專利名稱：富硒紅球藻粉的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及富硒紅球藻制品，更具體涉及一種富硒紅球藻的生產(chǎn)方法，該制品富
含具有抗氧化、抗衰老、抗病毒等特性的有機硒化合物。本發(fā)明還涉及一種富硒紅球藻制品在食品、各類保健品和藥品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
硒(selenium, Se)是人體及動物生長發(fā)育所必須的微量元素，是1817年由瑞典化學(xué)家Berzelius發(fā)現(xiàn)并命名。在20世紀(jì)40年代前，硒_直被認(rèn)為是一種有毒致癌物質(zhì)。直到1957年Schwarz和Foltz發(fā)現(xiàn)硒是有效預(yù)防肝壞死的第三因素，從而證實了硒是動物及人體必需的營養(yǎng)元素，硒在營養(yǎng)學(xué)方面的意義得到重視。1973年美國Robruck等確定硒是谷胱甘肽氧化酶(GPX)的輔助因子，它和維生素E—道能防止不飽和脂肪酸氧化生成有害的氧化物。這種抗氧化特性具有清除生物機體內(nèi)自由基的作用。如果缺硒，機體內(nèi)的某些代謝過程就會受阻，致使大量自由基積累而引發(fā)各種疾病。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，硒還具有增強機體免疫力、保護(hù)心血管、抗腫瘤、抗衰老、調(diào)節(jié)代謝等功能。 雨生紅球藻屬于綠藻門、綠藻綱、團(tuán)藻目、紅球藻科、紅球藻屬，是一種單細(xì)胞真核生物。其藻細(xì)胞能大量累積蝦青素。天然蝦青素具有特殊的分子結(jié)構(gòu)，體外實驗發(fā)現(xiàn)它是單線態(tài)氧的強大淬滅劑，具有清除氧自由基的強大能力，是一種極有效的抗氧化劑。在雨生紅球藻活細(xì)胞內(nèi)，它作為光保護(hù)劑和強抗氧化劑，能夠淬滅由強光和過度氧化產(chǎn)生的多種活性氧，防止活性氧對細(xì)胞的傷害。天然蝦青素比角黃素(canthaxanthin) 、 P-胡蘿卜素(13-carotene)和玉米黃素(zeaxanthin)能更有效地阻止不飽和脂肪酸甲酯的過度氧化，其抗氧化活性是維生素E的550倍，被譽為"超級抗氧化劑"。 富硒雨生紅球藻除了含有豐富的營養(yǎng)組分和天然蝦青素外，還具有大量的硒蛋白，由于硒蛋白的抗氧化機制與天然蝦青素存在區(qū)別，所以當(dāng)兩者結(jié)合后的生物學(xué)活性具有協(xié)同效應(yīng)，這就是本發(fā)明制備富硒紅球藻的理論基礎(chǔ)。由于硒的缺乏常常會導(dǎo)致動物及人體產(chǎn)生各種疾病(如克山病、大骨節(jié)病等)，而普通食物中硒含量較低，通過一定途徑補充硒是非常必要的。由于無機硒具有毒性且細(xì)胞吸收緩慢，通過食用富硒紅球藻中的有機硒是最好的補硒途徑之一。另一方面，紅球藻中含有的天然蝦青素也是人體及動物所必須且體內(nèi)不能合成，必須從食物中攝取，因此富硒雨生紅球藻在食品、保健品和藥品制備中具有重要的應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種富硒紅球藻的制備方法，該方法制得的富硒雨生紅球藻有機硒含量達(dá)到99%以上，與其藻細(xì)胞累積的天然蝦青素協(xié)同作用，是富硒紅球藻具有超強的抗氧化特性。 本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種富硒紅球藻產(chǎn)品在食品、保健品和藥品中的應(yīng)用。由于有機硒和紅球藻中的天然蝦青素是許多食品、保健品和藥品中的有效成分，他們最大的特點是易被氧化，而紅球藻作為載體具有保護(hù)作用，能在常溫條件下加入到食品、保健品和藥品中，通過人體和動物的消化系統(tǒng)吸收利用。
為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施
—種富硒紅球藻粉的制備方法，其步驟是 A、篩選硒耐受性強、硒蛋白和蝦青素含量高、生長快速的雨生紅球藻新品系由于雨生紅球藻是一種具有鞭毛的單細(xì)胞真核藻類，其對無機硒的耐受性較弱。 一般的藻種只能在含有較低濃度亞硒酸鹽的培養(yǎng)基中生長，生產(chǎn)出的富硒紅球藻產(chǎn)品的含硒量較低。本發(fā)明利用理化誘變和分子生物學(xué)育種技術(shù)，篩選出對無機硒耐受性強、硒蛋白和蝦青素含量高、生長快速的雨生紅球藻新品系。 B、在溫度22-30°C、 pH 6. 5-7. 0、光照1000-3000勒克斯以上，利用紅球藻培養(yǎng)基(如改良的BBM等)進(jìn)行培養(yǎng)2-15天。 C、根據(jù)雨生紅球藻品種對硒耐受性的不同，可以采用接種培養(yǎng)基(如BBM等)中
直接加硒或當(dāng)藻細(xì)胞達(dá)到一定生物量(如進(jìn)入對數(shù)期或平臺期)后加入無機硒的方法，其
培養(yǎng)基中無機硒的濃度可以是低濃度(10-30mg/L)或高濃度(200-500mg/L)。 D、藻細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)12-15天后，通過過濾或離心的方法采收，并用清水或清洗液
沖洗新鮮藻泥，洗去藻細(xì)胞表面的無機硒。利用烘干、噴霧干燥或冷凍干燥等方法獲得富硒
雨生紅球藻藻粉。該發(fā)明制備的富硒雨生紅球藻藻粉硒化合物含量介于10-2000 ii g/g，其
中有機硒含量可達(dá)到99%以上。 —種富硒紅球藻產(chǎn)品在食品、保健品和藥品中的應(yīng)用，可以直接將富硒紅球藻粉直接添加到食品、保健品和藥品中，也可以從富硒紅球藻中提取有機硒化合物和蝦青素，然后加入到食品、保健品和藥品中。本發(fā)明以富含天然蝦青素和各種營養(yǎng)成分的雨生紅球藻作為硒的生物載體，開發(fā)出集有機硒、蝦青素、藻蛋白、藻多糖等于一體的富硒雨生紅球藻，作為食品、保健品或藥品的添加劑?？梢宰鳛樯矬w所必須的硒蛋白來源，也可以與其它含硒組分聯(lián)合使用。在食品、保健品、預(yù)防或治療藥品中可以作為營養(yǎng)補充劑或抗氧化劑或其它功能成分。除了上述應(yīng)用范圍外，本發(fā)明也可用于其他類型的富硒產(chǎn)品(如飲料、面粉、中成藥、化妝品等)。 本發(fā)明的主要特點在于(1)硒蛋白具有預(yù)防癌癥和由R0S引起的疾病的功效，天然蝦青素比能更有效地阻止不飽和脂肪酸甲酯的過度氧化，被譽為"超級抗氧化劑"。盡管兩者有類似的作用效果，但其在生物體內(nèi)的作用機制存在差異，兩者的結(jié)合表現(xiàn)出協(xié)同的生物學(xué)效應(yīng)，這是本發(fā)明的重要創(chuàng)新點之一 ；(2)雨生紅球藻是一類單細(xì)胞真核綠藻，是自然界含天然蝦青素最高的生物類群，已有大量研究表明，雨生紅球藻具有重要的食用、藥用價值，其安全性已得到證明。(3)本發(fā)明采用在培養(yǎng)基中加入無機硒(如亞硒酸鈉等)，藻在生長過程中，細(xì)胞內(nèi)累積大量的硒蛋白，洗脫掉吸附于細(xì)胞表面的無機硒后，富硒雨生紅球藻產(chǎn)品有機硒含量占99%以上，其食用安全性大大提高。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明
實施例1 : 富硒雨生紅球藻的制備方法，其步驟包括
A、篩選無機硒耐受性強、硒蛋白和蝦青素含量高、生長快速的雨生紅球藻新品系。利用野生雨生紅球藻或通過上述途徑獲得的雨生紅球藻新品系。 (1)紫外線誘變是最為常用的物理誘變劑之一。根據(jù)波長將紫外線分為UVA、UVB、 UVC三種，其波長分別為320-400nm、280-320nm、100-280nm，但對誘變有效的范圍僅是200-300nm，其中以260nm左右的效果最好。紫外線的主要作用是使DNA雙鏈之間或同一條鏈上的兩個相鄰的胸腺嘧啶形成二聚體，阻礙雙鏈的分開、復(fù)制和堿基的正常配對，從而引起突變。經(jīng)紫外誘變處理后的藻株要暗處理后，再進(jìn)行光照培養(yǎng)。所述藻株經(jīng)誘變后進(jìn)行暗處理是因為紫外線輻射引起的DNA損傷可由光復(fù)活酶的作用進(jìn)行修復(fù)，使胸腺嘧啶二聚
體解開恢復(fù)原狀。 將20W的紫外燈打開，預(yù)熱20分鐘，使紫外燈發(fā)出的波長處于穩(wěn)定狀態(tài)后，分別取處于對數(shù)生長期藻液6mL，置于小培養(yǎng)皿內(nèi)，在磁力攪拌下，在距離紫外燈30cm處進(jìn)行照射，時間分別為3、4、5分鐘，各重復(fù)3次。 取5mL紫外照射處理后的藻液接種到裝有20mL培養(yǎng)液的50mL小錐形瓶中，遮光3小時以避免光修復(fù)，再重新放回到光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，血球計數(shù)法對藻細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，并計算出致死率，選擇致死率在50% _80%的處理，進(jìn)行雙層平板分離，挑取生長快、體積較大的克隆，接種于25mL小錐形瓶(BBM培養(yǎng)基10mL)中培養(yǎng)。將能夠達(dá)到正常生長狀態(tài)的克隆分別接種至250mL錐形瓶(BBM培養(yǎng)基100mL)中繼續(xù)培養(yǎng)。以野生型為對照，測定并比較不同突變株系的生長速率、硒難受性、蝦青素與硒蛋白含量，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，篩選對無機硒耐受性強、硒蛋白和蝦青素含量高、生長快速的雨生紅球藻突變株，每10天繼代培養(yǎng)一次，共4次，突變株表現(xiàn)特性穩(wěn)定的克隆，即為新的突變株系。
(2)化學(xué)誘變方法?；瘜W(xué)誘變成功與否的關(guān)鍵是采用與誘變對象最適合的化學(xué)誘變劑以及最恰當(dāng)?shù)恼T變技術(shù)。常用的化學(xué)誘變劑有堿基類似物(如5-溴尿嘧啶等)、烷化劑(如甲基甲烷碘酸、氮芥等)、移碼突變劑(如吖啶類試劑)、脫氨劑(如羥胺、亞硫酸鹽等)，其中以烷化劑的誘變效果最好且應(yīng)用最廣泛。烷化劑一般具有一個或多個活性烷基，它們易于取代DNA分子中活潑的氫原子，直接與一個或多個堿基起烷化反應(yīng)，從而改變DNA的分子結(jié)構(gòu)，引起突變。1-甲基_3-硝基-1-亞硝基胍(簡稱亞硝基胍，NTG、 NG或MNNG)是最常用也是最有效的烷基誘變劑，有超級誘變劑之稱，一次處理能使細(xì)胞發(fā)生一次或多次突變。還能使多基因并發(fā)突變，在復(fù)制叉附近一個基因突變能誘發(fā)臨近位置的基因陸續(xù)連鎖突變。 取對數(shù)期藻液4mL， 4000rpm， 25°C ，離心5min，棄上清液，加入pH值6. 5的無菌磷酸鉀緩沖液5mL，洗滌三次，定容，加入NTG溶液，使終濃度分別為1. Og/L和2. Og/L，各3次重復(fù)，于25t:水浴中處理30分鐘，加入等量的硫代硫酸鈉終止反應(yīng)。 處理過的藻液用無菌去離子水洗滌三次，徹底去掉NTG溶液，最后重新接種到BBM培養(yǎng)基中，遮光處理12小時，再于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。稀釋后的雨生紅球藻液采用與紫外線誘變相同的方法進(jìn)行雙層平板分離單克隆、硒難受性等生物學(xué)特性檢測和突變株的篩選。 通過上述兩種誘變方法，篩選得到硒耐受性強、硒蛋白和蝦青素含量高、生長快速的雨生紅球藻新品系。 B、在溫度22-30°C、 pH 6. 5-7. 0、光照1000-3000勒克斯以上，利用紅球藻培養(yǎng)基(如改良的BBM等)進(jìn)行培養(yǎng)2-15天。 C、根據(jù)雨生紅球藻品種對硒耐受性的不同，可以采用接種培養(yǎng)基(如BBM等)中直接加硒或當(dāng)藻細(xì)胞達(dá)到一定生物量(106-109CellS/mL)后加入無機硒的方法，其培養(yǎng)基中無機硒的濃度可以是低濃度(10-30mg/L)或高濃度(200-500mg/L)。
D、藻細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)2-15天后，通過過濾或離心的方法采收，并用清水或清洗液沖洗新鮮藻泥，洗去藻細(xì)胞表面的無機硒。利用烘干、噴霧干燥或冷凍干燥等方法獲得富硒雨生紅球藻藻粉。該方法制備的富硒雨生紅球藻藻粉硒化合物含量介于10-2000 g/g，其中有機硒含量可達(dá)到99%以上。
實施例2 ; —種富硒雨生紅球藻的生產(chǎn)流程包括下面幾個方面內(nèi)容 ①固體或液體保持培養(yǎng)的藻種接種到改良的BBM液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)到對數(shù)期后，進(jìn)行分級(2-3級)擴大培養(yǎng)，以達(dá)到大規(guī)模生產(chǎn)所需要的雨生紅球藻生物量。
②雨生紅球藻在溫度22-30°C、 pH 6. 5-7. 0、光照1000-3000勒克斯以上，利用紅球藻培養(yǎng)基(如BBM等)進(jìn)行培養(yǎng)。其培養(yǎng)基的主要成分包括75mg/L K2HP04，175mg/L KH2P04，250mg/L NaN03，25mg/L NaCl，75mg/L MgS04 7H20， 25mg/LCaCl2. 2H20，3ml/L Fe-EDTA， lml/L A5微量元素[金傳蔭，宋立榮，劉永定等紅球藻水生748株(Haematocococcus sp. HB748)培養(yǎng)基的選擇與對維生素的需求[J]應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，1997,3(2)177-179]。 ③根據(jù)雨生紅球藻不同品系對硒耐受性的不同，采用直接將藻接種在加無機硒的BBM培養(yǎng)基或采用當(dāng)藻細(xì)胞達(dá)到一定生物量(如106-109cells/mL)后加入無機硒到BBM培養(yǎng)基中的方法，其BBM培養(yǎng)基中無機硒的濃度可以是低濃度(10-30mg/L)或高濃度(200-500mg/L)。藻細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)12-15天后，通過過濾或離心的方法采收，并用清水或清洗液沖洗新鮮藻泥，洗去藻細(xì)胞表面的無機硒。 ④利用烘干、噴霧干燥或冷凍干燥等方法獲得富硒雨生紅球藻藻粉，并采用氫化
物原子熒光光譜法測定硒含量。 實施例3 :富硒雨生紅球藻在食品中的應(yīng)用 按實施例2方法制備的富硒雨生紅球藻粉，經(jīng)過納米粉碎機粉碎后，加入制作面包、面條、飲料的面粉或奶粉、咖啡等中，根據(jù)藻粉硒蛋白的含量確定食品中添加富硒雨生紅球藻粉的比例(1-50% )，經(jīng)混合均勻后，按面包、面條、飲料等食品的常規(guī)加工方法制得含富硒雨生紅球藻的食品。 實施例4 :富硒紅球藻在保健品中的應(yīng)用 按實施例2方法制備的富硒雨生紅球藻粉，經(jīng)過納米粉碎機粉碎，在粉碎后的富
硒雨生紅球藻粉中加入纖維素等片劑輔料(藻粉輔料=1 : 3)，利用傳統(tǒng)方法混合壓縮
成片劑或利用傳統(tǒng)的軟硬膠囊制備方法做成富硒雨生紅球藻膠囊。制得的片劑和膠囊具有
抗氧化、抗衰老等保健作用。 實施例5 :富硒紅球藻在藥品中的應(yīng)用 按實施例2方法制備的富硒雨生紅球藻粉，利用高壓液相色譜、氫化物原子熒光光譜法檢測蝦青素和硒蛋白的含量。藻粉直接用于藥品制備或與其它組分混合后制備藥品，或?qū)⒃宸壑械奈鞍?、蝦青素等有效成分利用傳統(tǒng)方法提取出來后，應(yīng)用于藥品制備。將富硒雨生紅球藻粉中的蝦青素和硒蛋白加入治療黃斑衰退藥物、抗癌藥物、抗衰老藥物、維生素E替代藥物、抗病毒藥物等。
權(quán)利要求
一種富硒紅球藻粉的制備方法，其步驟是A、篩選硒耐受性強、硒蛋白和蝦青素含量高、生長快速的雨生紅球藻新品系藻種在紅球藻培養(yǎng)基中生長，利用理化誘變和分子生物學(xué)育種技術(shù)，篩選出對無機硒耐受性強、硒蛋白和蝦青素含量高、生長快速的雨生紅球藻新品系；(1)紫外線誘變?yōu)槲锢碚T變劑之一，根據(jù)波長將紫外線分為UVA、UVB、UVC三種，其波長分別為320-400nm、280-320nm、100-280nm，對誘變有效的范圍是200-300nm，紫外線的作用是使DNA雙鏈之間或同一條鏈上的兩個相鄰的胸腺嘧啶形成二聚體，阻礙雙鏈的分開、復(fù)制和堿基的配對，引起突變；經(jīng)紫外誘變處理后的藻株要暗處理后再進(jìn)光照培養(yǎng)，將20W的紫外燈打開，預(yù)熱20分鐘，紫外燈發(fā)出的波長處于穩(wěn)定后，分別取處于對數(shù)生長期藻液6mL，置于小培養(yǎng)皿內(nèi)，在磁力攪拌下，在距離紫外燈30cm處進(jìn)行照射，時間分別為3、4、5分鐘，各重復(fù)3次；取5mL紫外照射處理后的藻液接種到裝有20mL培養(yǎng)液的50mL小錐形瓶中，遮光3小時以避免光修復(fù)，再重新放回到光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，血球計數(shù)法對藻細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，選擇致死率在50％-80％的處理，進(jìn)行雙層平板分離，挑取生長快、體積的克隆，接種于25mL小錐形瓶中培養(yǎng)，將正常生長狀態(tài)的克隆分別接種至250mL錐形瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，每10天繼代培養(yǎng)一次，共4次，突變株表現(xiàn)特性穩(wěn)定的克隆，并進(jìn)行硒難受性、硒蛋白和蝦青素含量等特性檢測，篩選得到穩(wěn)定的突變株系；(2)化學(xué)誘變方法采用與誘變對象的化學(xué)誘變劑，化學(xué)誘變劑有堿基類似物、烷化劑、移碼突變劑、脫氨劑、羥化劑，烷化劑有一個或活性烷基，它們易于取代DNA分子中活潑的氫原子，直接與一個或堿基起烷化反應(yīng)，改變DNA的分子結(jié)構(gòu)，引起突變，1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍，一次處理使細(xì)胞發(fā)生一次或突變，使基因并發(fā)突變，在復(fù)制叉附近一個基因突變能誘發(fā)臨近位置的基因陸續(xù)連鎖突變；取對數(shù)期藻液4mL，4000rpm，25℃，離心5min，棄上清液，加入pH值6.5的無菌磷酸鉀緩沖液5mL，洗滌三次，定容，加入NTG溶液，使終濃度分別為1.0g/L和2.0g/L，各3次重復(fù)，于25℃水浴中處理30分鐘，加入等量的硫代硫酸鈉終止反應(yīng)；處理過的藻液用無菌去離子水洗滌三次，去掉NTG溶液，最后接種到BBM培養(yǎng)基中，遮光處理12小時，再于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，稀釋后的藻液采用與紫外線誘變相同的方法進(jìn)行雙層平板分離單克隆，進(jìn)行硒難受性、硒蛋白和蝦青素含量等生物學(xué)特性檢測，篩選得到穩(wěn)定的突變株系；B、將篩選得到的目標(biāo)藻株在溫度22-30℃、pH 6.5-7.0、光照1000-3000勒克斯，利用紅球藻培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)2-15天；C、根據(jù)雨生紅球藻品種對硒耐受性的不同，采用接種培養(yǎng)基中直接加硒或當(dāng)藻細(xì)胞達(dá)到生物量后加入無機硒的方法，其培養(yǎng)基中無機硒的濃度是低濃度10-30mg/L或高濃度200-500mg/L；D、藻細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)2-15天后，通過過濾或離心的方法采收，并用清水或清洗液沖洗新鮮藻泥，洗去藻細(xì)胞表面的無機硒，利用烘干、噴霧干燥或冷凍干燥方法獲得富硒雨生紅球藻藻粉。
2. 權(quán)利要求1所述的一種富硒雨生紅球藻藻粉在制備食品中的應(yīng)用。
3. 權(quán)利要求1所述的一種富硒雨生紅球藻藻粉在制備保健品中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的一種富硒雨生紅球藻藻粉在制備藥品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種富硒紅球藻粉的制備方法及應(yīng)用，其步驟A、篩選無機硒耐受性強、硒蛋白和蝦青素含量高、生長快速的雨生紅球藻新品系；B、在一定溫度、pH值、光照下，利用紅球藻培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；C、根據(jù)雨生紅球藻品種對硒耐受性的不同，采用接種培養(yǎng)基中直接加無機硒或當(dāng)藻細(xì)胞達(dá)到一定生物量后加入不同量的無機硒，配制高濃度含硒培養(yǎng)基或低濃度含硒培養(yǎng)基；D、藻細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)后，通過過濾或離心的方法采收，并用清水沖洗新鮮藻泥，洗去藻細(xì)胞表面的無機硒。烘干、噴霧干燥或冷凍干燥獲得富硒雨生紅球藻藻粉。制備的富硒雨生紅球藻藻粉硒化合物含量介于10-2000μg/g，有機硒含量達(dá)到99％以上。富硒紅球藻制品可在制備食品、保健食品和藥品中應(yīng)用。
文檔編號A23L1/337GK101715986SQ20091027287
公開日2010年6月2日 申請日期2009年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月20日
發(fā)明者胡章立, 高彥東 申請人:深圳大學(xué)