專利名稱:一種體外進(jìn)化β-葡聚糖酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
一種基于易錯PCR技術(shù)對淀粉液化芽孢桿菌源β -葡聚糖酶進(jìn)行體外分子進(jìn)化 提高其熱穩(wěn)定性的方法,屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù):
定向進(jìn)化技術(shù)是由美國工程院院士、加州理工學(xué)院化工系教授Frances H.Arnold
于90年代初期開發(fā)出來的一項蛋白質(zhì)工程技術(shù)。它是基因工程、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和計算機(jī)技 術(shù)互補(bǔ)發(fā)展和滲透的結(jié)果,標(biāo)志著人類可以按照自己的意愿和需要改造蛋白質(zhì)(酶),甚 至設(shè)計出自然界中原本不存在的全新蛋白質(zhì)(酶)。分子定向進(jìn)化技術(shù),簡單地說就是在 實驗室中對達(dá)爾文自然進(jìn)化原理進(jìn)行模擬,從而對目標(biāo)蛋白進(jìn)行改造。隨著分子生物學(xué) 技術(shù)的不斷發(fā)展,特別是PCR和基因重組技術(shù)的應(yīng)用,定向進(jìn)化已從在體內(nèi)轉(zhuǎn)為在體外 進(jìn)行,實驗方法也變得簡便、快速和高效。體外展示技術(shù)等高通量篩選方法的發(fā)展更進(jìn) 一步拓展了體外定向進(jìn)化的應(yīng)用范圍,使原本操作起來耗時耗力或難以進(jìn)行直觀篩選的 蛋白質(zhì)分子也能夠得到改造。作為可以工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的葡聚糖酶,對酶特性的 要求是產(chǎn)酶水平高、耐熱性好、ρΗ穩(wěn)定、培養(yǎng)條件簡單等,其中耐熱性和產(chǎn)酶水平是酶 工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的主要問題。本發(fā)明基于易錯PCR隨機(jī)突變技術(shù),對葡聚糖酶進(jìn)行了熱穩(wěn)定性定向進(jìn) 化。利用建立的基于96微孔板的高通量篩選模型篩選熱穩(wěn)定性提高的突變株。經(jīng)過三輪 定向進(jìn)化,共篩選得到三株熱穩(wěn)定性明顯提高突變體2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03突變 酶 2-JF-01、2-JF-02 和 2-JF-03 的 T50 值分別比野生酶 53°C提高 2.2V、5.5°C和 3.5°C, 達(dá)至Ij 55.2"C、58.5°C禾口 56.5"C。突變酶 2-JF-01、2-JF-02 和 2-JF-03 在 60°C下的半衰期 t1/2, 60Γ (min)分別比野生酶18提高4、13和17,達(dá)到22、31和35。測序結(jié)果表明,突 變酶2-JF-012-JF-01發(fā)生兩個氨基酸替代(N36S和G 213R),突變酶2-JF-03發(fā)生另外 兩個氨基酸替代(E156V和K 105R),和其他兩個突變體不同的是,2-JF-02—共發(fā)生三 個氨基酸替代(C86R,S115I和N150G)。突變發(fā)生位點見附
圖1和圖2。
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明利用易錯PCR手段建立了 β-葡聚糖酶定向進(jìn)化策略,見附圖3。本發(fā)明的技術(shù)方案(1) β -葡聚糖酶基因的易錯PCR擴(kuò)增在易錯PCR 中以弓 I 物 PAGl-F 5,-ACATCGGATCCATGAAACGAG TGTTGCTAATTCTTG-3‘(劃線區(qū)域為 BamH I 酶切位點)禾口 PAG1-R 5,-GTAGTCA TCTCGAGTTATTTTTTTGTATAGCGCACCCAG-3,(劃線區(qū)域為 Xho I 酶切位點)分別作
為正向和反向引物,以葡聚糖酶基因為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件94°C預(yù)變性3min; 94 °C變性50s,56 °C退火45s,72°C延伸 Imin,30個循環(huán);4°C保溫。
(2)易錯PCR產(chǎn)物的回收純化瓊脂糖凝膠電泳檢測后利用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物,-20°C保存。
(3)易錯PCR產(chǎn)物及質(zhì)粒pET28a⑴的雙酶切。(4)易錯PCR產(chǎn)物及質(zhì)粒pET28a⑴連接構(gòu)建重組質(zhì)粒庫。表1易錯PCR反應(yīng)方案
權(quán)利要求
1. 一種基于易錯PCR技術(shù)對淀粉液化芽孢桿菌源β -葡聚糖酶進(jìn)行體外分子進(jìn)化提 高其熱穩(wěn)定性的方法,其特征步驟為(1)β-葡聚糖酶基因的易錯PCR擴(kuò)增在易錯 PCR 中以引物 PAGI-F 5,-ACATCGGATCCATGAAACGAGTGTTGCTAAT TCTTG-3,(劃線區(qū)域為 BamH I 酶切位點)和 PAGl-R 5,-GTAGTCATCCGATTTTTT TGTATAGCGCACCCAG-3,(劃線區(qū)域為Xho I酶切位點)分別作為正向和反向引物,以β-葡聚糖酶基因為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件94°C預(yù)變性3min; 94°C變性50s,56°C退火45s,72°C延伸lmin, 30個循環(huán);4°C保溫。(2)易錯PCR產(chǎn)物的回收純化瓊脂糖凝膠電泳檢測后利用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物,_20°C保存。(3)易錯PCR產(chǎn)物及質(zhì)粒pET28a(+)的雙酶切。(4)易錯PCR產(chǎn)物及質(zhì)粒pET28a(+)連接構(gòu)建重組質(zhì)粒庫。 表1易錯PCR反應(yīng)方案
全文摘要
定向進(jìn)化技術(shù)是由美國工程院院士、加州理工學(xué)院化工系教授FrancesH.Arnold于90年代初期開發(fā)出來的一項蛋白質(zhì)工程技術(shù)。它是基因工程、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和計算機(jī)技術(shù)互補(bǔ)發(fā)展和滲透的結(jié)果,標(biāo)志著人類可以按照自己的意愿和需要改造蛋白質(zhì)(酶),甚至設(shè)計出自然界中原本不存在的全新蛋白質(zhì)(酶)。作為可以工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的β-葡聚糖酶,對酶特性的要求是產(chǎn)酶水平高、耐熱性好、pH穩(wěn)定、培養(yǎng)條件簡單等,其中耐熱性和產(chǎn)酶水平是酶工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的主要問題。本發(fā)明基于易錯PCR隨機(jī)突變技術(shù),對β-葡聚糖酶進(jìn)行了熱穩(wěn)定性定向進(jìn)化。利用建立的基于96微孔板的高通量篩選模型篩選熱穩(wěn)定性提高的突變株。經(jīng)過三輪定向進(jìn)化,共篩選得到三株熱穩(wěn)定性明顯提高突變體2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03.突變酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的T50值分別比野生酶53℃提高2.2℃、5.5℃和3.5℃,達(dá)到55.2℃、58.5℃和56.5℃。突變酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03在60℃下的半衰期t1/2,60℃(min)分別比野生酶18提高4、13和17,達(dá)到22、31和35。
文檔編號C12R1/19GK102021191SQ20091026484
公開日2011年4月20日 申請日期2009年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者劉春鳳, 李崎, 李永仙, 秦久福, 鄭飛云, 顧國賢 申請人:江南大學(xué)