAGAGGGRGGATGGCA-3'B3:5'CCGTCTTCCATYTTYTTGTT-3'FIP:5'-TCTTTGTCTGCAGCGTAYCCGGATGGGGAATGGTAGATGGTTGG-3，BIP:5'-ATGGAGTCACCAATAAGGTCAACTCATCCCTAAGTTRTTAAATTCCCTTCCAAC-3，Y:t/u或c;R:g或a。表2:12.5iiLLAMP反應(yīng)體系:Buffer1.25"BIP,FIP各2uLB3，F(xiàn)3各0.5"dNTP(2.5mM)2uLBstDNA聚合酶1"H202.75uL礦物油10uLH5N1模板O早LAMP反應(yīng)程序63。C/1.5h—80°C/5min加入模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，配制反應(yīng)體系過程以及核酸擴(kuò)增過程，不可將反應(yīng)管倒置，避免反應(yīng)體系提前接觸熒光染料。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)管取出冷卻后，倒置反應(yīng)管并輕微震蕩，使反應(yīng)管內(nèi)液體與管蓋內(nèi)壁的惰性大孔吸附材料B型硅膠顆粒充分接觸，倒置靜置5分鐘后，正置反應(yīng)管并離心，使管內(nèi)液體全部位于反應(yīng)管底部。此時(shí)，吸附于B型硅膠顆粒的熒光染料已經(jīng)進(jìn)入反應(yīng)體系，將此反應(yīng)管置于紫外燈或其他激發(fā)光源下，觀察反應(yīng)管內(nèi)熒光產(chǎn)生情況，即可對(duì)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)(如產(chǎn)生熒光則待測(cè)樣品含有檢測(cè)病原微生物)。序列表〈110〉華東醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所〈120〉一種能夠?qū)崿F(xiàn)同一管內(nèi)密閉檢測(cè)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)管〈160>10〈210>1〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列6〈220〉〈223〉H1N1LAMP引物F3〈400>1ggtgctataaacaccagcc19〈210>2〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223>H1N1LAMP引物B3<400>2tgatggtgataaccgtacc19〈210>3〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223>H1N1LAMP引物L(fēng)F〈400>3ggacattytccaattgtg18〈210>4〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈220><223>H1N1LAMP引物L(fēng)B〈400>4ttgccggtttcattgaagg19〈210>5〈211>56〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223>H1N1LAMP引物FIP〈400>5ctgtrgccagtctcaattttgtgttttctgaagtyccatttcagaatatacatccr56〈210>6〈211>54〈212〉DNA:0104]〈213>人工序列:0105]〈220〉:0106]〈223>H1N1LAMP引物BIP:0107]〈400>6:0108]atcccgtctattcaatctagaggcttttctgaagatccatctaccatccctgtc54:0109]〈210>7:0110]〈211>18:O川]〈212>DNA:0112]〈213>人工序列:0113]〈220〉:0114]〈223>H5N1LAMP弓|物F3:0115]〈400>7:0116]tatagagggrggatggca18:0117]〈210>8:0118]〈211>20:0119]〈212>DNA:0120]〈213>人工序列:0121]〈220〉:0122]〈223>H5N1LAMP引物B3:0123]〈400>8:0124]ccgtcttccatyttyttgtt20:0125]〈210>9:0126]〈211>44:0127]〈212>DNA:0128]〈213>人工序列:0129]〈220〉:0130]〈223>H5N1LAMP引物FIP:0131]〈400>9:0132]tctttgtctgcagcgtayccggatggggaatggtagatggttgg44:0133]〈210>10:0134]〈211>54:0135]〈212>DNA:0136]〈213>人工序列:0137]<220>:0138]〈223>H5N1LAMP引物BIP:0139]〈400>10:0140]atggagtcaccaataaggtcaactcatccctaagttrttaaattcccttccaac5權(quán)利要求一種能夠?qū)崿F(xiàn)同一管內(nèi)密閉檢測(cè)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)管，其特征在于該反應(yīng)管管蓋內(nèi)壁吸附有熒光染料，核酸擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，不需要將管蓋打開，只需將反應(yīng)體系與吸附在管蓋內(nèi)壁的熒光染料混合，即可在激發(fā)光源下檢測(cè)熒光產(chǎn)生情況以實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反應(yīng)管，其特征是熒光染料固定吸附于管蓋內(nèi)壁的吸附性材料上，核酸擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)不與反應(yīng)管底部的核酸擴(kuò)增體系接觸，核酸擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后通過倒置反應(yīng)管使核酸擴(kuò)增產(chǎn)物與熒光染料混合，使熒光染料解吸附并嵌合入核酸擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，在激發(fā)光源下實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測(cè)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反應(yīng)管，其特征是核酸擴(kuò)增反應(yīng)主要包括聚合酶鏈反應(yīng)、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反應(yīng)管，其特征是熒光染料為SYBRGreen1。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的反應(yīng)管，其特征是管蓋內(nèi)壁吸附熒光染料的吸附材料為惰性大孔吸附材料。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反應(yīng)管，其特征是惰性大孔吸附材料主要包括纖維素、大孔吸附樹脂、單寧吸附材料、硅膠吸附材料。全文摘要本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種能夠?qū)崿F(xiàn)同一管內(nèi)密閉檢測(cè)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)管。該反應(yīng)管管蓋內(nèi)壁吸附有熒光染料，核酸擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，不需要將管蓋打開，只需將反應(yīng)體系與吸附在管蓋內(nèi)壁的熒光染料混合，即可在激發(fā)光源下檢測(cè)熒光產(chǎn)生情況以實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)。本發(fā)明以簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)同一管內(nèi)熒光染料與核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系分離，反應(yīng)結(jié)束后只需簡(jiǎn)單的倒置反應(yīng)管使熒光染料與核酸擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，不需要打開反應(yīng)管即可對(duì)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單易行，成本低廉，減少操作污染，適合用于臨床快速檢測(cè)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101724553SQ20091026406公開日2010年6月9日申請(qǐng)日期2009年12月29日優(yōu)先權(quán)日2009年12月29日發(fā)明者周國(guó)華,成思佳,梁超申請(qǐng)人:華東醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所