專利名稱：用稀有鮈鯽基因表達評價PBDEs類雌激素效應的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及水體環(huán)境的評價，尤其涉及水體環(huán)境污染對水生生物影響的評價。
背景技術：
多溴聯(lián)苯醚(polybrominateddiphenyl ethers, PBDEs)屬于溴系阻燃劑 (brominated flame retardants, BFRs)的一種，由于其阻燃效率高，熱穩(wěn)定性好，添加量 少，對材料性能影響小，價格便宜，因而作為一種添加型阻燃劑被廣泛地應用在電子、電器、 化工交通、建材、紡織、石油、采礦等領域中(Alaee M et al.，2003)。PBDEs親脂性強，化學 性質(zhì)穩(wěn)定，可以隨著食物鏈生物富集和放大。PBDEs在使用和報廢過程中通過蒸發(fā)和滲漏而 進入環(huán)境。另外，焚化含有PBDEs的廢棄物也是PBDEs進入環(huán)境的主要途徑。進入大氣中 的PBDEs會通過大氣干濕沉降作用向水體和土壤中轉(zhuǎn)移。除此之外，阻燃劑生產(chǎn)廠也直接 排放一些PBDEs。已在空氣、水、土壤、灰塵和沉積物的多種環(huán)境介質(zhì)、以及水生動物和海鳥 體內(nèi)檢測出PBDEs。自PBDEs使用以來，環(huán)境中PBDEs的水平在不斷升高，已有的實驗研究 發(fā)現(xiàn)PBDEs可能具有肝臟毒性、內(nèi)分泌干擾作用、神經(jīng)發(fā)育毒性及生殖毒性，其對人類健康 造成潛在威脅將越來越大。最近的研究證實，這類溴化物會干擾甲狀腺激素，妨礙人類和動 物腦部與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育。鑒于PBDEs對生物可能產(chǎn)生的負面效應，有關PBDEs的 污染監(jiān)控及其生態(tài)環(huán)境安全評價及生物學效應已成為當今科學研究的前沿和熱點(Zhouet al. ,2002 ；Ueno et al.，2004)。類雌激素效應是指一些與雌激素作用類似，作用于靶器官 而產(chǎn)生的生理改變或結(jié)構(gòu)變化，特別是發(fā)生一些雌性化現(xiàn)象，例如精細胞變少，精卵成熟所 需時間變長等等，目前研究一般通過卵黃蛋白原來評價生物受環(huán)境毒物類雌激素效應的程 度(Li et al.，2005)，還未見用魚類評估PBDEs類雌激素效應的報道。芳香化酶是細胞色素P450家族中重要的一員，在激素代謝過程中起著重要的作 用，是生物體體內(nèi)進行雄激素轉(zhuǎn)化為雌性激素的重要催化酶，對于動物性腺發(fā)育和性別分 化有著決定性的作用。研究表明，在大多數(shù)哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的芳香化酶基因都是由CYP19 基因編碼的。研究還發(fā)現(xiàn)斑馬魚(Danio rerio)和虹鱒(Oncorhynchus mykiss)等均具有 2種以上的芳香化酶，分別為性腺型P450aromA和腦型P450aromB，經(jīng)試驗證實這2種分子 的存在形式和活性都存在著明顯的差異(Kishida et al.，2001 ；Dalla et al.，2002)。半 定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應是近年來常用的一種簡捷、特異的定量RNA測定方法，通過mRNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進行PCR擴增，并測定PCR產(chǎn)物的數(shù)量，可以推測樣品中特異mRNA的相對 數(shù)量。稀有鉤鯽(Gobiocyprisrarus Ye et Fu)屬鯉科(Cyprinidae)丹亞科 (Danioninae)鯽屬(Gobiocypris)，分布于四川省漢源縣、彭州市等地，是我國特有的一種 小型魚類，已經(jīng)在一些生物學研究和環(huán)境生物學研究中得到廣泛應用。稀有鉤鯽與國際實 驗動物委員會推薦的國外常用的斑馬魚、青鏘、黑頭軟口鰷等實驗魚類有許多相似之處，因 此，它可能成為我國的一種實驗魚類。稀有鉤鯽作為一種新的實驗動物具有以下優(yōu)點(1) 成體全長38-85mm，飼養(yǎng)方便；(2)在飼養(yǎng)條件下，孵出后3個月部分個體性腺成熟，4個月
4左右即可產(chǎn)卵繁殖；(3)稀有鉤鯽在14°C -30°C間可自然產(chǎn)卵，在實驗室的控溫條件下，一 年四季均可繁殖，卵、苗的獲取不受季節(jié)限制；(4))稀有鉤鯽屬連續(xù)產(chǎn)卵類型的魚類，同一 尾魚相隔4天左右就能產(chǎn)卵一次，每次產(chǎn)卵數(shù)百粒，短期內(nèi)可獲得同一親本的大量后代； (5)卵粘性，卵膜徑1. 25-1. 70mm，較斑馬魚、青鏘卵大，卵膜透明，可清楚地觀察胚胎發(fā)育， 也便于核移植等實驗操作；(6)胚胎發(fā)育溫度適應范圍廣，在13°C -30°C胚胎發(fā)育正常，可 通過控制溫度來控制發(fā)育速度；(7)對溫度、二氧化碳、溶氧的耐受能力強。有文獻比較研 究了環(huán)境雌激素EE2對斑馬魚和稀有鉤鯽的影響，指出稀有鉤鯽可能比斑馬魚更敏感，同 時指出稀有鉤鯽在評價雌激素污染時可作為一種理想的實驗模型(鐘雪萍等2005 ；廖濤等 2005)。作為推薦的受試生物，稀有鉤鯽已被列入行業(yè)標準《國家環(huán)境保護局合格實驗室準 則(1996)》、《水和廢水監(jiān)測分析方法》(第四版)，最近，中國環(huán)境科學出版社出版的《化學 品測試方法》也將稀有鉤鯽列為推薦的供試生物。到目前還未發(fā)現(xiàn)利用稀有鉤鯽以及CYP19 基因作為評價溴系阻燃劑(PBDEs)類雌激素效應的方法的公開報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種用稀有鉤鯽基因表達評價PBDEs類雌激素效應的方 法。該方法通過檢測養(yǎng)殖在不同劑量PBDEs水體中稀有鉤鯽腦組織和性腺組織CYP19b基 因的表達量，說明水體中PBDEs的含量越高，雌激素效應也越明顯，從而得到PBDEs類雌激 素效應的評價方法。為了達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案用稀有鉤鯽基因表達評價PBDEs類雌激素效應的方法，該方法包含如下步驟a、設立清水養(yǎng)魚池，以及多個PBDEs濃度不同的養(yǎng)魚池；b、將孵化2-3天的稀有鉤鯽魚苗分別放入各個養(yǎng)魚池中飼養(yǎng)3-5個月；c、從稀有鉤鯽樣本中提取腦組織總RNA ；
d、將腦組織總RNA反轉(zhuǎn)錄為腦組織cDNA ；e、加入腦組織cDNA 3-5倍體積的水作為反應模板，進行RT-PCR擴增；RT-PCR 擴增引物采用 F GCCATCCTGGTGACCCTGTT, R GGGCTGCCATAGACTCCCAT,得到 的產(chǎn)物為腦組織CYP19b基因的RT-PCR擴增產(chǎn)物。f、在步驟 e 中 RT-PCR 擴增弓丨物采用 F TATCCTATTGAGCACGGTATTG, R CCTGTTGGCTTTGGGATTC，得到的產(chǎn)物為腦組織3 -actin基因的RT-PCR擴增產(chǎn)物。g、將腦組織CYP19b基因的RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳、染色，在紫外燈下拍攝電泳圖， 用圖像處理軟件得到電泳圖條帶的灰度值；腦組織CYP19b基因RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳圖的 灰度值表示CYP19b基因在稀有鉤鯽腦組織中的表達量。h、在步驟g中腦組織CYP19b基因采用腦組織0-actin基因，得到0-actin基因 在稀有鉤鯽腦組織中的表達量。i、從稀有鉤鯽樣本中提取性腺組織總RNA，按照步驟d、e和步驟g的方法，其中的 腦組織采用性腺組織，即可得到CYP19b基因在稀有鉤鯽性腺組織中的表達量。j、步驟i中的CYP19b基因采用0-actin基因，得到0-actin基因在稀有鉤鯽性 腺組織中的表達量。k、在各個PBDEs濃度不同的養(yǎng)魚池中分別選取數(shù)量相同的稀有鉤鯽樣本，按照步
5驟c、d、f、h和步驟j的方法，對每一條稀有鉤鯽調(diào)節(jié)步驟e中加入腦組織cDNA的水量，使 得所有稀有鉤鯽的日-actin基因在腦組織中擴增的電泳條帶灰度值相同，即所有稀有鉤 鯽樣本腦組織cDNA濃度一致，以此為依據(jù)確定每條稀有鉤鯽在步驟e中加入其腦組織cDNA 的水量。1、加入每一條稀有鉤鯽腦組織cDNA的水量以步驟k為準，再按照步驟c、d、e和步 驟g的方法，得到每條稀有鉤鯽CYP19b基因在腦組織中的表達量。m、對步驟k中的稀有鉤鯽樣本，按照步驟j的方法，對每一條稀有鉤鯽調(diào)節(jié)步驟e 中加入性腺組織cDNA的水量，使得所有稀有鉤鯽的0 -actin基因在性腺組織中擴增的電 泳條帶灰度值相同，即所有稀有鉤鯽樣本性腺組織cDNA濃度一致，以此為依據(jù)確定每條稀 有鉤鯽在步驟e中加入其性腺組織cDNA的水量。n、加入每一條稀有鉤鯽性腺組織cDNA的水量以步驟m為準，再按照步驟i的方 法，得到每條稀有鉤鯽CYP19b基因在性腺組織中的表達量。0、水體中PBDEs含量越高，用其養(yǎng)殖的稀有鉤鯽在腦組織和性腺組織中的CYP19b 基因RT-PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖條帶灰度值越高，表明類雌激素效應也越明顯；稀有鉤鯽在 腦組織和性腺組織中的CYP19b基因RT-PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖條帶灰度值越高，表明用其 養(yǎng)殖的水體中PBDEs的含量越高。本發(fā)明的優(yōu)點是該方法通過檢測養(yǎng)殖在不同劑量PBDEs水體中稀有鉤鯽腦組織 和性腺組織CYP19b基因的表達量，說明水體中PBDEs的含量越高，類雌激素效應也越明顯， 給出了 PBDEs類雌激素效應的評價方法。


圖la為各類稀有鉤鯽在腦組織中的CYP19b基因RT-PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖條帶， 從左到右分別為對照、第一、第二、第三樣本類在腦組織中的CYP19b基因擴增產(chǎn)物的電泳 圖條帶。圖lb為各類稀有鉤鯽在性腺組織中的CYP19b基因RT-PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖條 帶。從左到右分別為對照、第一樣、第二、第三樣本類在性腺組織中的CYP19b基因擴增產(chǎn)物 的電泳圖條帶。圖2為各類稀有鉤鯽CYP19b基因RT-PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖條帶用ImageJ 1. 42 圖像處理軟件分析得到的條帶灰度值。
具體實施例方式1、設立四個相同環(huán)境的養(yǎng)魚池，在第一養(yǎng)魚池中放入多溴聯(lián)苯醚 (polybrominated diphenyl ethers，簡稱PBDEs)濃度為lppb的水，稱為第一樣品池，在第 二養(yǎng)魚池中放入PBDEs濃度為lOppb的水，稱為第二樣品池，在第三養(yǎng)魚池中放入PBDEs濃 度為lOOppb的水，稱為第三樣品池，在第四養(yǎng)魚池中放入不添加任何藥物的清水，稱為對 照組樣品池；2、將孵化2-3天的稀有鉤鯽魚苗分別放入四個養(yǎng)魚池中，在相同的養(yǎng)殖條件下飼 養(yǎng)；3、飼養(yǎng)3-5個月，從四個養(yǎng)魚池中分別撈出數(shù)量相同的稀有鉤鯽，一般為30-200條；4、所有在第一樣品池撈出的稀有鉤鯽稱為第一樣本類，所有在第二樣品池撈出的 稀有鉤鯽稱為第二樣本類，所有在第三樣品池撈出的稀有鉤鯽稱為第三樣本類，所有在第 四樣品池撈出的稀有鉤鯽稱為對照樣本類；5、每個樣本類設置4個該樣本類的RT-PCR擴增產(chǎn)物放置管；稀有鉤鯽CYP19b基因的表達包含下列步驟1、從稀有鉤鯽樣本中提取腦組織總RNA ；2、將腦組織總RNA，用Invitrogen公司的產(chǎn)品lx反應緩沖液4微升，DTT 2微升， dNTP 1微升，200U RevertidTM H-MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶1微升，以及腦組織總RNA 3微升，2iimol/ L隨機引物NNNNNC，N = A/T/G/C 1微升，水8微升；25°C保溫10分鐘，42°C反應1小時，將 總RNA反轉(zhuǎn)錄為腦組織cDNA ；3、加入腦組織cDNA 3-5倍體積的水作為反應模板，用Invitrogen公司的產(chǎn)品lx PCR 緩沖液 1. 5 微升，0. 2iimol/L RT-PCR 擴增引物 0. 6 微升，200 ii mol/L dNTPs 1 微升， 0. 5U Taq DNA聚合酶0. 2微升，以及cDNA反應模板2微升，水14. 7微升進行RT-PCR擴增， 擴增程序預變性94°C 3分鐘；重復擴增30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94°C變性30秒，55°C退 火30秒，72°C延伸40秒；72 °C終延伸5分鐘；RT-PCR 擴增引物采用 F GCCATCCTGGTGACCCTGTT, R GGGCTGCCATAGACTCCCAT,得到 的產(chǎn)物為腦組織CYP19b基因的RT-PCR擴增產(chǎn)物。4、在步驟 3 中 RT-PCR 擴增弓丨物采用 F TATCCTATTGAGCACGGTATTG, R CCTGTTGGCTTTGGGATTC，得到的產(chǎn)物為腦組織3 -actin基因的RT-PCR擴增產(chǎn)物。5、將腦組織CYP19b基因的RT-PCR擴增產(chǎn)物用1 %瓊脂糖電泳，再用溴化乙錠染 色，在紫外燈下拍攝兩個RT-PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖，用ImageJ 1.42圖像處理軟件得到電 泳圖條帶的灰度值；腦組織CYP19b基因RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳圖的灰度值表示CYP19b基因 在稀有鉤鯽腦組織中的表達量。6、在步驟5中腦組織CYP19b基因采用腦組織0-actin基因，得到0-actin基因 在稀有鉤鯽腦組織中的表達量。7、從稀有鉤鯽樣本中提取性腺組織總RNA，按照步驟2、3和步驟5的方法，其中的 腦組織采用性腺組織，即可得到CYP19b基因在稀有鉤鯽性腺組織中的表達量。8、步驟7中的CYP19b基因采用0_actin基因，得到0-actin基因在稀有鉤鯽性 腺組織中的表達量。由步驟1到步驟8可得到一條稀有鉤鯽CYP19b基因和0 -actin基因在腦組織及 在性腺組織中的表達量。9、在第一、第二、第三、第四4個樣本類中分別選取數(shù)量相同的稀有鉤鯽樣本，數(shù) 量為30-200條，按照步驟1、2、4、6和步驟8的方法，對每一條稀有鉤鯽調(diào)節(jié)步驟3中加入 腦組織cDNA的水量，使得所有稀有鉤鯽的0 -actin基因在腦組織中擴增的電泳條帶灰度 值相同，即所有稀有鉤鯽樣本腦組織cDNA濃度一致，以此為依據(jù)確定每條稀有鉤鯽在步驟 3中加入其腦組織cDNA的水量。10、加入每一條稀有鉤鯽腦組織cDNA的水量以步驟9為準，再按照步驟1、2、3和 步驟5的方法，得到每條稀有鉤鯽CYP19b基因在腦組織中的表達量。
11、對步驟9中的稀有鉤鯽樣本，按照步驟8的方法，對每一條稀有鉤鯽調(diào)節(jié)步驟3 中加入性腺組織cDNA的水量，使得所有稀有鉤鯽的0 -actin基因在性腺組織中擴增的電 泳條帶灰度值相同，即所有稀有鉤鯽樣本性腺組織cDNA濃度一致，以此為依據(jù)確定每條稀 有鉤鯽在步驟3中加入其性腺組織cDNA的水量。12、加入每一條稀有鉤鯽性腺組織cDNA的水量以步驟11為準，再按照步驟7的方 法，得到每條稀有鉤鯽CYP19b基因在性腺組織中的表達量。13、水體中PBDEs含量越高，用其養(yǎng)殖的稀有鉤鯽在腦組織和性腺組織中的 CYP19b基因RT-PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖條帶灰度值越高，表明類雌激素效應也越明顯；稀有 鉤鯽在腦組織和性腺組織中的CYP19b基因RT-PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖條帶灰度值越高，表 明用其養(yǎng)殖的水體中PBDEs的含量越高。CYP19b基因在腦組織或性腺組織的表達產(chǎn)物是芳香化酶，芳香化酶是細胞色素 P450家族中重要的一員，在激素代謝過程中起著重要的作用，是生物體體內(nèi)進行雄激素轉(zhuǎn) 化為雌性激素的重要催化酶，對于動物性腺發(fā)育和性別分化有著決定性的作用。CYP19b基 因在腦組織或性腺組織的表達量越大，說明稀有鉤鯽腦組織或性腺組織中芳香化酶的含量 越多，造成雌激素的量越大，PBDEs類雌激素效應也越明顯。圖la為對照樣本類、第一樣本類、第二樣本類、第三樣本類稀有鉤鯽在腦組織中 的CYP19b基因RT-PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖條帶。由圖la可知，第一樣本類、第二樣本類、 第三樣本類稀有鉤鯽在腦組織中的CYP19b基因RT-PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖條帶均比對照 樣本類在腦組織中的CYP19b基因RT-PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖條帶的亮度要高，且第三樣本 類比第二樣本類、第二樣本類比第一樣本類在腦組織中的CYP19b基因RT-PCR擴增產(chǎn)物的 電泳圖條帶的亮度要高，而對照樣本類的樣品是取自用清水養(yǎng)殖的對照組樣品池中的稀有 鉤鯽，第一樣本類的樣品是取自用PBDEs濃度為lppb的養(yǎng)魚池中的稀有鉤鯽，第二樣本類 的樣品是取自用PBDEs濃度為lOppb的養(yǎng)魚池中的稀有鉤鯽，第三樣本類的樣品是取自用 PBDEs濃度為lOOppb的養(yǎng)魚池中的稀有鉤鯽；由此可知，水體中含有PBDEs對魚類的類雌 激素效應是明顯的，且PBDEs含量越高類雌激素效應越明顯。圖lb為對照樣本類、第一樣本類、第二樣本類、第三樣本類稀有鉤鯽在性腺組織 中的CYP19b基因RT-PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖條帶。與圖la類似，由圖lb可以進一步說明 水體中含有PBDEs對魚類的類雌激素效應是明顯的，且PBDEs含量越高類雌激素效應越明顯。圖2為對照樣本類、第一樣本類、第二樣本類、第三樣本類稀有鉤鯽CYP19b基因 RT-PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖條帶用ImageJ 1. 42圖像處理軟件分析得到的條帶灰度值。由圖 2可知，對照樣本類、第一樣本類、第二樣本類、第三樣本類稀有鉤鯽在腦組織中的CYP19b 基因RT-PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖條帶平均灰度值分別為110. 90、156. 63、198. 33,214. 27 ； 對照樣本類、第一樣本類、第二樣本類、第三樣本類稀有鉤鯽在性腺組織中的CYP19b基因 RT-PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖條帶平均灰度值分別為94. 34、133. 18、165. 73、170. 58 ；這些灰 度值將CYP19b基因RT-PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖條帶數(shù)值化，量化地說明了水體中PBDEs含 量增高與稀有鉤鯽CYP19b基因在腦組織和性腺組織中的表達量之間的關系，水體中PBDEs 的含量越高，類雌激素效應也越明顯。
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權(quán)利要求
用稀有鮈鯽基因表達評價PBDEs類雌激素效應的方法，其特征在于，該方法包含下列步驟a、設立4個相同環(huán)境的養(yǎng)魚池，在第一養(yǎng)魚池中放入PBDEs濃度為1ppb的水，在第二養(yǎng)魚池中放入PBDEs濃度為10ppb的水，在第三養(yǎng)魚池中放入PBDEs濃度為100ppb的水，在第四養(yǎng)魚池中放入清水；b、將稀有鮈鯽魚苗分別放入4個養(yǎng)魚池中，在相同條件下飼養(yǎng)3-5個月；c、從稀有鮈鯽樣本中提取腦組織總RNA；d、將腦組織總RNA，用Invitrogen公司的產(chǎn)品1x反應緩沖液4微升，DTT 2微升，dNTP 1微升，200U RevertidTM H-MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶1微升，以及腦組織總RNA 3微升，2μmol/L隨機引物NNNNNC，N＝A/T/G/C 1微升，水8微升；25℃保溫10分鐘，42℃反應1小時，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為腦組織cDNA；e、加入腦組織cDNA 3-5倍體積的水作為反應模板，用Invitrogen公司的產(chǎn)品1x PCR緩沖液1.5微升，0.2μmol/L RT-PCR擴增引物0.6微升，200μmol/L dNTPs 1微升，0.5U Taq DNA聚合酶0.2微升，以及cDNA反應模板2微升，水14.7微升進行RT-PCR擴增，擴增程序預變性94℃3分鐘；重復擴增30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸40秒；72℃終延伸5分鐘；RT-PCR擴增引物采用FGCCATCCTGGTGACCCTGTT，RGGGCTGCCATAGACTCCCAT，得到的產(chǎn)物為腦組織CYP19b基因的RT-PCR擴增產(chǎn)物；f、在步驟e中RT-PCR擴增引物采用FTATCCTATTGAGCACGGTATTG，RCCTGTTGGCTTTGGGATTC，得到的產(chǎn)物為腦組織β-actin基因的RT-PCR擴增產(chǎn)物；g、將腦組織CYP19b基因的RT-PCR擴增產(chǎn)物用1％瓊脂糖電泳，再用溴化乙錠染色，在紫外燈下拍攝兩個RT-PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖，用ImageJ 1.42圖像處理軟件得到電泳圖條帶的灰度值；h、在步驟g中腦組織CYP19b基因采用腦組織β-actin基因，得到β-actin基因在稀有鮈鯽腦組織中的表達量；i、從稀有鮈鯽樣本中提取性腺組織總RNA，按照步驟d、e和步驟g的方法，其中的腦組織采用性腺組織，得到CYP19b基因在稀有鮈鯽性腺組織中的表達量；j、步驟i中的CYP19b基因采用β-actin基因，得到β-actin基因在稀有鮈鯽性腺組織中的表達量；k、在第一、第二、第三、第四4個養(yǎng)魚池中分別選取數(shù)量相同的稀有鮈鯽樣本，按照步驟c、d、f、h和步驟j的方法，對每一條稀有鮈鯽調(diào)節(jié)步驟e中加入腦組織cDNA的水量，使得所有稀有鮈鯽的β-actin基因在腦組織中擴增的電泳條帶灰度值相同，以此確定每條稀有鮈鯽在步驟e中加入其腦組織cDNA的水量；1、加入每一條稀有鮈鯽腦組織cDNA的水量以步驟k為準，再按照步驟c、d、e和步驟g的方法，得到每條稀有鮈鯽CYP19b基因在腦組織中的表達量；m、對步驟k中的稀有鮈鯽樣本，按照步驟j的方法，對每一條稀有鮈鯽調(diào)節(jié)步驟e中加入性腺組織cDNA的水量，使得所有稀有鮈鯽的β-actin基因在性腺組織中擴增的電泳條帶灰度值相同，以此確定每條稀有鮈鯽在步驟e中加入其性腺組織cDNA的水量；n、加入每一條稀有鮈鯽性腺組織cDNA的水量以步驟m為準，再按照步驟i的方法，得到每條稀有鮈鯽CYP19b基因在性腺組織中的表達量；o、水體中PBDEs含量越高，用其養(yǎng)殖的稀有鮈鯽在腦組織和性腺組織中的CYP19b基因RT-PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖條帶灰度值越高，表明類雌激素效應也越明顯；稀有鮈鯽在腦組織和性腺組織中的CYP19b基因RT-PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖條帶灰度值越高，表明用其養(yǎng)殖的水體中PBDEs的含量越高。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用稀有鮈鯽基因表達評價PBDEs類雌激素效應的方法，涉及水體環(huán)境污染對水生生物影響的評價。該方法通過檢測養(yǎng)殖在不同劑量PBDEs水體中稀有鮈鯽腦組織和性腺組織CYP19b基因的表達量，說明水體中PBDEs的含量越高，類雌激素效應也越明顯，從而得到PBDEs類雌激素效應的評價方法。
文檔編號C12Q1/68GK101875969SQ20091027334
公開日2010年11月3日 申請日期2009年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日
發(fā)明者俞小牧, 程磊, 童金茍, 譚新 申請人:中國科學院水生生物研究所