專利名稱：：一株枯草芽孢桿菌及其在生物催化生產(chǎn)煙酸中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，涉及一株枯草芽孢桿菌及其在生物催化生產(chǎn)煙酸中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：煙酸又稱作3-吡啶甲酸、吡啶-3-甲酸、尼可丁酸等，與煙酰胺同屬B族維生素，統(tǒng)稱維生素PP，分子式C6H5N02，耐熱，能升華。該化合物是一種水溶性維生素，為人體必需的13種維生素之一；在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化為煙酰胺，是輔酶I和輔酶II的組成部分，參與體內(nèi)脂質(zhì)代謝，組織呼吸的氧化過(guò)程和糖類無(wú)氧分解過(guò)程?？捎糜诳共谄げ?、作血擴(kuò)張藥、食品飼料的添加劑等；亦可作為醫(yī)藥中間體，用于異煙肼、煙酰胺、尼可剎及煙酸肌醇酯等的生產(chǎn)。煙酸的生產(chǎn)可以分為化學(xué)法和生物法，目前工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用較多的仍然為化學(xué)法。如專利CN1296004A公開(kāi)了以3-甲基吡啶為原料，在裝有催化劑的管式反應(yīng)器中與空氣，水蒸氣進(jìn)行氧化反應(yīng)得到煙酸粗產(chǎn)品，經(jīng)過(guò)精制后可得到純度為99.5%的煙酸。但該方法對(duì)活性催化劑的制備及設(shè)備提出較高要求，操作較繁瑣。德國(guó)底古薩_胡爾斯股份公司的專利CN1247190A中，采用含釩的二氧化鈦載體催化劑，在反應(yīng)器內(nèi)直接氣相氧化制備得煙酸，然后在產(chǎn)率^90X時(shí)于235t:下凝華分離。瑞士隆薩股份公司的專利CN1272321C中中報(bào)道，將氨直接通入3-甲基吡啶催化氧化后含煙酸的粗水溶液中，后將反應(yīng)得到的煙酸銨溶液進(jìn)行噴霧干燥得煙酸。清華紫光公司的專利CN1141288A中報(bào)道了用硫酸與3-甲基吡啶反應(yīng)制得甲基吡啶硫酸鹽，然后用硝酸氧化，最后用堿中和制得煙酸，原料收率為90%左右。昆明理工大學(xué)蔣麗紅等人的專利CN101289420A中公開(kāi)了一種以二氧化硒作為氧化劑，在吡啶溶劑中直接液相氧化3-甲基吡啶合成煙酸的方法，選擇性在98.5%以上，但產(chǎn)品收率只有4050%左右。以上專利中所公開(kāi)的煙酸制備方法均以3-甲基吡啶為起始原料，經(jīng)過(guò)氣相或液相化學(xué)氧化后制得粗煙酸。該化學(xué)氧化過(guò)程必須具備特定的高溫高壓環(huán)境或者采用強(qiáng)酸或強(qiáng)氧化劑處理，反應(yīng)選擇性不高，副產(chǎn)物多，產(chǎn)品的收率不高，在工業(yè)生產(chǎn)中能耗高，環(huán)境污染大。此外，該類反應(yīng)中需采用比較昂貴的催化劑，可再生性差。浙江大學(xué)的呂秀陽(yáng)等人在專利CN101265230A中公開(kāi)了一種在近臨界水介質(zhì)中直接高溫水解3-氰基吡啶為煙酸的方法。該發(fā)明解決了煙酸制備中酸、堿催化水解的污染難題，過(guò)程簡(jiǎn)單，綠色，產(chǎn)物純度高。該技術(shù)的不足之處在于該反應(yīng)同樣需要高溫高壓環(huán)境，對(duì)設(shè)備的安全性能和抗腐蝕性能提出較高要求。同時(shí)，近臨界水介質(zhì)中的化學(xué)反應(yīng)目前尚處于研究探索階段，離大工業(yè)化生產(chǎn)仍有相當(dāng)大的距離。綜上所言，化學(xué)氧化水解法或在近臨界水介質(zhì)中的水解法制煙酸皆存在諸多不足。相對(duì)而言，生物催化法具有底物選擇性高，反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。此外，生物催化劑易放大制備，成本低，適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用，為煙酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一條行之有效的新路徑。而生物催化法的關(guān)鍵就在于找到酶活高、穩(wěn)定性好、適應(yīng)性強(qiáng)的菌種。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一株新的枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)。本發(fā)明的另一目的是提供該細(xì)菌在生物催化生產(chǎn)煙酸中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案是—株枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNo.3242，保藏日期2009年8月19日。枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)具有以下微生物學(xué)特征1.形態(tài)學(xué)特征在固體平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)48小時(shí)后出現(xiàn)圓形光滑的單菌落，灰白色，不透明，邊緣光滑，表面濕潤(rùn)，整個(gè)菌落凸起，易挑??；鏡檢成桿狀，大小長(zhǎng)為(0.50.8um)X(1.52.5um)，芽孢中生。2.培養(yǎng)學(xué)特征本菌株在以下3種培養(yǎng)基中3(TC下培養(yǎng)48小時(shí)后的培養(yǎng)特征見(jiàn)表1。表1.枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)在3種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征培養(yǎng)基名稱菌落顏色及形狀營(yíng)養(yǎng)瓊脂菌落凸起，表面濕潤(rùn)，邊緣光滑，不透明，呈乳白色至灰白色，無(wú)可溶性色素營(yíng)養(yǎng)肉湯生長(zhǎng)旺盛，灰黃色，渾濁蛋白胨査氏瓊脂菌落平坦而厚，表面濕潤(rùn)，邊緣光滑，不透明，灰黃色，無(wú)可溶性色素3.生理生化特征(見(jiàn)表2)表2.草芽孢桿菌KR2(CGMCCN0.3242)生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注表中"+"表示陽(yáng)性，"-"表示陰性?？莶菅挎邨U菌KR2(CGMCCNO.3242)的培養(yǎng)方法如下(1)種子液制備先進(jìn)行斜面種子制備，將菌種接種到滅過(guò)菌的斜面后在2035t:下培養(yǎng)37天，刮取35環(huán)菌種接種到裝有已滅菌的液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在溫度為2035"，轉(zhuǎn)速為100300rpm下振蕩培養(yǎng)3072小時(shí)，即可作為一級(jí)種子。同樣培養(yǎng)條件下，將一級(jí)種子按310%(%:v/v)的接種量轉(zhuǎn)接到第二批裝有同樣培養(yǎng)基的三角瓶中，同樣條件下培養(yǎng)3072小時(shí)后作為二級(jí)種子。(2)擴(kuò)大培養(yǎng)將二級(jí)種子以310%(%:v/v)的接種量接種到7300L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為裝液量6080%(%:v/v)，通氣量0.11(v/v.min)，罐壓0.020.05MPa，溫度2035。C，轉(zhuǎn)速:100400rpm，發(fā)酵時(shí)間30120小時(shí)。所涉及的培養(yǎng)基成分如下斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖1030，酵母膏210，蛋白胨210，氯化鈉15，磷酸二氫鉀0.53，磷酸氫二鉀0.53，硫酸鎂0.22，瓊脂1520，pH:59?！?jí)、二級(jí)液體種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖1030，酵母膏210，蛋白胨2IO，氯化鈉15，磷酸二氫鉀0.53，磷酸氫二鉀0.53，硫酸鎂0.22，己內(nèi)酰胺0.5IO，異戊腈0.15，氯化鈷550ppm，pH:59。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖1050，酵母膏210，蛋白胨210，氯化鈉15，磷酸二氫鉀0.53，磷酸氫二鉀0.53，硫酸鎂0.22，己內(nèi)酰胺0.510，異戊腈0.15，氯化鈷550ppm，pH:59?？莶菅挎邨U菌KR2(CGMCCNO.3242)在生物催化生產(chǎn)煙酸中的應(yīng)用。所述的枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)在生物催化生產(chǎn)煙酸中應(yīng)用的具體方法是以3-氰基吡啶為底物，以枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)為生物催化劑，于535°C，100300rpm反應(yīng)1596小時(shí)得到煙酸。所述的枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)制備成絮凝細(xì)胞液的形式后參與所述的生物催化反應(yīng)，反應(yīng)體系中絮凝細(xì)胞液的加入量為裝液量的515%(%:v/v)。所述的生物催化反應(yīng)在反應(yīng)釜中進(jìn)行，反應(yīng)釜的裝液體積為5070%(%:v/v)。3-氰基吡啶的起始濃度為裝液量的0.55%(%:g/100mL)，優(yōu)選15%，采用多次間隙補(bǔ)料方式使3-氰基吡啶的最終累積濃度不超過(guò)30%(%:g/100mL)。在溫度為535。C，攪拌轉(zhuǎn)速為100300rpm下催化水解1596小時(shí)。當(dāng)?shù)孜餄舛融呄蛴诹銜r(shí)即可結(jié)束反應(yīng)，過(guò)濾出絮凝菌團(tuán)繼續(xù)套用到下批反應(yīng)釜中去，直到該催化劑活性下降為不到原來(lái)的1/3為止。反應(yīng)結(jié)束后向轉(zhuǎn)化液中重新添加裝液量0.10.5%。(％。g/1000mL)的絮凝劑，攪勻，靜置1030min后過(guò)濾。濾液再離心或采用0.20.5um膜超濾后取濾液濃縮，之后于04t:下冷凍結(jié)晶、308(TC下真空干燥得純度在98%以上的煙酸。其中，絮凝細(xì)胞液的制備方法為將發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵液于25003500rpm下離心10分鐘，棄上清，所得沉淀用去離子水沖洗一遍，25003500rpm下再離心10分鐘，棄上清，得沉淀濕菌體。將濕菌體用去離子水沖洗下來(lái)后攪勻制得細(xì)胞濕重濃度為1200g/L的菌懸液。在535。C，pH59的條件下向菌懸液中添加0.115%。(％。g/1000mL)比例的絮凝齊U，200rpm下攪拌10min制得絮凝細(xì)胞液。添加的絮凝劑可以為殼聚糖，甲殼素，聚谷氨酸，聚丙烯酸，聚丙烯酰胺，聚乙烯亞胺等高分子絮凝劑，優(yōu)選殼聚糖，添加量?jī)?yōu)選為0.55%0(%0:g/1000mL)。本發(fā)明中所涉及的過(guò)濾、濃縮、冷凍結(jié)晶等均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的普通技術(shù)。本發(fā)明的有益效果1、本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)作為3-氰基吡啶生產(chǎn)煙酸的生物催化劑，3-氰基吡啶的收率超過(guò)90%，并且催化性能穩(wěn)定。2、本發(fā)明中采用枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)將3_氰基吡啶催化水解成煙酸，是一種新型煙酸生產(chǎn)方法，所得煙酸的純度在98%以上。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，選擇性好，反應(yīng)條件溫和，能耗低，安全環(huán)保，具有極大的工業(yè)應(yīng)用潛力。3、將濕菌體制成絮凝化細(xì)胞液后參與催化反應(yīng)，后期分離過(guò)程簡(jiǎn)單，易于操作，產(chǎn)品純度高，設(shè)備投資少，有效的提高了分離效率。同時(shí)，絮凝劑的使用有效的保護(hù)了細(xì)胞免受高濃度底物和產(chǎn)物的抑制作用，有利于工業(yè)化放大生產(chǎn)。反應(yīng)后的絮凝菌團(tuán)過(guò)濾后可套用到下一批反應(yīng)中，進(jìn)一步節(jié)約了成本。涉及的生物材料樣品的保藏本發(fā)明所要求保護(hù)的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)KR2保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)為CGMCCNO.3242，保藏日期為2009年8月19日。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1菌種篩選本發(fā)明所涉及的枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)是本公司生物化工研究組成員從受腈類化合物污染達(dá)15年以上的農(nóng)藥廠土壤中篩選得到的，其篩選方法如下從南京第一農(nóng)藥廠污水池不同角度取污泥樣100余批，分批富集培養(yǎng)后進(jìn)行篩選和鑒定稱取10克污泥，加無(wú)菌水50mL，用玻璃珠搖碎后取5mL懸濁液接種到45mL富集培養(yǎng)基中，放置3(TC搖床上，120rpm振蕩培養(yǎng)3天。之后取該培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，取10一6、10—7、10—8的梯度稀釋液涂布到含初篩固體培養(yǎng)基的平板上，置3(TC恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)36天。挑取生長(zhǎng)出的單菌落接種到新的初篩固體培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上。待菌長(zhǎng)出后刮去35環(huán)接種到液體復(fù)篩培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在3(TC搖床上120rpm下振蕩培養(yǎng)3天，取15mL培養(yǎng)液3000rpm下離心10min，倒去上清液后用等體積的生理鹽水沖洗沉淀菌體，繼續(xù)離心得菌體。將所得菌體添加到含1%(%:g/100mL)亞氨基二乙腈的PBS緩沖液中轉(zhuǎn)化2小時(shí)，反應(yīng)體系中菌體濃度為0.5g/L。取5mL轉(zhuǎn)化液3000rpm下離心10min得上清液，HPLC法分析上清液。如果轉(zhuǎn)化液含有亞氨基二乙酸則說(shuō)明該菌對(duì)亞氨基二乙腈具有轉(zhuǎn)化能力，選擇其中亞氨基二乙酸轉(zhuǎn)化率最高的一株，經(jīng)按《簡(jiǎn)明伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版進(jìn)行鑒定為枯草芽孢桿菌。將該株枯草芽孢桿菌命名為KR2，保藏于中國(guó)微生物保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)CGMCCNO.3242，保藏日期為2009年8月19日。本發(fā)明中的枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCN0.3242)能同時(shí)在分別以煙腈、丙烯腈、乳腈、羥基乙腈，亞氨基二乙腈為唯一氮源的固體初篩培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，底物范圍廣，降解腈類化合物能力強(qiáng)，適合用作本發(fā)明中煙酸的生物催化合成。篩選方法中的所述的液體富集培養(yǎng)基、固體初篩培養(yǎng)基、液體復(fù)篩培養(yǎng)基分別如下液體富集培養(yǎng)基(g/100mL):葡萄糖3，酵母膏0.5，蛋白胨0.5，氯化鈉0.1，磷酸二氫鉀0.l，磷酸氫二鉀0.l，硫酸鎂0.05，pH:7。固體初篩培養(yǎng)基(g/100mL):葡萄糖3，亞氨基二乙腈(或丙烯腈、或煙腈、或乳腈、或羥基乙腈)l，氯化鈉0.l，磷酸二氫鉀0.l，磷酸氫二鉀0.l，硫酸鎂0.05，瓊脂2，pH:7。液體復(fù)篩培養(yǎng)基(g/100mL):葡萄糖3，酵母膏0.5，蛋白胨0.5，氯化鈉0.1，磷酸二氫鉀0.l，磷酸氫二鉀0.l，硫酸鎂0.05，尿素0.5，pH:7。實(shí)施例2游離細(xì)胞的制備在無(wú)菌超凈工作臺(tái)內(nèi)用接種環(huán)刮取枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)斜面菌種3環(huán)，接種到一級(jí)液體種子培養(yǎng)基中(葡萄糖15，酵母膏5，蛋白胨5，氯化鈉2，磷酸二氫鉀1，磷酸氫二鉀l，硫酸鎂0.5，己內(nèi)酰胺5，異戊腈1，氯化鈷10卯m，pH:7.0，單位g/U。在溫度為25t:，轉(zhuǎn)速為150rpm下振蕩培養(yǎng)48小時(shí)即可得一級(jí)枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)種子液，將該一級(jí)種子液按照10%的接種量轉(zhuǎn)接到裝有同樣成分已滅菌的培養(yǎng)基中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，48小時(shí)后可得枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)二級(jí)種子液。將枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)二級(jí)種子液按照10%的接種量接種到35L已滅菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，(葡萄糖30，酵母膏10，蛋白胨10，氯化鈉2，磷酸二氫鉀l，磷酸氫二鉀l，硫酸鎂0.5，異戊腈1，己內(nèi)酰胺5，氯化鈷10卯m，pH:7，單位g/L)，發(fā)酵罐體積為50L，采用通空氣與攪拌聯(lián)用的方式控制溶氧不低于10%，通氣量0.2v/v.min，罐壓0.03MPa，溫度25。C，起始轉(zhuǎn)速100rpm，發(fā)酵過(guò)程中根據(jù)發(fā)酵液的溶氧水平自動(dòng)調(diào)節(jié)，最大轉(zhuǎn)速不超過(guò)400rpm，發(fā)酵72小時(shí)后即可制得枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)細(xì)胞發(fā)酵液。實(shí)施例3酶活測(cè)定本實(shí)施例采用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)CGMCCNO.3242的發(fā)酵液進(jìn)行酶活的測(cè)定。酶活的定義在25t:下，lmL發(fā)酵液與1微克3-氰基吡啶催化反應(yīng)1小時(shí)后生成的煙酸的微克數(shù)，該微克數(shù)即為總酶活力單位數(shù)。煙酸采用液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)參數(shù)為色譜柱CLC-ODS柱，150mmX6.OmmI.D;流動(dòng)相乙腈/水/庚烷磺酸鈉/三乙胺(50/450/0.8g/2ml)(pH3);流速1.2mL/min;柱溫室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)UV268nm。在本發(fā)明條件下，每毫升發(fā)酵液中生物量最高可達(dá)47mg濕菌體，總酶活最高可達(dá)1050U。實(shí)施例4絮凝細(xì)胞液的制備取3L枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)發(fā)酵液3000rpm離心10min得沉淀菌體，用3L去離子水沖洗一遍后繼續(xù)3000rpm離心10min，棄上清得沉淀濕菌體?？莶菅挎邨U菌KR2(CGMCCNO.3242)沉淀濕菌體稱重后用去離子水將其沖洗下來(lái)制得濃度為35g/L的菌懸液。30。C下調(diào)菌懸液pH為7，向菌懸液中添加2。；(％。:g/1000mL)比例的殼聚糖，200rpm下磁力攪拌10min即可制得枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)的絮凝細(xì)胞液。實(shí)施例5煙酸的制備在50L反應(yīng)釜中，先添加30L去離子水，調(diào)pH到7.0，溫度為3(TC。向反應(yīng)釜中添加3L制備好的絮凝細(xì)胞液，150rpm下攪拌均勻，加入0.6kg3-氰基吡啶。其余3-氰基吡啶采取間隙補(bǔ)加的方式添加進(jìn)反應(yīng)釜中，每隔10小時(shí)補(bǔ)加一次，每次補(bǔ)加0.6kg，最終底物添加量共3kg，反應(yīng)40小時(shí)后檢測(cè)到反應(yīng)液中3-氰基吡啶含量基本為零，終止反應(yīng)。向催化反應(yīng)結(jié)束后的釜中添加裝液量1%。(％。g/1000mL)的殼聚糖，攪拌10min后靜置半小時(shí)后下料。將反應(yīng)液放出后壓濾，所得菌團(tuán)繼續(xù)套用到下批反應(yīng)中。濾液再經(jīng)0.45um膜超濾后進(jìn)行濃縮，4t:下冷凍結(jié)晶，得到純度為98.3%的煙酸3.287kg，收率達(dá)91.1%。實(shí)施例6其他反應(yīng)條件保持與實(shí)施例4一致，僅改變催化劑的加入量。將催化反應(yīng)過(guò)程中絮凝菌團(tuán)的添加量由3L調(diào)整為4.5L，其他反應(yīng)條件及底物最終添加量等均與實(shí)施例4保持一致。反應(yīng)36小時(shí)后檢測(cè)到反應(yīng)液中3-氰基吡啶的濃度接近于零，結(jié)束反應(yīng)后最終得到純度為98.8%的煙酸3.405kg，收率達(dá)94.8%。實(shí)施例7其他反應(yīng)條件保持與實(shí)施例4一致，僅改變底物的添加量。將每次補(bǔ)加3-氰基吡啶0.6kg調(diào)整為1.2kg，分5次補(bǔ)加，每次之間間隔10小時(shí)，最終底物累積添加量為6kg。反應(yīng)50小時(shí)后檢測(cè)到反應(yīng)液中3-氰基吡啶的濃度接近于零，結(jié)束反應(yīng)后最終得到純度為99.1%的煙酸6.506kg，收率達(dá)90.9%。實(shí)施例8其他反應(yīng)條件保持與實(shí)施例4一致，僅改變催化反應(yīng)溫度。將攪拌釜中反應(yīng)液的溫度由實(shí)施例4中的3(TC調(diào)整為l(TC，其余條件不變。反應(yīng)48小時(shí)后檢測(cè)到反應(yīng)液中3-氰基吡啶的濃度為基本為零，結(jié)束反應(yīng)后最終得到純度為98.3%的煙酸3.378kg，收率達(dá)93.6%。實(shí)施例9本實(shí)施例主要考查枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)的遺傳穩(wěn)定性。將4。C冰箱中保藏的該枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)放置3(TC恒溫培養(yǎng)箱中活化20分鐘后取出接種到新鮮的斜面培養(yǎng)基中，之后放置3(TC恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天，待斜面上長(zhǎng)出新的劃線菌落后即為該枯草芽孢桿菌的子一代，命名為KR2-1;之后以KR2-1為出發(fā)菌種，以同樣的方式進(jìn)行接種傳代，培養(yǎng)出新劃線菌落后命名為子二代KR2-2;再以KR2-2為出發(fā)菌種，以同樣的方式轉(zhuǎn)接新斜面培養(yǎng)基，得子三代KR2-3。以此方式連續(xù)傳代30次，分別得到KR2-4、KR2-5......KR2-30。斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖15，酵母膏5，蛋白胨2，氯化鈉l，磷酸二氫鉀0.5，磷酸氫二鉀0.5，硫酸鎂0.5，瓊脂20，pH:7。挑選以上傳代培養(yǎng)中所得到KR2-10、KR2-20、KR2-30三株子代，以原始KR2(CGMCCN0.3242)為對(duì)照，同時(shí)進(jìn)行一級(jí)液體種子、二級(jí)液體種子的制備，操作方法和培養(yǎng)基均與實(shí)施例1中相同。之后進(jìn)行游離細(xì)胞的制備，將所得的二級(jí)液體種子以10%的接種量接種到裝有已滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，每500mL容量的搖瓶最終裝液量為100mL，接完種之后放置溫度為25t:的恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)3天，轉(zhuǎn)速為150rpm。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基與實(shí)施例1中相同。將以上所得的液體發(fā)酵液于3000rpm下冷凍離心10分鐘，棄上清液后用等體積的生理鹽水沖洗沉淀菌體一遍后繼續(xù)離心10分鐘等菌體，轉(zhuǎn)速不變。將所得的沉淀菌體用pH為7的磷酸鹽緩沖液制成35g/L的菌懸液后進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。轉(zhuǎn)化試驗(yàn)在恒溫?fù)u床上進(jìn)行，轉(zhuǎn)化液置于搖瓶?jī)?nèi)，每500mL搖瓶最終裝轉(zhuǎn)化液的體積為100mL。底物煙腈的濃度為4%(X:g/100mL)，菌懸液的添加量為5%，轉(zhuǎn)化溫度為25°C，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，轉(zhuǎn)化時(shí)間為10分鐘。轉(zhuǎn)化結(jié)束后添加5mol/L的鹽酸中止酶活，之后將轉(zhuǎn)化液3000rpm離心10分鐘后取上清液檢測(cè)。KR2、KR2-10、KR2-20、KR2-30四株菌所對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)化液中煙酸的濃度分別為3.51%、3.43%、3.42%、3.36%(%:g/100mL)。以上結(jié)果可見(jiàn)，該枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)在傳代30次后仍然保持著與親代KR2菌幾乎相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化率，具有很好的遺傳穩(wěn)定性。實(shí)施例10本實(shí)施例主要進(jìn)行絮凝細(xì)胞套用的考察，其游離細(xì)胞的制備、絮凝細(xì)胞的制備、煙酸的制備方法都分別與實(shí)施例1、實(shí)施例3和實(shí)施例4保持一致。不同之處在于將第一批轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后的絮凝細(xì)胞菌團(tuán)過(guò)濾出來(lái)，用等量的去離子水沖洗兩遍，過(guò)濾后向絮凝細(xì)胞團(tuán)中添加去離子水，使絮凝細(xì)胞混合液的體積達(dá)到3L，將此3L絮凝細(xì)胞液套用到下一批轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中繼續(xù)反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后以同樣的方式繼續(xù)制備相同體積的絮凝細(xì)胞液，再連續(xù)套用6次。其中轉(zhuǎn)化液中底物煙腈的添加量與添加方式均與實(shí)施例4中相同，最終數(shù)據(jù)如表3所示。結(jié)果顯示，該絮凝細(xì)胞在循環(huán)套用到第4次時(shí)煙酸的收率和純度都出現(xiàn)明顯下降。套用3次時(shí)煙酸的收率達(dá)到91.3%，純度仍然保持在98%以上。因此，本專利中所述的絮凝細(xì)胞菌團(tuán)以套用3次為佳。表3絮凝細(xì)胞循環(huán)套用后的轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>本實(shí)施例中未涉及部分均與現(xiàn)有技術(shù)相同或可采用現(xiàn)有技術(shù)加以實(shí)現(xiàn)。權(quán)利要求一株枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNo.3242，保藏日期2009年8月19日。2.權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)在生物催化法合成煙酸中的應(yīng)用。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用的具體方法為以3-氰基吡啶為底物，以枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)為生物催化劑，于溫度為535°C，攪拌轉(zhuǎn)速為100300rpm下進(jìn)行催化水合反應(yīng)得到煙酸。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的反應(yīng)體系中底物3-氰基吡啶的起始濃度為0.55%，反應(yīng)過(guò)程中采用間隙補(bǔ)料或流加的方式添加3-氰基吡啶，使3-氰基吡啶的最終累積濃度不超過(guò)30%。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于將所述的枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)的游離細(xì)胞制備成絮凝化細(xì)胞液參與所述的反應(yīng)，反應(yīng)體系中絮凝細(xì)胞液的加入量為515%。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于制備所述的枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)絮凝細(xì)胞液所用的絮凝劑是殼聚糖、甲殼素、聚谷氨酸、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺或聚乙烯亞胺，優(yōu)選殼聚糖，絮凝劑添加量為0.115%。。7.根據(jù)權(quán)利要求3、5或6所述的應(yīng)用，其特征在于所述生物催化反應(yīng)結(jié)束后向轉(zhuǎn)化液中重新添加0.10.5%。的絮凝劑，攪勻后靜置，過(guò)濾出菌團(tuán)，濾液經(jīng)離心或采用0.20.5um膜超濾后濃縮，之后04。C下冷凍結(jié)晶、308(TC下真空干燥得純度在98%以上的煙酸。全文摘要本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，公布了一株枯草芽孢桿菌及其在生物催化生產(chǎn)煙酸中的應(yīng)用。本發(fā)明以3-氰基吡啶為底物，以枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)為生物催化劑，于5～35℃，100～300rpm反應(yīng)15～96小時(shí)得到煙酸，煙酸的最終收率超過(guò)90％，所得煙酸的純度在98％以上。本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，工藝適合規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。文檔編號(hào)C12P17/12GK101709283SQ20091026430公開(kāi)日2010年5月19日申請(qǐng)日期2009年12月18日優(yōu)先權(quán)日2009年12月18日發(fā)明者唐旺全,孔國(guó)平,楊壽海,楊玉林,顧福海申請(qǐng)人:南京第一農(nóng)藥集團(tuán)有限公司